Name: 聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: 了解聚碳酸酯超速离心管清洗与重复使用方法，用于细胞外囊泡蛋白质组学分析。该方案有效降低实验成本与耗材浪费，同时确保心血管钙化组织研究数据的可靠性。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01HL147095、R01HL141917 和 R01HL136431、Kowa 公司以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No. 101023041（R. Cahalane）的支持。图1 使用 Biorender.com 制作。当前的清洗方案是通过修改国际细胞外囊泡学会（ISEV）2023 年教育日上提出的一种推荐的管道清洗方案而建立的（https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI）。特别感谢多伦多大学附属大学健康网络（加拿大）的 Kathryn Howe 博士和 Sneha Raju 博士提供原始颈动脉组织细胞外囊泡样本。

1. 试管清洗
注意：EV 分离步骤使用带盖和不带盖的聚碳酸酯超速离心管（详见下文）。带盖和不带盖离心管的操作流程相同。对于带盖离心管，盖子部件需单独清洗，并在干燥后、储存前重新组装。
<ol>
	<li>首次使用聚碳酸酯管并取出样品后，立即将超速离心管浸入自来水中，以防止样品在管壁上干燥。</li>
	<li>将管子转移至含0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的自来水中，浸泡10分钟。</li>
	<li>每次处理一根管子，倒出大部分但并非全部SDS溶液，然后使用棉签彻底擦拭管壁上外泌体沉淀所在区域。 
	注意：请勿使用带刷毛的工具。本方案使用普通棉签；但也可选用专用的低絮棉签清洁管子。</li>
	<li>用热水（约50 °C）至少冲洗3次。确保每次均将管子完全注满并彻底倒空。</li>
	<li>使用喷雾瓶或细口洗瓶，用去矿物质水冲洗1次。</li>
	<li>使用喷雾瓶，用70%乙醇冲洗1次。</li>
	<li>将管子倒置晾干。 
	注意：用于流式细胞分选的管架非常适合用于超速离心管的干燥。</li>
	<li>将完全干燥的管子放入洁净的容器中，即可准备重复使用。 
	注意：目前该方案已验证最多可重复使用2次。</li>
</ol>
2. 细胞外囊泡富集
注意：以下细胞外囊泡（EV）分离与蛋白质组学方案既用于原始组织EV的分离，也用于获取空白（从未使用过的）和清洗后离心管样本的&#34;模拟样本&#34;。原始样本来源于接受颈动脉内膜切除术患者的颈动脉斑块中重新悬浮的组织滞留EV。手术标本采集自加拿大多伦多的大学健康网络（University Health Network），并经机构伦理委员会批准。所有患者均按照《赫尔辛基宣言》的要求，签署了样本采集与数据分析的知情同意书。模拟样本则是通过对空白和清洗后的离心管使用与EV分离样本相同的溶液和处理步骤所获得的伪沉淀物。
<ol>
	<li>将EV样本或模拟样本在冰上用PBS解冻。</li>
	<li>配制NTE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，0.137 M NaCl，pH 7.4），并进行无菌过滤。</li>
	<li>在4 °C下以10,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至1 mL开口聚碳酸酯管中。</li>
	<li>在4 °C下以100,000× g 离心上清液1小时。</li>
	<li>用含蛋白酶抑制剂的无菌过滤NTE缓冲液将沉淀重悬于150 µL中。</li>
	<li>转移至1.5 mL微量离心管中，并加入NTE缓冲液使样品总体积达到1.5 mL。</li>
	<li>将样品置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 密度梯度的制备与密度梯度分离
