Name: 阿尔茨海默病 （AD） 神经模型中线粒体相关内质网膜 （MAM） 稳定性的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 了解阿尔茨海默病神经元中线粒体相关内质网膜稳定性的定量分析方法。该实时成像技术可评估MAM间隙宽度变化对轴突线粒体运动的影响，为神经退行性疾病治疗提供新思路。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢费城托马斯·杰斐逊大学教授György Hajnóczky博士慷慨提供编码RFP-Mito、MAM 1X、MAM 9X和MAM 18X的表达质粒。特别感谢布莱根妇女医院高级成像科学家Lai Ding博士，帮助我们编写用于生成、追踪和测量kymograph数据的代码。本研究由治愈阿尔茨海默病基金会资助RB，以及美国国立卫生研究院资助项目5R01NS045860-20资助RET。

AD 神经培养模型：本研究使用了来源于人神经前体 ReN 细胞的神经元，包括野生型 ReN 细胞（naïve ReN，Millipore）或表达家族性阿尔茨海默病（fAD）突变的 ReN 细胞，该突变位于淀粉样前体蛋白（APP）基因（APPSwe/Lon），即 ReN GA 细胞。ReN-GA 三维（3D）培养系统可重现阿尔茨海默病的病理特征，即由 Aβ 寡聚体驱动的神经原纤维缠结（NFTs）23,24。野生型 ReN 细胞可商业获得。ReN GA 细胞系由美国麻省总医院（MGH）的 Doo Y. Kim 副教授提供23,24,25。
表达质粒：AKP1（34-63）与Ubc6的ER靶向序列（283-303）直接与RFP连接（记为Mito-RFP-ER，即MAM 1X），或包含一个9个氨基酸的连接子（记为Mito-9X-RFP-ER，即MAM 9X），分别设计用于稳定间隙宽度为6 nm ± 1 nm或24 nm + 3 nm的MAMs15,26（图1A）。
1. 电穿孔
<ol>
	<li>用 MAM 稳定剂转染细胞（1-2 小时） 
	注意：遵循核转染试剂盒制造商提供的方案（材料表）。开始前，准备预先包被了含 1% Matrigel 的 DMEM/F12 的 6 孔玻璃底培养皿（以下简称基底膜基质 [BMM]）。每孔使用 2 mL BMM 进行包被，在 37 °C 下孵育至少 1 小时。混合前，BMM、培养基、移液器吸头和移液器均应预先冷却，以防止 BMM 凝固。
	<ol>
		<li>吸除 BMM 混合液，每孔替换为 2 mL 室温（RT）的 DMEM/F12。</li>
		<li>按 4.5:1 的比例将核转染液与添加剂 1 混合（对于 100 µL 溶液，核转染液:添加剂 = 82 µL:18 µL）。每次转染需要 100 µL 核转染液。</li>
		<li>涡旋混匀 DNA。然后，将每处理 1-5 µg 的 DNA 加入 1 mL 微离心管中，用于每次转染。</li>
		<li>使用 acutase 收集一皿健康的 ReN-GA 细胞。 
		注意：将细胞接种于 100 mm 组织培养皿中的扩增培养基（表 1）中，待细胞融合度达到 70-80% 后进行操作。
		<ol>
			<li>吸除原有培养基，用 10 mL PBS 洗涤一次。</li>
			<li>直接向细胞中加入 1 mL acutase，在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。</li>
			<li>轻轻敲击培养皿侧面使细胞脱落，显微镜下检查以确认细胞已松动并自由流动。</li>
			<li>用 10 mL DMEM/F12 中和 acutase，并转移至洁净的 15 mL 离心管中。</li>
			<li>将所需数量的细胞在 274 x g 下离心 5 分钟，吸除上清以去除死细胞，然后将沉淀重悬于 10 mL DMEM/F12 中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计数细胞以确定密度。 
		注意：本研究中使用自动细胞计数仪进行细胞计数。每次电穿孔需要 3-5 × 106 个细胞（例如，5 次处理需要 15-25 × 106 个细胞）。
		<ol>
			<li>取 10 µL 悬浮细胞加入细胞计数板 A 侧，再取 10 µL 加入 B 侧。 
			注意：移液时将移液枪头倾斜靠壁加入，避免在按压移液器活塞时超过第一档，以防产生气泡。</li>
