Name: 用于细胞球体批量生产的三维声学装配装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 了解利用三维声学装配装置批量生产细胞球体的方法。该技术无需支架即可高效组装均匀的细胞聚集体，适用于药物筛选和组织工程等生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作受到中国国家重点研发计划（2022YFA1104600）和中国浙江省自然科学基金（LQ23H160011）的资助。

1. 三维声学组装装置的制备
<ol>
	<li>首先通过激光切割制备四块厚度为 1 mm 的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材30，然后将它们粘合在一起，形成一个内宽为 21 mm、高为 10 mm 的方形腔室。</li>
	<li>接着，将另一块厚度为 1 mm 的 PMMA 板材粘接在腔室底部，作为生物墨水的承载基底。</li>
	<li>小心地将三个锆钛酸铅（PZT）换能器（每个尺寸为长 20 mm、宽 10 mm、厚 0.7 mm，主共振频率为 3 MHz，参见材料表）分别粘附在腔室三个正交侧壁的外表面。确保底部 PZT 换能器位于腔室正下方中心位置。</li>
	<li>将导线焊接到每个 PZT 换能器的两个导电区域上。</li>
	<li>最后，将装置固定在一个中空底座上，以防止底部 PZT 与其他台面接触。</li>
</ol>
2. 建立声学组装系统
<ol>
	<li>首先将声学装置安装到显微镜载物台上，以便从顶部观察腔室内部。</li>
	<li>将数字显微镜置于未安装PZT换能器的一侧，以实现对腔室内部的侧向观察。</li>
	<li>将三个PZT换能器的导线分别串联连接至三个功率放大器和函数发生器的三个输出通道（参见材料表）。</li>
	<li>在函数发生器上为每个PZT换能器设置参数，包括正弦波形、频率和振幅等。</li>
	<li>为确保无菌，先用75%酒精充满声学装置的腔室并作用5分钟，随后用无菌PBS溶液彻底清洗；接着在超净工作台中用紫外光照射腔室至少1小时。</li>
</ol>
3. 细胞培养与收获步骤
<ol>
	<li>使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在T25细胞培养瓶中培养人肝细胞癌细胞系C3A细胞（见材料表）。</li>
	<li>当C3A细胞融合度达到约80%时，进行细胞传代：首先，用PBS洗涤培养瓶底部两次。然后，向细胞培养瓶中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C孵育以促进细胞脱落。加入2 mL完全培养基以终止消化过程。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
</ol>
4. 生物墨水的制备
<ol>
	<li>通过将0.3 g GelMA和0.025 g LAP（见材料表）溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制含0.5% (w/v) 二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）的6% (w/v) GelMA溶液。将混合物置于47 °C水浴中静置1小时。</li>
	<li>在与细胞混合前，将GelMA溶液经0.22 µm滤膜（见材料表）过滤以实现灭菌。</li>
	<li>将上述步骤（步骤3.3）中提到的细胞沉淀重悬于细胞培养基中。取少量细胞与0.4%台盼蓝溶液染色，随后使用洁净的血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>根据上述获得的细胞密度计算所需C3A细胞量，并将其与灭菌后的GelMA溶液混合，制备细胞密度为2 × 106 个细胞/mL的生物墨水。</li>
	<li>为便于观察组装后的细胞球体，可预先将C3A细胞与2 µM细胞示踪剂（DiO染料，见材料表）在37 °C孵育20分钟进行染色。随后用新鲜细胞培养基洗涤标记后的细胞三次，再投入使用。</li>
</ol>
5. 使用声学装置组装细胞球体
<ol>
	<li>将超过 1 mL 的生物墨水移液至已灭菌的腔室中。确保液面与腔室底部之间的面对面距离为声波半波长的整数倍。 
	注意：可通过调节加入的生物墨水量来控制该距离。声波波长（λ）可使用公式 λ = c/f 估算，其中 c 表示介质中的声速，f 表示 PZT 换能器的频率。</li>
	<li>开启信号发生器和功率放大器，以启动各个 PZT 换能器的驱动。 
	注意：建议首先单独驱动每个 PZT 换能器，以获得最佳的平行线状细胞图案。可通过在每个 PZT 换能器的主共振频率附近进行步长为 0.001 MHz 的频率扫描来实现。随后，将这些最优信号同时施加到全部三个 PZT 换能器上，以获得预期的三维点状细胞图案。在施加每个输入信号前，需轻轻搅动使细胞在生物墨水中均匀分散。</li>
	<li>使用蓝光（405 nm，60 mW/cm2，30 s）对生物墨水进行交联，形成包裹声学组装细胞聚集体的三维水凝胶支架。随后，关闭信号发生器和功率放大器。</li>
	<li>小心地将三维水凝胶支架从腔室转移至培养皿中，并使用洁净的刀片将其切割成小块（例如 2 mm × 2 mm × 2 mm）。</li>
	<li>加入细胞培养基进行培养。 
	&#8203;注意：请记得每天更换培养基。</li>
</ol>
6. 收集细胞球体
<ol>
	<li>首先使用倒置显微镜观察细胞球在支架不同层面的形成情况。</li>
	<li>培养 3 天后，移除培养基，并用 PBS 将水凝胶支架彻底清洗两次。</li>
	<li>将支架与含有细胞培养基按 1:200 稀释的 GelMA 裂解缓冲液（体积超过 2 mL）在细胞培养箱中孵育 30 分钟，以溶解水凝胶支架。</li>
	<li>将上一步所得溶液转移至离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，获得细胞球沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于新鲜培养基中，用于后续实验操作。</li>
</ol>
7. 类球体活力分析
<ol>
	<li>使用活/死细胞染色试剂盒（见材料表）评估水凝胶支架内或回收的细胞球体的存活率。</li>
	<li>在不同培养时间点，将样品与含1 µL钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和2 µL碘化丙啶（PI）的1 mL PBS溶液于37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>对于水凝胶支架内的样品，直接用PBS洗涤两次；对于回收的球体，于室温下以200 × g离心5分钟，获得球体沉淀，观察前洗涤两次。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察样品并采集荧光图像。</li>
	<li>使用ImageJ计算被Calcein-AM染色的面积占Calcein-AM与PI总染色面积的比例，以确定球体的存活率。</li>
</ol>