注意：此细胞外囊泡（EV）分离方案此前已由 Blaser 等人描述过9。简要步骤如下：
<ol>
	<li>使用 NTE 缓冲液作为稀释剂，配制五种碘克沙醇密度梯度介质溶液（10%、15%、20%、25% 和 30%）。</li>
	<li>将五种密度溶液依次分层加入带盖的超速离心管中，30% 溶液在底部，10% 溶液在顶部。</li>
	<li>拧紧管盖，并轻柔地将离心管移至稳定水平位置，室温静置 1 小时。</li>
	<li>1 小时后，轻柔地将离心管移至冰上垂直放置 30 分钟，以冷却密度梯度。</li>
	<li>在已制备好的密度梯度管顶部加入 1.5 mL 样品或模拟样品（NTE 缓冲液）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 250,000 × g 超速离心 40 分钟。</li>
	<li>将密度梯度的上层组分（2.4 mL）转移至未加盖的超速离心管中，再用经无菌过滤的 NTE 缓冲液补至 9 mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 100,000 × g 超速离心 1 小时，沉淀细胞外囊泡（EV）。 
	注意：用记号笔标记可见的 EV 沉淀位置或预期位置，以便后续可直接使用棉签清洁该区域。</li>
	<li>吸除上清液，同时将离心管倒置放置 3 分钟。在将离心管恢复正立位置前，用棉签去除残留的液滴。</li>
	<li>用所引用试剂盒中的裂解缓冲液将 EV 沉淀重悬于 12 µL 中。</li>
</ol>
4. 蛋白质组学用肽段的制备
注意：蛋白质组学样品制备按照试剂盒说明书进行，并针对低丰度蛋白质样品进行了实验室内部的修改。修改后的方案如下：
<ol>
	<li>在裂解缓冲液中加热样品至95 °C，持续10分钟，以实现裂解、变性、还原和烷基化。</li>
	<li>使用Lys-C/胰蛋白酶消化液在37 °C下对样品进行消化，反应时间为2小时；每份反应使用10 µL样品中的裂解液和10 µL消化液。</li>
	<li>通过柱纯化肽段，先用试剂盒溶液洗去亲水性和疏水性杂质，再洗脱出纯化的肽段。</li>
	<li>在45 °C下使用真空浓缩仪干燥纯化的肽段，持续45分钟或直至完全干燥。 
	注意：避免肽段过度干燥。</li>
	<li>将样品在-80 °C下保存，直至进行质谱测序。</li>
	<li>向干燥的肽段中加入17 µL LC上样溶液。</li>
	<li>将样品置于冰上静置1小时。</li>
	<li>短暂涡旋混匀样品，然后在超声水浴中进行超声处理5分钟。</li>
	<li>将LC上样样品在16,000 × g 下离心1分钟，从上清中吸取15 µL，转移至新的离心管中。</li>
</ol>
5. 液相色谱串联质谱测序
<ol>
	<li>将 2 µL LC-上样肽溶液注入质谱仪中。</li>
	<li>使用双柱系统对肽段进行分级分离。</li>
	<li>将色谱柱在 45 ˚C 恒温条件下加热。</li>
	<li>以 300 nL/min 的流速运行分析梯度，溶剂 B（乙腈/0.1% 甲酸）从 5% 升至 21%，持续 60 分钟，随后在 10 分钟内升至 30%，再进行 10 分钟 95%-5% 的锯齿式清洗。</li>
	<li>设置 MS1 分辨率为 120 K（最大注入时间 25 ms），在 3.0 s 的循环时间内对前体离子进行 HCD 隔离（隔离宽度 1.2 m/z），启用动态排除（60 s），并将 MS2 分辨率设为 60 K（最大注入时间自动；归一化碰撞能量分别为 24%、26% 和 28%）。</li>
	<li>将 MS1 和 MS2 的采集范围分别设置为 400 m/z–1,200 m/z 和 120 m/z–1,200 m/z。</li>
</ol>
6. 肽/蛋白质鉴定
<ol>
	<li>使用商业搜索算法，针对人类uniProt数据库，通过蛋白质组学搜索软件对获得的肽段质谱数据进行搜索&#160;。</li>
	<li>将消化酶设为胰蛋白酶，并允许最多两次漏切。</li>