			<li>将装好液体的计数板送至细胞计数仪，将 A 侧插入仪器前面的主插槽。</li>
			<li>按下 测量 后记录每毫升细胞数。</li>
			<li>取出计数板，翻转至 B 侧，重复步骤 1.1.5.2–1.1.5.3。</li>
			<li>将两次读数相加后除以 4（若未使用台盼蓝），再乘以细胞悬浮液的毫升数，得到悬浮液中的总细胞数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所需数量的细胞在 274 x g 下离心 5 分钟，吸除上清。</li>
		<li>每电穿孔用 100 µL 核转染液重悬沉淀（例如，5 次处理需 500 µL）。 
		注意：细胞在核转染液中停留超过 15 分钟可能会降低细胞活力和整体转染效率。</li>
		<li>将 100 µL 细胞悬液加入含有 DNA 的离心管中，通过移液混匀。</li>
		<li>将 DNA 混合物转移至电穿孔比色杯中，并用提供的盖子密封。为避免产生气泡，将比色杯倾斜向下，缓慢移液。</li>
		<li>选择适用于所用设备的核转染程序。本研究使用的设备采用程序 A-033 进行转染。为优化效果，可尝试全部 5 种核转染程序，以确定最适合每种细胞类型的程序。 
		注意：电穿孔成功的标志是混合物顶部出现可见泡沫。</li>
		<li>立即使用提供的无菌移液器，将预装 6 孔板中的约 500 µL DMEM 加入比色杯中。轻柔混合一次后，将电穿孔后的细胞和培养基转移至对应的孔中。 
		注意：电穿孔后细胞极为敏感，因此快速转移培养基并小心移液至关重要。</li>
		<li>对所有剩余的 DNA 处理重复步骤 1.1.8–1.1.11。</li>
		<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
		<li>次日更换为新鲜的分化培养基（表 2），让细胞分化 10 天。每 2-3 天更换一次新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 活细胞成像
<ol>
	<li>活细胞显微镜观察的细胞准备（30 分钟）
	<ol>
		<li>活细胞培养腔室的准备（在将细胞移入腔室之前）</li>
		<li>确保 CO2 气瓶和加湿器已连接至腔室，阀门已打开，且气瓶内气体充足。</li>
		<li>将温度设置为 37 °C，CO2 浓度设置为 5%，湿度设置为 95%。（此过程可能需要一定时间以达到平衡状态）。</li>
		<li>将含有细胞的 6 孔板放入腔室中，并调节显微镜焦距，直至细胞清晰可见。</li>
		<li>打开激光器（材料表）。</li>
		<li>为捕获 RFP 信号，使用 594 nm 激光激发荧光基团，并采集 570–640 nm 发射光；对于 GFP，使用 488 nm 激光激发，并采集 510–540 nm 发射光。</li>
		<li>使用内置荧光滤光片调节信号强度，直至背景信号基本消失（应接近纯黑色）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轴突动态的活体视频采集（总时长 10–15 小时） 
	注：使用尼康 C2 Eclipse Ti2 倒置共聚焦显微镜结合 NIS Element AR 软件采集荧光图像。采用 60 倍放大倍数，分辨率为 512 像素，以每秒 1 帧的速度连续采集 3 分钟视频，可获得更清晰的运动轨迹图（kymograph）。
	<ol>
		<li>寻找表达 RFP 生物传感器的细胞。在开始录制视频前，先导出该细胞的图像以供后续参考。</li>
		<li>裁剪扫描区域，使其围绕轴突。较小的扫描区域可缩短显微镜处理时间，并显著简化运动轨迹图的生成。</li>
		<li>关闭所有激光器以提高软件运行流畅性。请注意，若程序在所有激光器开启状态下运行，可能无法完整捕获全部帧图像。 
		注：胞体发出的红色荧光信号远强于轴突中的信号。因此，排除胞体区域有助于增强轴突整体信号强度。切换至 时间测量 选项卡。</li>
		<li>设置时间间隔为每秒 1 帧，总时长为 181 秒。</li>
		<li>点击 运行。</li>
		<li>将文件保存为 .nds 格式（需正确标注），并对每种 MAM 稳定剂（MAM 1X 或 MAM 9X）重复此过程约 10 次。 