Scalable Generation of Uniform Cell Spheroids Using a 3D Acoustic Assembly Device

<ol><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+tumor+application%2C+advantages%2C+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200(2021).</li>
<li>Decarli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spheroids+as+a+versatile+research+platform%3A+formation+mechanisms%2C+high+throughput+production%2C+characterization+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications.</a> Biofabrication. 13 (3), 032002(2021).</li>
<li>Lee, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spheroids+potentiating+cell-cell+and+cell-ECM+interactions+by+self-assembly+of+stem+cell+microlayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer.</a> Biomaterials. 165, 105-120 (2018).</li>
<li>Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+spheroids+as+building+blocks+towards+3d+bioprinting+of+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment.</a> International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444(2021).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. 51, e2720(2011).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+is+3D%3A+boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+drug+screening+based+on+massive+3d+tumor+cultures+using+micropatterned+array+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips.</a> Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).</li>
<li>Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microsystems+for+spheroid+and+organoid+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered microsystems for spheroid and organoid studies.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284(2021).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+multi-cellular+spheroids+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+acoustic+manipulation+of+living+cells+and+organisms+based+On+2D+array%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).</li>
<li>Armstrong, J. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+anisotropic+muscle+tissue+using+acoustic+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning.</a> Advanced Materials. 30 (43), 1802649(2018).</li>
<li>Drinkwater, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+acoustical+tweezers-devices%2C+forces%2C+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications.</a> Applied Physics Letters. 117 (18), 180501(2020).</li>
<li>Bouyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bio-Acoustic+Levitational+%28BAL%29+assembly+method+for+engineering+of+multilayered%2C+3d+brain-like+constructs%2C+using+human+embryonic+stem+cell+derived+neuro-progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors.</a> Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).</li>
<li>Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-assisted+biofabrication+and+bioprinting+of+preferentially+aligned+three-dimensional+cellular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs.</a> Biofabrication. 11 (3), 035015(2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+assembly+of+cell+spheroids+in+disposable+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries.</a> Nanotechnology. 29 (50), 504006(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+hydrogel+arrays+individually+encapsulating+acoustic+formed+multicellular+aggregates+for+high+throughput+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acoustofluidic+focusing+and+separation+of+rare+tumor+cells+using+transparent+lithium+niobate+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+acoustofluidic+fabrication+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids.</a> Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).</li>