	<li>将前体离子质量容差设为10 ppm，碎片离子质量容差窗口设为0.02 Da。</li>
	<li>将甲硫氨酸氧化和N端乙酰化设为可变修饰，半胱氨酸的羧氨甲基化设为固定修饰。</li>
	<li>根据Percolator算法计算的1.0%错误发现率（FDR）阈值对肽段进行筛选。</li>
	<li>仅将分配给某一特定蛋白质组且未在任何其他蛋白质组中检测到的肽段视为唯一肽段，并用于后续分析。</li>
	<li>每种蛋白质的分析中至少包含两条唯一肽段。</li>
	<li>通过前体离子检测最大化鉴定数量。</li>
	<li>进行色谱对齐，最大保留时间漂移为10分钟，质量容差为10 ppm，信噪比最小值为5。</li>
	<li>通过总肽段含量对肽段丰度进行归一化。</li>
</ol>

Efficient Recycling of Polycarbonate Ultracentrifuge Tubes for Proteomics

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
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<li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li>
<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
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<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
<li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermcidin%3A+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li>
<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
<li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
<li>Gläser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+protein+psoriasin+%28S100A7%29+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li>
<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述并验证了一种用于细胞外囊泡（EV）富集及蛋白质组学应用的聚碳酸酯超速离心管清洁方案。我们证明，与经清洁处理的空白假沉淀物相比，该方案可成功去除超速离心管中前一样品残留的蛋白质，残留蛋白水平低于本质谱检测方法的检测限；同时显示了从未使用过的空白超速离心管与经清洁处理的超速离心管假沉淀物在蛋白质组学上的相似性。
首先，为防止蛋白质意外吸附到超速离心管（UC管）的聚碳酸酯内壁上，应立即将UC管浸入H2O10中。制造商建议手洗聚碳酸酯UC管11。其他清洁剂（如Lipsol）应谨慎使用，因其为专有实验室清洁剂，由清洁剂、表面活性剂和螯合剂混合而成，且pH值非中性。因此，在本步骤中使用了适用于质谱分析的清洁剂0.1% SDS，并且清洗时间不超过10分钟11。根据我们的经验，若操作不慎，使用刷毛类清洁工具可能导致管壁划伤。为减少可能形成残留蛋白质储库的划痕，我们采用棉签擦拭聚碳酸酯管内壁，重点清洁细胞外囊泡（EV）沉淀形成区域。反复高温高压灭菌会缩短聚碳酸酯管的使用寿命11；因此，改用三次短暂的热水冲洗。还需注意，尽管制造商建议采用非热力灭菌方法，但并未明确指出应避免的具体温度。再次使用前，应始终按照制造商建议检查管体是否存在变形或裂纹。由于易燃物质不建议在运行中的离心机附近使用，因此在最后一次70%乙醇冲洗后，我们将管子过夜晾干。