		注：若扫描时间过长，激光强度有时会导致 RFP 信号出现明显的光漂白效应。因此，应尽快完成视频采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 后处理（7 天）
注意：为分析运输过程并生成明场图像，使用了 Fiji ImageJ 宏。移动速度低于 0.1 mm/s 的囊泡被归类为静止状态。颗粒运动频率通过将沿特定方向（顺向或逆向）运动或未运动（静止）的颗粒数量除以明场图像中分析的总颗粒数来计算。每个囊泡处于暂停或运动状态的时间通过计算每条神经元中所有囊泡在各状态下所花费时间的百分比平均值来确定。速度和运行长度的频率分布仅基于各实验条件下运动中的囊泡进行计算。分析在 100 mm 的轴突区段上进行，持续时间为 3 分钟。
<ol>
	<li>生成延时图像（kymograph）
	<ol>
		<li>在 Fiji ImageJ 中打开 .nds 文件。</li>
		<li>转到 图像 选项卡并点击 属性。记录像素与微米的比例。此数值后续计算时需要。</li>
		<li>点击 文件 &#62; 另存为 &#62; Tiff ，将文件保存为 .tiff 格式至其文件夹中（该宏将自动将所有生成内容保存到此文件夹）。</li>
		<li>将 Kymo 宏拖入 ImageJ。代码见 补充代码文件 1。点击 运行。</li>
		<li>不要点击确定。切换到 MAX_raw&#160;窗口。手动沿轴突左键单击，并双击以结束追踪。 
		注意：务必从胞体开始追踪至轴突末端，以确保顺向和逆向运输的计算正确。</li>
		<li>按下 command T 或在 ROI 管理器中点击 添加&#160;。</li>
		<li>现在点击 确定。延时图像（kymograph）将生成于先前创建的文件夹中。（X 轴表示轴突长度，单位为微米；Y 轴表示时间，单位为秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>追踪延时图像（kymograph）
	<ol>
		<li>将延时图像拖入 Fiji ImageJ（应自动位于先前创建的文件夹中）。</li>
		<li>将 Track&#160;宏拖入 ImageJ。</li>
		<li>在弹出的提示中点击 确定。 若为继续之前的工作，请输入要从中继续的编号点，然后按 确定。</li>
		<li>使用 选择 面板中的 矩形 工具，在延时图像中部选择一个高度为 60 像素、宽度恒为 100 µm 的区域。为此，请将 100 除以步骤 3.1.2 中记录的像素与微米比例。</li>
		<li>选定区域后，按 Ctrl T 将其添加至 ROI，并将 ROI 保存至当前工作文件夹中（在 ROI 菜单中点击 更多&#160;，然后点击 保存）。 
		注意：按下 Ctrl+Shift+I 反选所选区域，将使追踪更方便。</li>
		<li>要追踪单个囊泡的运动，请在从上至下左键点击时按住 Ctrl 键。</li>
		<li>完成时，在右键点击的同时按住 Ctrl 键，将弹出一个窗口显示轴突的追踪位置。若显示无误，则点击 确定。</li>
		<li>若需继续并选择另一个囊泡，请点击 是&#160;，并重复步骤 3.2.6–3.2.8。当所有可见囊泡均被追踪后，点击 否。系统将自动将手动追踪的叠加结果保存至同一文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量延时图像数据
	<ol>
		<li>新建一个文件夹。将所有生成的文本文件拖入该文件夹。</li>
		<li>打开延时图像文件并记录其尺寸。</li>
		<li>将 Measure&#160;宏拖入 ImageJ。</li>
		<li>将之前记录的微米与像素比例输入 PixelScale。</li>
		<li>将 速度下限 设为 0.1。（低于此速度的囊泡运动被视为静止）。</li>
		<li>输入先前记录的延时图像尺寸。汇总文件将自动生成于创建的文本文件夹中。每个汇总文件将包含：运动时间百分比（%Time Traveled）、总体速度（µm/s）、总移动距离、平均运动片段长度、停止次数和方向逆转次数。用于生成、追踪和测量延时图像数据的代码见 补充代码文件 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Stabilization of MAMs in a 3D Neural Model of Alzheimer