<li>Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cell+spheroids+using+Standing+Surface+Acoustic+Wave+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW).</a> International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130(2018).</li>
<li>Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+waves+that+make+the+pattern%3A+a+review+on+acoustic+manipulation+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research.</a> Materials Today Bio. 10, 100110(2021).</li>
<li>Harley, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biofabrication+techniques+towards+functional+bioprinted+heterogeneous+engineered+tissues%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review.</a> Bioprinting. 23, 00147(2021).</li>
<li>Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+applications+of+surface+and+bulk+acoustic+wave+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review.</a> Micromachines (Basel). 14 (1), 43(2022).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+holographic+cell+patterning+in+a+biocompatible+hydrogel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel).</a> Advanced Materials. 32 (4), 1904181(2020).</li>
<li>Miao, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fabrication+of+cell+spheroids+with+3D+acoustic+assembly+devices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733(2023).</li>
<li>Jeger-Madiot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+culture+of+Mesenchymal+Stem+Cell+spheroids+in+acoustic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8355(2021).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+assembly+of+3D+neurospheroids+to+model+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease.</a> Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).</li>
<li>Mei, J., Zhang, N., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+acoustic+wave+devices+on+lithium+niobate%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013(2020).</li>
<li>Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+applications+of+microfluidic+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fabrication and applications of microfluidic devices: a review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011(2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用3D声学组装装置等技术高效、稳定且高通量地制备细胞球体，在推动生物医学工程和药物筛选方面具有广阔前景1,2,3。该方法通过简化的操作流程，实现了细胞球体的大规模生产。
然而，在使用该声学装置时，有一些关键因素需要考虑。形成驻波对于构建三维点阵声场至关重要。在该装置中，每个维度仅有一个PZT换能器，作为声波激发源。因此，在每个维度上，PMMA腔室相对壁面之间或PMMA与水面之间的面对面距离必须为半波长的整数倍。我们所用PZT换能器的主频率为1 MHz，这使得在水或生物墨水中的波长约为500 µm。因此，在水平方向上，声学装置中PMMA腔室两个相对壁面之间的面对面距离被设定为21 mm，该数值已考虑了PZT换能器本身的尺寸。在垂直方向上，底部PMMA壁面与水面之间的面对面距离可通过调节生物墨的体积进行调整，以满足驻波形成的条件。在实验操作过程中，可能需要进行微小的频率调节，以补偿距离上的偏差。此外...

与传统的二维培养模型相比，三维体外（in vitro）培养模型具有更接近体内（in vivo）环境的结构和形态特征，已被公认为在组织工程、疾病建模和药物筛选等多种生物医学应用中具有广阔前景的系统1,2,3。作为一类三维培养模型，细胞球（cell spheroids）通常指细胞聚集形成的三维球状结构，其特征是细胞间以及细胞与基质间的相互作用显著增强4,5,6。因此，构建细胞球已成为开展多种生物学研究的有力工具。
已开发出多种技术用于获得球状体，包括悬滴法7、非黏附培养板8或微孔装置9。原则上，这些方法通常通过利用重力等物理力来促进细胞自组装，同时尽量减少细胞与基底之间的相互作用。然而，这些方法往往操作繁琐、生产效率低，并且在控制球状体尺寸方面存在挑战10,11。重要的是，为满足特定的生物学应用需求，大量制备尺寸合适且均一的球状体至关重要。与上述方法相比，声波作为一种外力驱动技术12,13,14，基于通过外力增强细胞聚集的原理，在高质量、高通量大规模制造细胞球状体方面展现出潜力15,16,17,18。与电磁力或磁力不同，基于声学的细胞操控技术具有非侵入性和无需标记的优点，能够实现生物相容性优异的球状体形成19,20。
通常，基于驻波表面声波（SAWs）和体声波（BAWs）的装置已被开发用于生成球形细胞聚集体，其利用相应驻波声场产生的声节点（ANs）21,22,23。特别是基于BAWs的声学组装装置，因其制造简便、操作容易且具有优异的可扩展性，在构建细胞球体方面受到广泛关注24,25。我们近期开发了一种简便的基于BAWs的声学组装装置，能够高通量地生成细胞球体26。该装置由一个方形聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室构成，腔室在X/Y/Z三个方向上分别安装有锆钛酸铅（PZT）换能器。该结构可形成悬浮声节点（LANs）的三维点阵模式，从而驱动细胞组装。与此前报道的仅能形成一维或二维声节点阵列的BAWs或SAWs装置相比27,28,29，本装置可在明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）溶液中实现三维点阵式LANs，从而快速形成细胞聚集体。随后，在光交联的GelMA支架中培养三天后，细胞聚集体发育为具有高存活率的球形结构。最终，可从GelMA支架中轻松获得大量尺寸均一的细胞球体，用于后续应用。