通过手动评估色谱图，未观察到明显的聚合物污染。SDS 预计不会降解聚碳酸酯，短时间接触热水（&#60;60 °C）无影响，而长时间接触则会产生影响12。此外，先前的研究表明，基于我们的乙腈梯度，聚碳酸酯类物质的洗脱时间早于样品收集时间点13。尽管我们无法完全确定聚合物不存在，但根据我们的采集方法，可以确信蛋白质组未受到实质性影响。
在重复使用实验耗材进行无标记蛋白质组学实验时，必须特别考虑前次使用留下的残留蛋白质污染物。此外，细胞外囊泡（EV）蛋白质组学研究通常使用产量极低的样本，有时起始蛋白量低于&#60;100 ng。此类蛋白起始量适用于质谱分析，但会显著放大即使微量残留蛋白对整体蛋白质组的影响。鉴于质谱测序技术的灵敏度不断提高，来自人为操作和制造过程的污染物将被检测到。在本方案中，我们显示经过清洗后，鉴定出的蛋白质数量减少了98%。残留的蛋白质几乎完全在从未使用过的空白管与清洗后的管之间共享。这些结果表明，所鉴定出的蛋白质来源于蛋白质组学制备过程本身的污染物或管材制造过程中的残留成分，而非前次使用的残留。在空白管和清洗管中，丰度远高于其他蛋白的前三种蛋白均为人角蛋白I型（KRT1、KRT10、KRT9），这类蛋白存在于毛发和皮肤中，通常被公认为此类实验中的操作来源污染物（https://www.thegpm.org/crap/）。在18种共有的蛋白质中，有9种为其他类型的角蛋白。另一种公认的常见人源污染物是皮肤抗菌肽（dermcidin, DCD），该蛋白存在于人类汗液中14。其他鉴定出的蛋白质也存在于表皮（CSTA15, HRNR16, FLG217）或此前已在尘螨中被鉴定（S100A7、S100A8、S100A9）18,19。需要注意的是，&#34;尘埃&#34;的重要组成部分是人类脱落的皮肤屑20。在清洗后的管中鉴定出的两种特有蛋白虽曾被报道与EV相关，但其丰度远低于其他已知的EV蛋白1,21。样品中鉴定出的蛋白质谱与制备过程一致，并显示出空白管与清洗管之间高度重叠，支持耗材的重复使用。
细胞外囊泡（EVs）在生物过程中发挥着重要作用，包括但不限于细胞间通讯以及生物矿化形成。EVs 广泛存在于人体内，由于其在（病理）生理学信息、生物标志物和治疗应用方面的潜力，已成为基础科学中迅速发展的研究领域。利用差速超速离心法（differential UC）富集这些颗粒进行实验时，需要使用特制的聚碳酸酯离心管。这类热塑性塑料为一次性使用，用后即弃，不仅增加了实验耗材成本，也加重了全球塑料污染负担。本文提出并验证了一种用于清洗和重复使用聚碳酸酯超速离心管的方案，该方案适用于满足蛋白质组学实验要求的EV分离。最终，该方法将减少EV研究实验室产生的废弃物，并降低相关实验的成本。

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的脂质双层包被颗粒，携带具有生物活性的物质（如蛋白质），参与多种生物学过程，包括细胞间通讯和生物矿化形成1。这些颗粒存在于所有体液和组织中，其生物学功能与应用是当前快速发展的科学研究领域。由于细胞外囊泡体积微小，且在生物学特性上与其他颗粒（如脂质体和蛋白质聚集体）高度相似，对其进行分离和鉴定面临诸多挑战。目前，国际细胞外囊泡学会发布的《细胞外囊泡研究最低信息标准2018》（MISEV2018）被公认为细胞外囊泡科学研究的权威标准2。
根据上游来源和下游应用的不同，通常需要联合使用多种方法进行细胞外囊泡（EV）的分离。截至2015年，EV最常用的初级分离方法是差速超速离心法（UC）。2原则上，初始较低速度的离心可分离&#160;较大的或密度较高的杂质成分（如细胞和细胞碎片）被去除，使细胞外囊泡（EVs）保留在上清液中。随后，超速离心（UC）利用极高的离心力将EVs沉淀下来，从而将其与其他较小或密度较低的颗粒分离并实现纯化，但这些沉淀物中可能仍含有密度较高的非EV颗粒。大多数实验方案通常会在某个步骤中采用UC方法从体液中分离EVs。3此外，超速离心（UC）还用于其他细胞外囊泡（EV）分离方法中，例如密度梯度超速离心（DGUC），该方法使用Optiprep等介质TM 碘海醇和离心力根据细胞外囊泡的浮力密度进行分离4. 其他EV分离方法也存在3.