<ol><li>Giacomello, M., Pellegrini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coming+of+age+of+the+mitochondria-ER+contact%3A+a+matter+of+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The coming of age of the mitochondria-ER contact: a matter of thickness.</a> Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).</li>
<li>Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+associated+endoplasmic+reticulum+membranes%3A+A+platform+for+the+pathogenesis+of+inflammation-mediated+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases.</a> Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647(2022).</li>
<li>Schon, E. A., Area-Gomez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+ER+membranes+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated ER membranes in Alzheimer disease.</a> Mol Cell Neurosci. 55, 26-36 (2013).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., Mouton-Liger, F., Corti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dysfunctional+endoplasmic+reticulum-mitochondria+coupling+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">From dysfunctional endoplasmic reticulum-mitochondria coupling to neurodegeneration.</a> Neurochem Int. 109, 171-183 (2017).</li>
<li>Sala-Vila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+hepatic+mitochondria-associated+membranes%2C+lipid+metabolism+and+caveolin-1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interplay between hepatic mitochondria-associated membranes, lipid metabolism and caveolin-1 in mice.</a> Sci Rep. 6, 27351(2016).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).</li>
<li>Hung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+cytosol-facing+outer+mitochondrial+and+ER+membranes+in+living+human+cells+by+proximity+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of cytosol-facing outer mitochondrial and ER membranes in living human cells by proximity biotinylation.</a> eLife. 6, e24463(2017).</li>
<li>Area-Gomez, E., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+The+MAM+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis.</a> FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Sukhorukov, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+interactions+between+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%3A+A+new+look+at+how+important+cell+functions+are+supported%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of interactions between mitochondria and the endoplasmic reticulum: A new look at how important cell functions are supported.</a> Mol Biol. 56 (1), 59-71 (2022).</li>
<li>Zhang, P., Konja, D., Zhang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communications+between+Mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+the+regulation+of+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Communications between Mitochondria and endoplasmic reticulum in the regulation of metabolic homeostasis.</a> Cells. 10 (9), 2195(2021).</li>
<li>Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+links+mitochondria-ER+contacts+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging.</a> Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Carpio, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOK+controls+apoptosis+by+Ca%282%2B%29+transfer+through+ER-mitochondrial+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BOK controls apoptosis by Ca(2+) transfer through ER-mitochondrial contact sites.</a> Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).</li>
<li>Prudent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPL+SUMOylation+of+Drp1+stabilizes+an+ER%2Fmitochondrial+platform+required+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death.</a> Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).</li>
<li>Zellmer, J. C., Tarantino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes+regulates+Abeta+generation+in+a+three-dimensional+neural+model+of+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+Dement%22%5BJournal%5D)">Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Abeta generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer’s disease.</a> Alzheimer’s Dement. , 1-20 (2024).</li>
<li>Magalhaes Rebelo, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites.</a> Cells. 9 (7), 1637(2020).</li>
<li>Berger, S. I., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+systems+pharmacology+in+understanding+drug+adverse+events%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Role of systems pharmacology in understanding drug adverse events.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+sliding+dynamics+and+ER-mitochondrial+contacts+occur+on+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules.</a> J Cell Biol. 190 (3), 363-375 (2010).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacts+between+the+endoplasmic+reticulum+and+other+membranes+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contacts between the endoplasmic reticulum and other membranes in neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (24), E4859-E4867 (2017).</li>
<li>Cagin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+retrograde+signaling+regulates+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial retrograde signaling regulates neuronal function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), E6000-E6009 (2015).</li>
<li>Choi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+human+neural+cell+culture+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease.</a> Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+human+neural+cell+culture+system+for+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease.</a> Nat Protoc. 10 (7), 985-1006 (2015).</li>
<li>Kwak, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42%2F40+ratio+drives+tau+pathology+in+3D+human+neural+cell+culture+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42/40 ratio drives tau pathology in 3D human neural cell culture models of Alzheimer's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1377(2020).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Bhattacharyya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+generation+of+amyloid-beta+from+palmitoylated+APP+in+mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes.</a> Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).</li>
<li>Tebo, A. G., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+split+fluorescent+reporter+with+rapid+and+reversible+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A split fluorescent reporter with rapid and reversible complementation.</a> Nat Commun. 10 (1), 2822(2019).</li>
</ol>