<table><tbody><tr><td>0.22-&amp;mu;m 滤膜</td><td>Merck</td><td>SLGSM33SS</td><td>用于 GelMA 溶液的灭菌</td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1RHD25</td><td>荧光细胞观察</td></tr><tr><td>DiO 染料</td><td>Beyotime</td><td>C1038</td><td>用于细胞染色的染料</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12430054</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>Rigol</td><td>DG5352</td><td>用于射频信号生成</td></tr><tr><td>GelMA</td><td>Regenovo</td><td>无</td><td>用于制备生物墨水</td></tr><tr><td>GelMA 裂解缓冲液</td><td>EFL</td><td>EFL-GM-LS-001</td><td>用于溶解 GelMA 支架</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td>细胞观察</td></tr><tr><td>LAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>用作光引发剂</td></tr><tr><td>活/死细胞检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C2015M</td><td>细胞活力分析</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010002</td><td>用作缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>防止细胞培养污染</td></tr><tr><td>功率放大器</td><td>Minicircuit</td><td>LCY-22+</td><td>增加射频信号的电压幅度</td></tr><tr><td>PZT 换能器</td><td>烟台兴之文商贸有限公司</td><td>PZT-41</td><td>声学组装装置的功能单元</td></tr><tr><td>T25 细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>细胞解离酶</td></tr></tbody></table>

用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

细胞球是具有前景的三维（3D）模型，在许多生物学领域中已获得广泛应用。本方案介绍了一种利用三维声学组装装置，通过可操控的步骤制备高质量、高通量细胞球的方法。该声学组装装置由三个锆钛酸铅（PZT）换能器组成，分别布置在方形聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室的X/Y/Z平面。当施加三个信号时，该构型能够产生悬浮声学节点（LANs）的三维点阵图案。因此，明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）溶液中的细胞可被驱动至LANs位置，形成三维空间内均匀的细胞聚集体。随后，通过紫外光照射使GelMA溶液发生光交联固化，作为支持细胞聚集体生长的支架。最后，在温和条件下依次溶解GelMA支架，即可获得并回收大量成熟的细胞球。这种新提出的三维声学细胞组装装置将有助于实现细胞球甚至类器官的大规模制备，为生物学领域提供极具潜力的技术手段。

本研究设计了一种用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置。该声学装置包含一个方形腔室，腔室外表面的X平面和Y平面各连接一个PZT换能器，腔室底部还设有一个PZT换能器（图1A、B）。两个信号发生器的三个输出通道分别连接至三个功率放大器，以产生三个独立的正弦信号，驱动PZT换能器（图1C）。
用于驱动安装在腔室X/Y/Z平面上的三个PZT换能器的最佳共振频率分别为3.209 MHz、3.283 MHz和3.215 MHz。三个PZT换能器的最佳振幅均为10峰峰值输出电压（Vpp），由示波器测量得到。图2A展示了利用三维声学组装装置生成细胞聚集体的工作机制。当施加信号时，细胞在声辐射力（ARF）的作用下被驱动至声学节点位置。为观察细胞球体，实验前使用2 µM DiO（绿色荧光）对细胞进行预染色。声学细胞组装完成后，采用共聚焦显微镜观察三维声学组装形成的细胞聚集体。这些细胞聚集...