鉴于目前对细胞外囊泡（EVs）所调控的生物学过程及其作为生物标志物和病理生理学信息载体的潜力的认识正在迅速发展，基于发现的研究分析方法（如蛋白质组学）已逐渐受到重视5,6,7,8。EVs体积较小，且根据来源不同，其蛋白产量较低（&#60;1 μg），与完整组织或细胞裂解液相比尤为如此。为进行蛋白质组学分析而分离EVs时，需特别注意多个因素，例如去除上游液体或组织中的非EV蛋白污染物，考虑EV蛋白在分离过程中的降解问题，以及采用能够生成在化学性质上与肽段制备和质谱分析相兼容的蛋白溶液的方法。
实验室耗材通常为一次性塑料制品。这类一次性材料加剧了全球塑料污染问题，并增加了耗材成本。超速离心管（UC管）通常由特殊的聚碳酸酯或聚苯乙烯制成，能够承受实验室应用中沉淀细胞外囊泡（EVs）所需的高离心力。尽管可以对UC管进行灭菌和消毒以重复使用，但在蛋白质组学分析中，尤其是针对EVs等低蛋白产量的样品，必须格外注意。除了必须充分去除前次使用残留的蛋白质外，还需考虑与质谱分析的化学兼容性以及塑料来源的聚合物污染问题。
本文介绍了一种使用适用于质谱分析的洗涤剂清洗聚碳酸酯离心管的方案，并通过实验验证了该方法可成功去除残留蛋白质至检测限以下，且无明显聚合物污染物残留。为验证该清洗方案在差速离心（UC）和密度梯度离心（DGUC）条件下用于细胞外囊泡（EV）蛋白质组学研究的适用性，我们获取了采用UC与DGUC联合方案从人血管组织EV中分离所得的离心管样品。将使用所述清洗方案处理后的离心管与未经使用的新管以及未加样品的清洗后离心管进行平行实验对比。最终，建立适用于EV富集的UC离心管清洗方案将有助于减少EV实验室产生的耗材浪费，并降低相关实验的成本。

<table><tbody><tr><td>10 mL 开口厚壁聚碳酸酯管</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355630</td><td>未加盖超速离心管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10.4 mL 带盖组件的聚碳酸酯瓶</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355603</td><td>带盖超速离心管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱，75 &amp;micro;m × 70 mm；以及 EASY-Spray HPLC 色谱柱，75 &amp;micro;m × 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 和 ES902</td><td>双色谱柱系统</td></tr><tr><td>Critical Swab 棉签，棉质头部</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td>棉签</td></tr><tr><td>配备 EASY-Spray 源的 Exploris 480 质谱仪，与 Easy-nLC1200 HPLC 泵联用&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>人类 UniProt 数据库（101043 条目，2022 年 1 月更新）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>人类数据库</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td>水</td></tr><tr><td>PreOmics iST 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>商业化蛋白质样品制备试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer &amp;nbsp;软件包（PD，版本 2.5）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>蛋白质组学搜索软件</td></tr><tr><td>SEQUEST-HT 搜索算法&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>搜索算法</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（20%）</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-230</td><td>去垢剂</td></tr></tbody></table>

聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

一次性实验室塑料制品加剧了污染危机，并推高了耗材成本。在细胞外囊泡（EV）分离过程中，需使用聚碳酸酯超速离心管以承受相应的高离心力。EV 蛋白质组学是一个快速发展的领域，但目前尚缺乏针对这些离心管的经验证的重复使用方案。对于低蛋白得率的分离流程及后续蛋白质组学分析而言，耗材的重复使用必须确保试剂与质谱检测的兼容性，例如避免离心管来源的合成聚合物污染，并能充分去除残留蛋白质。
本方案描述并验证了一种用于清洗聚碳酸酯超速离心管（UC管）以在细胞外囊泡（EV）蛋白质组学实验中重复使用的方法。清洗过程包括：实验后立即将UC管浸入H2O中以防止蛋白质干燥，随后用0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤剂清洗，再依次用热水、去离子水和70%乙醇冲洗。为验证该UC管重复使用方案在后续EV蛋白质组学分析中的适用性，实验获取了先前用于通过差速超速离心结合密度梯度分离法从心血管组织中分离EV的UC管。对这些使用过的UC管进行清洗后，在无EV样本的条件下重复整个实验流程，并将从未使用过的空白UC管与清洗后的UC管进行对比。通过分离步骤获得的伪EV沉淀物经裂解后，采用商用蛋白质样品制备试剂盒（针对低丰度蛋白质样品进行了优化）进行处理，随后用于液相色谱-串联质谱分析。
清洗后，与同一离心管中先前的EV分离样品相比，伪沉淀中鉴定出的蛋白质数量减少了98%。将清洗过的离心管与空白管进行比较，两个样品均仅含有极少量的蛋白质（≤20种），相似性达86%。已确认清洗后离心管的色谱图中无聚合物峰。最终，验证适用于EV富集的超速离心管清洗方案将减少EV实验室产生的废弃物，并降低实验成本。

为验证清洗方案（图1），进行了两项实验。首先，将清洗后试管中“模拟样本”的蛋白质组与该试管初次使用时组织EV样本的蛋白质组进行比较，以评估已鉴定蛋白质的残留情况。代表性色谱图显示，试管清洗后峰的异质性减少（图2）。在原始EV分离过程中，共鉴定出806种含有两个或以上独特肽段的蛋白质；清洗后，鉴定出的蛋白质数量减少了98%，仅剩19种。其中，有12种蛋白质在两组样本中均存在，另有7种蛋白质仅存在于清洗后的试管中（图3A）。通过文献调研，整理出一份已发表的典型EV标志蛋白列表9。在原始样本中鉴定出的24种典型EV蛋白中，清洗后仅检出1种（表1）。在共有的蛋白质中，MFGE8作为一种典型的EV蛋白，在EV样本中富集程度最高；相比之下，在清洗后的样本中，两种污染蛋白KRT14和KRT5的富集程度最高（图3B）。
为确认清洗后试管中蛋白质的去除情况，使用牛血清白蛋白（BSA）标准曲线（浓度范围为1 µg（典型细胞外囊泡分离产量的下限）至16.5 ng）进行SDS-PAGE凝胶电泳，并设置空白对照管和清洗后试管的“模拟”EV沉淀样本，每组三个重复。所有标准曲线条带均可见，但样品条带不可见，表明清洗过程至少去除了98%的蛋白质，且空白管与清洗后试管之间无明显差异（图4A）。为进一步评估清洗后试管中残留蛋白与从未使用过的空白试管中蛋白的差异，进行了直接比较（N = 4，分组）。空白管与清洗后试管的色谱图非常相似（图4B）。在从未使用过的空白试管中鉴定出19种蛋白质，而在清洗后试管中鉴定出20种蛋白质，其中18种为两组共有（图4C）。根据蛋白质丰度排序，污染性角蛋白KRT1、KRT9和KRT10在两组中均为最丰富的蛋白（图4D）。在清洗后试管中仅鉴定出一种典型的EV蛋白：乳黏附素（lactadherin，MFGE8）。清洗后试管与空白试管在每5分钟保留时间区间内触发的MS2测序事件数量（图4E）、测序肽段数量及其测序置信度（图4F）方面均表现出高度相似性，且肽段集合之间存在较大重叠（图4G）。综上所述，这些结果表明采用该清洗方案重复使用试管对蛋白质组无明显影响。
聚碳酸酯的单体为 254.3 MH1+，低于 MS1 的采集范围。对色谱图中是否存在单电荷二聚体和三聚体进行了评估，但未检测到（数据未显示，N = 4）。