σ-1受体（S1R）的抑制作用下调了神经元突起中线粒体相关内质网膜（MAM）的稳定性，并在表达淀粉样前体蛋白（APP）家族性阿尔茨海默病（FAD）突变的人类神经前体细胞（ReN细胞）三维（3D）培养体系中，显著降低轴突来源的Aβ生成量（约90%），但不影响胞体来源的Aβ生成。APP]基因（ReN GA）23,24,25,27RFP标记的组成型MAM稳定剂（MAM 1X和MAM 9X），设计用于稳定紧密型（6 nm ± 1 nm）和松散型（24 nm ± 3 nm）MAM结构15,26 是定量测量MAM稳定的出色工具。这两种稳定剂不仅在三维基质中分化约10天的ReN GA细胞中表现出相等且稳定的表达，还能在胞体和轴突中以离散点状结构检测到MAM。最重要...

越来越多的证据表明，特化的线粒体相关内质网接触结构（Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum Contacts, MERCs），在生化分离中被称为线粒体相关内质网膜（Mitochondria-Associated ER Membranes），通常简称为MAMs1,2&#160;，在包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病中发挥重要作用3,4。这些MAMs由富含胆固醇的、类似脂筏的内质网微区和线粒体外膜组成&#160;，并通过一系列蛋白质连接，从而在MAMs之间形成结构和功能上的多样性5,6,7。最近提出的MAM假说认为，MAMs的增加会促进Aβ的生成，并引发AD的致病级联反应，包括神经原纤维缠结（NFT）的形成、钙稳态失调以及神经炎症3,8。约5%–20%的线粒体与内质网发生物理接触，从而形成MAMs9。MAMs的间隙宽度取决于光面内质网和粗面内质网（分别为sER和rER）。sER-线粒体之间的间隙宽度为10–50 nm，而rER-线粒体之间的间隙宽度为50–80 nm，这种可变性表明MAMs的间隙宽度具有较广的范围，从紧密连接（约10 nm）到松散连接（约80 nm）不等10,11,12,13。MAMs的间隙宽度决定了其功能，例如钙稳态调节和脂质转运1,14。最近一项研究显示，由紧密连接（约10 nm）的内质网与线粒体形成的MAMs（称为完整MAMs）具有促凋亡作用；相反，由松散连接（约25 nm）的内质网与线粒体形成的MAMs（称为缺陷型或中等MAMs）则具有抗凋亡作用14,15,16。在一种新型的阿尔茨海默病三维（3D）神经细胞培养模型中，将MAMs的间隙宽度稳定在6 nm ± 1 nm时，Aβ的生成增加；而将MAMs的间隙宽度稳定在24 nm ± 3 nm时，则对Aβ的生成无显著影响17。该发现首次表明，调控MAMs的稳定程度（而非完全破坏其稳定性）是调节Aβ生成的关键。试图完全破坏MAMs的稳定性可能会带来不良后果，因为MAMs维持着多种对细胞存活至关重要的细胞活动12。
线粒体相关内质网膜（MAMs）的调控是一个新兴的研究领域，可能对癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病等多种疾病具有重要意义18。尽管目前已发现多种MAM调节剂，但尚未有重大尝试去检验这些化合物破坏MAM稳定性并降低阿尔茨海默病（AD）病理的能力，主要原因在于MAM结构的高度多样性，使其成为药物研发中极为复杂的靶向系统。然而，新发展的结构系统药理学方法，能够综合考虑药物靶点及其所处环境的特定性质18,19，有望克服这些困难，并开发出高效靶向AD中MAM或MAM相关蛋白的药物。不过，寻找有效调控MAM稳定性的调节剂，需要能够精确定量MAM稳定程度的方法。传统的电子显微镜（EM）或超分辨率显微镜技术在测定MAM稳定性方面存在局限性。克服这些挑战可能需要开发新型的、更具动态性的成像技术或生化检测方法，以在活细胞中对MAM稳定性进行定量评估。对原代神经元进行聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）分析发现，内质网倾向于在线粒体周围形成网络结构，可能限制线粒体的运动能力20,21。无论是逆向、顺向或两者同时发生的线粒体运输系统的破坏，均会对突触和神经元功能产生深远影响22。因此，本文所述的基于活细胞成像和轴突内与内质网结合的线粒体运动速度的kymography分析方法，作为一种定量测量MAM稳定性的指标，将有助于鉴定能够将MAM稳定性阈值调节至维持或可能降低而非增加Aβ生成水平的MAM调节剂。