细胞球体已被视为生物应用领域中一种潜在的模型。本文介绍了一种利用三维声学组装装置可扩展地生成细胞球体的实验方案，该方法能够高效、稳健且快速地制备均一的细胞球体。

细胞球是具有前景的三维（3D）模型，在多个生物学领域中已获得广泛应用。本方案介绍了一种方法……

类器官球等三维和虚拟培养模型已广泛应用于基因工程、延迟建模以及常规筛选等领域。本研究致力于开发一种先进的工程化方法，以制备高质量的类器官球或其他三维和虚拟培养模型，用于多种生物学研究。在本实验方案中，类器官球在JAMA支架内生长，最终通过溶解支架获得，此过程增加了额外的操作步骤。我们将尝试在培养基中利用声波将细胞聚集体进行声学组装，使其无需支架即可在类球体中生长。与磁力组装技术相比，声波能够直接、无需人工干预地组装细胞，且对细胞无潜在毒性作用。此外，我们的实验方案可实现细胞类球体在三维阵列中的组装，显著提高了通量。首先，用75%酒精对声学装置的腔室进行五分钟的消毒，然后用无菌PBS清洗装置，并用紫外光照射一小时。将无菌的声学装置固定在显微镜载物台上，以便从顶部观察腔室内部。将数字显微镜置于未安装PZT换能器的一侧，以实现对腔室内部的侧向观察。将三个PZT换能器的导线分别独立地串联连接至三个功率放大器和函数发生器的三个输出通道。在函数发生器上为每个PZT换能器编程设置参数，包括正弦波形、频率和振幅。在T25细胞培养瓶中，使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养3CA细胞。当细胞融合度达到80%时，用PBS洗涤培养物两次。移除PBS后，向培养瓶中加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育以使细胞脱落。向培养瓶中加入2毫升完全细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 G条件下离心5分钟。为制备生物墨水溶液，将适量C3A细胞悬液与灭菌的GelMA溶液混合。用2微摩尔的细胞示踪剂溶液在37摄氏度下对C3A细胞球进行预染色，持续20分钟。洗涤细胞时，首先通过离心去除上清液，然后加入新鲜的细胞培养基。将至少两毫升的生物墨水加入已灭菌的声学装置腔室中。打开信号发生器和功率放大器，以启动每个PZT换能器的驱动，从而形成三维细胞聚集体阵列。使用蓝光照射生物墨水30秒以交联，形成包埋声学组装细胞聚集体的三维水凝胶支架。随后，小心地将三维水凝胶支架从腔室转移至培养皿中，用洁净的刀片将其切成小块，然后向培养皿中加入细胞培养基。将C3A细胞球体在含有1 µL钙黄绿素AM和2 µL碘化丙啶的1 mL PBS中，于37°C孵育15分钟，分别在不同的培养时间点进行处理。用PBS将包埋在水凝胶支架中的样品冲洗两次。对于回收的细胞球体，以200 ×g离心5分钟，并用PBS洗涤两次。使用荧光显微镜观察类球体并采集图像。细胞聚集体呈规则的三维点阵排列，并显示绿色荧光信号。组装的C3A GelMA聚集体在第3天逐渐融合，形成紧密的类球体，同时类球体直径增大。细胞球在培养的前三天内保持良好的活力，但在培养一周后活力略有下降。释放的细胞球保持了良好的球形形态，尺寸分布均匀，且具有理想的活力和白蛋白表达。

three-dimensional-acoustic-assembly-device-for-mass-manufacturing

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于细胞球体批量生产的三维声学装配装置

我们介绍一种简单、快速地生成类三维组织球体的方法，及其在量化细胞间相互作用差异方面的潜在应用。...

一种简单的悬滴细胞培养法用于生成三维球状体

本文介绍了一种通过细胞聚集快速形成三维细胞球体的灵活实验方案。该方法可轻松适用于多种细胞类型，适用于细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及细胞-基质相互作用的成像与定量分析等多种应用。...

一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。...

基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。...

大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。...

一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。...

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

本文介绍了导电金属墨水的平面和三维打印技术。该方法为在微尺度下以非常规布局制造印刷电子、光电子和生物医学器件提供了新的途径。...

平面与三维导电油墨打印

实体瘤中的间质液流动增强，可调节肿瘤细胞的侵袭。本文介绍一种将间质液流动施加于嵌入基质中的细胞，进而测量其对细胞侵袭影响的技术。该技术可轻松适用于其他系统的相关研究。...

用于测量间质流体流动对肿瘤细胞侵袭影响的三维细胞培养模型

了解利用三维声学装配装置批量生产细胞球体的方法。该技术无需支架即可高效组装均匀的细胞聚集体，适用于药物筛选和组织工程等生物学研究。

用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置

探索更多视频