<img alt="试管清洗流程图：用SDS浸泡，冲洗，喷洒乙醇，干燥，储存以备重复使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：聚碳酸酯超速离心管清洗流程示意图。 缩写：UC = 超速离心机；SDS = 十二烷基硫酸钠。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果；两个对比图显示清洁前后样本的强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：先前的细胞外囊泡（EV）样本蛋白质组与清洁管中“模拟样本”的代表性对比（N = 2）。 缩写：EV = extracellular vesicle；TIC-MS = total ion chromatography-mass spectrometry。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示EV样本在清洁前后分析中蛋白质水平的维恩图和柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：EV样本中鉴定出的蛋白质与从清洁后试管中获得的“空白”样本的比较。（A）EV样本蛋白质组与清洁试管中获得的“空白样本”（N = 2）之间的蛋白质鉴定维恩图。（B）按log 2倍变化排序的共有蛋白质差异富集情况。缩写：EV = 细胞外囊泡，FC = 倍变化 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质定量实验示意图；BSA标准曲线、质谱分析、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：未使用过的空白管与清洗后试管的比较。（A）采用BSA标准曲线（1 µg 至 16.5 ng）进行SDS-PAGE凝胶电泳，并对空白管和清洗后试管的“模拟”细胞外囊泡（EV）沉淀物进行三重复检测。（B）空白管与清洗后试管的代表性色谱图。（C）空白管与清洗后试管中蛋白质的维恩图，显示共有或特有的蛋白质（N = 4）。（D）各组中鉴定到的所有蛋白质按丰度排序：（i）空白管和（ii）清洗后试管。绘制中位数值。（E）按组汇总的各组中按保留时间累加的全部触发MS2事件的直方图（N = 4）。（F）各组中按置信度划分的肽段鉴定数量，其中高置信度肽段与组内匹配肽段区分开，后者鉴定置信度较低，但因与其他质谱图匹配而增强可信度，以均值±标准差表示。（G）各组间特有及共有的肽段数量。缩写：EV = 细胞外囊泡；TIC-MS = 总离子流色谱-质谱法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
表1：超速离心管清洗前后分析中检测到的特征性细胞外囊泡蛋白。缩写：UC = 超速离心；EV = 细胞外囊泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文提供了一种详细的方案，用于清洗和重复使用聚碳酸酯超速离心管，以进行适用于蛋白质组学实验的细胞外囊泡分离。

一次性实验室塑料制品加剧了污染危机，并增加了耗材成本。在细胞外囊泡（EV）分离过程中，聚碳酸酯……

我们研究心血管疾病，特别是细胞外囊泡在心血管组织（如心脏瓣膜和血管）病理性钙化中的作用。本课题组研究人员近期建立了从纤维钙化性心血管组织中提取组织及滞留的细胞外囊泡的方法，并可进一步分析其蛋白质组学特征。本课题组已证实，这些细胞外囊泡含有启动病变组织钙化过程的关键蛋白质成分。用于细胞外囊泡分离超速离心步骤的专用离心管可清洗并灭菌后重复使用。然而，蛋白质组学分析需要特别注意，因为任何污染都可能显著影响下游实验结果。本文中，我们验证了一种可重复使用耗材的方案， specifically polycarbonate ultracentrifuge tubes for extracellular vesicle isolation that is suitable for downstream, low input proteomics applications。我们的实验方案简单且高效，可帮助研究人员降低此类分离方案中通常涉及的耗材成本和废弃物产生。首先，收集使用过的聚碳酸酯管，并彻底弃去其中的先前样品。为防止样品干燥附着在管壁上，应立即将超速离心管浸入自来水中。然后将离心管置于0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中孵育10分钟。倒出大部分但并非全部的SDS溶液。使用棉签彻底擦拭离心管中曾有细胞外囊泡沉淀的区域。冲洗时，用热水注满试管，然后完全倾倒。使用喷瓶冲洗三次后，将去离子水喷入试管，随后喷入70%乙醇。将试管倒置，使其完全干燥，然后转移至洁净的容器中以备重复使用。

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