<table><tbody><tr><td>6 孔玻璃底培养板</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50X），无血清</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D System&amp;nbsp;</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>501781532</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>41116134</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92090408</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 孔培养板&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>41122107</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-988</td><td></td></tr><tr><td>明胶&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism N/A</td><td>Prism 9, version 9.5.0</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H0200000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件&amp;nbsp;</td><td>ImageJ 1.53a</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>mCherry 多克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>MS Excel&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Microsoft Excel, version 2302</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>多阵列电化学发光检测试剂盒</td><td>Meso Scale Diagnostics (MSD)</td><td>K15200E-2</td><td>V-PLEX A&amp;beta; 肽段 Panel 1 (6E10) 试剂盒</td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&amp;ndash;12% Bis-Tris 凝胶&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/两性霉素 B&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>&amp;nbsp;17-745E</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe Photoshop CC 20.0.10&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>大鼠神经元核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，pH 7.6&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Boston BioProducts</td><td>42000000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>501657287</td><td></td></tr></tbody></table>

阿尔茨海默病（ad）神经模型中线粒体相关内质网膜（mam）稳定性的定量分析

Quantitative Analysis of Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membrane (MAM) Stabilization in a Neural Model of Alzheimer's Disease (AD)

本文介绍了一种在阿尔茨海默病（AD）的三维（3D）神经模型中定量测定线粒体相关内质网膜（MAMs）稳定性的方法。首先，将表达含家族性阿尔茨海默病（FAD）突变的β-淀粉样前体蛋白（APP）的人类神经前体ReN细胞或未经修饰的ReN细胞接种于经稀释（1:100）Matrigel包被的组织培养板中进行培养。当细胞达到汇合状态后，通过电穿孔法转染表达质粒，该质粒编码红色荧光蛋白（RFP）标记的AKAP1（34-63）线粒体结合序列（Mito-RFP），用于标记线粒体；或编码组成型MAM稳定因子MAM 1X或MAM 9X，分别用于稳定紧密型（间隙宽度为6 nm ± 1 nm）或松散型（间隙宽度为24 nm ± 3 nm）的MAM结构。转染16–24小时后，收集细胞并通过荧光激活细胞分选仪（FACS）富集。将等量的FACS富集细胞接种至三维基质（1:1 Matrigel）中，使其分化为成熟神经元，持续培养10天。随后，在配备活细胞成像培养室的荧光显微镜下，采集表达RFP标记MAM稳定因子的10天分化细胞的活细胞图像，培养室维持CO2浓度（5%）、温度（37 °C）和湿度（约90%）。在此基础上，我们进行了活细胞成像和显微轨迹分析（kymographic analyses），以测量在每个长度至少为500 nm的ReN GA神经元最远端神经突（视为轴突）中，由Mito-RFP标记的游离线粒体，或由MAM 1X或MAM 9X分别稳定的具有紧密或松散间隙宽度的内质网结合线粒体的运动性。

对活细胞进行成像并进行线扫分析，以测量用 Mito-RFP 标记的游离线粒体或通过 MAM 1X 或 MAM 9X 分别稳定的紧密（6 nm ± 1 nm）或松散（24 nm ± 3 nm）接触宽度的内质网（ER）结合线粒体在每个 ReN GA（AD）或 ReN（naïve）神经元最长的神经突中的运动情况，该神经突长度至少为 500 nm，被视为轴突（图 1 和 图 2）。通过将移动或静止的 RFP 标记点状结构（MAMs）的数量除以线扫图中总数，计算出运动频率（总体、逆向和顺向）（图 1A-E）。与 Mito-RFP 标记的无内质网结合的线粒体或 MAM 9X 标记的内质网结合线粒体相比，MAM 1X 标记的内质网结合线粒体的总体轴突运动速度显著降低约 50%（图 1B）。定量分析还显示，MAM 1X 稳定的内质网结合线粒体在总体和...

此处，我们描述通过增强或维持线粒体相关内质网膜（MAMs）组成型稳定因子的轴突运输速率来进行测量的方法&#160;实时监测阿尔茨海默病（AD）神经元中神经毒性β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成，作为衡量线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的直接且定量的指标，并助力AD治疗药物的开发。

阿尔茨海默病（AD）神经模型中线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的定量分析

一种在三维（3D）神经模型中定量分析线粒体相关内质网膜（MAMs）稳定性的方法

我们正试图定量测量不同厚度或间隙宽度的线粒体相关内质网膜的稳定性，这对于调控包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病的病理生理过程具有重要意义。近期关于线粒体相关内质网膜（常称为MAMs）的研究已将其描述为在AD早期阶段启动淀粉样蛋白病理的关键因素之一。这些发现催生了一种名为MAM假说的新理论，该假说认为AD完全是一种与MAM相关的疾病。本方案首次提供了一种定量工具，用于在活细胞中测量线粒体-内质网接触（MAM）的稳定性，而这一目标迄今为止仍具挑战性。本方案最大的优势在于利用了线粒体固有的动态特性，能够在活细胞中通过调节MAM间隙宽度的松紧程度，定量检测MAM稳定性的变化。在不久的将来，我们的重点是改进并应用先进的活细胞成像和显微追踪成像技术，利用近期开发的阿尔茨海默病药物筛选平台，筛选一系列经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的、针对线粒体相关内质网膜（MAM）或MAM结合型σ1受体的合成或天然小分子调节剂，并阐明其作用机制。[旁白] 为了用MAM稳定剂转染细胞，将每个孔中的骨髓单个核细胞混合物替换为两毫升室温的DMEM-F12培养基。按照4.5:1的比例将核转染试剂与添加剂1混合。向混合物中加入100微升核转染试剂。然后涡旋DNA溶液。每种处理分别向独立的1毫升微量离心管中加入1至5微克DNA。吸除细胞中现有的培养基后，用10毫升PBS洗涤细胞一次。吸除PBS，然后直接向细胞中加入1毫升accutase。在37摄氏度下孵育5至10分钟。然后轻轻敲击培养皿侧面以使细胞脱落。在显微镜下确认细胞已松动并自由流动。用10毫升DMEM-F12培养基中和accutase，将细胞悬液转移至洁净的15毫升离心管中。接下来，取10微升悬浮细胞加入细胞计数板的A侧。然后将装填好的计数板A侧插入细胞计数仪前方的主插槽中。按下“测量”按钮并记录每毫升细胞数量。将所需数量的细胞在300 × g下离心5分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于每电穿孔样品100微升的核转染混合液中。接着，将100微升重悬的细胞悬液加入含有DNA的离心管之一。通过反复吹打混合溶液。然后将DNA-细胞混合物转移至电穿孔比色杯中，并用提供的盖子密封。在仪器上选择合适的核转染程序。立即使用无菌移液器从预装的六孔板中加入约500微升DMEM至比色杯中。轻轻混合一次，然后将电穿孔后的细胞和培养基转移至对应的孔中。开始时，将含有细胞的六孔板放入显微镜载物台腔室，调节显微镜焦距直至细胞可见。为捕获红色荧光蛋白信号，使用594纳米激光激发荧光染料，并将发射波长设置为570至640纳米。对于绿色荧光蛋白，使用488纳米激光激发，发射波长设置为510至540纳米。裁剪扫描区域以围绕轴突。较小的扫描区域将减少处理时间并简化动态线扫描（kymography）的生成。将时间间隔设为每秒一帧，总时长设为181秒。点击“运行”以启动过程。与游离型及MAM 9X结合的线粒体相比，MAM 1X标记的内质网结合线粒体的轴突运输速度降低了50%。MAM 1X线粒体中有26.6%具有移动性，而游离线粒体为53.82%，MAM 9X线粒体为44.79%。MAM 1X线粒体的逆向运动低于Mito-RFP线粒体和MAM 9X线粒体。MAM 1X线粒体的顺向运动也低于Mito-RFP线粒体。MAM 1X线粒体的静止比例显著高于MAM 9X线粒体，表明其运动能力下降，同时MAM 1X线粒体的整体运动速度也显著低于MAM 9X线粒体。

quantitative-analysis-mitochondria-associated-endoplasmic-reticulum

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

阿尔茨海默病 （AD） 神经模型中线粒体相关内质网膜 （MAM） 稳定性的定量分析 

对哺乳动物脑组织中线粒体的可视化与分析是一项具有挑战性的任务。本文介绍了如何利用连续块面扫描电镜（SBFSEM）进行三维（3D）重建分析，以深入了解这一关键能量生成细胞器的形态学和体积特征。...

利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体

本文提供了一种研究不同肽和蛋白质的天然形式、前纤维状结构及成熟淀粉样纤维与来自不同组织及脑区的分离线粒体之间相互作用的实验方案。...

淀粉样纤维与脑线粒体的相互作用及其对线粒体膜的通透化作用

线粒体网络极为复杂，使其分析极具挑战性。一种新型的 MATLAB...

视黄酸受体亚型特异性调控活神经元线粒体稳态的优化自动化分析

本研究提出了一种基于免疫染色和图像分析的小鼠脑组织线粒体形态分析方法...

帕金森病模型中线粒体形态的组织学检查

本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。...

利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term...

制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

我们描述了一种用于反复观察小鼠小胶质细胞和循环单核细胞的方法 体内...

一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一是形成淀粉样β蛋白阳性的神经炎性斑块。在本方案中，我们描述了两种在转基因AD模型小鼠中检测神经炎性斑块的方法：采用ABC与DAB法进行免疫组织化学检测，以及使用硫黄素S染色法进行荧光检测。...

阿尔茨海默病小鼠模型中神经炎性斑块的检测

Morris水迷宫是一种用于检测依赖海马的学习和记忆能力的行为学任务。它已广泛应用于啮齿类动物模型的神经生物学、神经药理学以及神经认知障碍研究中。...

阿尔茨海默病模型小鼠学习与记忆缺陷的莫里斯水迷宫检测

介绍了一种活体荧光成像技术，用于定量中枢神经末梢中特定突触小泡（SV）池的补充与动员过程。在同一神经末梢中监测两轮SV循环，以提供内部对照。...

使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

了解阿尔茨海默病神经元中线粒体相关内质网膜稳定性的定量分析方法。该实时成像技术可评估MAM间隙宽度变化对轴突线粒体运动的影响，为神经退行性疾病治疗提供新思路。

阿尔茨海默病（AD）神经模型中线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的定量分析

探索更多视频