Name: 便携式纸基免疫测定法与智能手机应用相结合，用于登革热NS1抗原的比色和定量检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 了解便携式纸基免疫测定法与智能手机应用相结合的技术，用于登革热NS1抗原的比色和定量检测。该方法提高了检测灵敏度，适用于资源有限的医疗环境。

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M.H.P. 感谢伊斯兰印尼大学（Universitas Islam Indonesia，UII）提供的奖学金研究基金。作者们衷心感谢 Nutchanon Ninyawee 先生在移动应用程序开发过程中提供的宝贵专业知识和协助，以及他对本手稿的贡献。此外，作者们感谢泰国科学、研究与创新局（Thailand Science Research and Innovation，TSRI）基础研究基金：2023 财年（项目编号 FRB660073/0164）在国王蒙库特科技大学（Thonburi）智能医疗项目下的财政支持。

泰国曼谷帕拉蒙固克里奥医院皇家泰国陆军医疗部机构审查委员会伦理委员会（IRBRTA 1218/2562）批准了本研究。在开展本研究过程中，我们遵守了所有必要的伦理规范。
1. 基于纸张的免疫测定装置的制备
注意：纸质免疫分析装置的制备参照了先前已建立的方法36,37以及泰国专利申请号 19010081638。
<ol>
	<li>设计与图案绘制：在计算机上设计纸基分析装置（图1A，B），在A5尺寸的纸上布置18个纸基分析装置（PAD）的蜡图案。 
	注意：该设计具有特定性，专为A5尺寸纸张设计。PAD的数量可根据用户需求，根据纸张大小进行调整。</li>
	<li>使用蜡打印机（材料表）将设计好的图案打印到纤维素纸上。</li>
	<li>将打印蜡图案的纸张在实验室烘箱中于150 °C加热75秒，使蜡熔化。随后将其存放在干燥硅胶盒中，待后续步骤使用。</li>
	<li>在检测区和对照区各加入0.5 µL的0.025%聚-L-赖氨酸（PLL）。在硅胶盒中室温（RT）孵育2分钟，然后在65 °C烘箱中加热5分钟。</li>
	<li>在对照区加入0.5 µL浓度为1 µg µL-1的山羊抗小鼠IgG抗体，在检测区加入0.5 µL浓度为1 µg µL-1的&#160;捕获抗体。将液滴置于硅胶干燥盒中室温下干燥30分钟。</li>
	<li>在样品区加入2 µL封闭缓冲液，结合区加入3 µL，检测区加入2 µL。将液滴置于硅胶干燥盒中室温下干燥30分钟。</li>
	<li>在结合区加入2 µL金纳米颗粒-抗体复合物（AuNPs-Ab）溶液，置于硅胶干燥盒中室温下干燥30分钟。</li>
</ol>
2. 基于纸张的免疫测定装置的组装
<ol>
	<li>小心移除粘性塑料背板背面的保护膜，以暴露粘合面。</li>
	<li>将处理过的纤维素纸与粘性塑料背板对齐，并用力将两层压合在一起。 
	注意：避免触碰亲水区域，以尽量减少污染或损坏装置的风险。</li>
	<li>覆盖一层塑料膜，包裹纸片并压合紧密。</li>
	<li>使用剪刀从完全组装好的装置板上裁剪出所需数量的装置。</li>
	<li>DEN-NS1-PADs（图1C）现已准备就绪，可供使用。如需长期保存，请置于4 °C储存。</li>
</ol>
3. 金纳米颗粒-抗体偶联物的制备
注意：AuNPs-Ab 的制备方法如 Prabowo 等人先前所述36。
<ol>
	<li>在 PBS 中取 10 µL 浓度为 1 mg mL−1 的抗 NS1 抗体，加入 1 mL 的 40 nm 金纳米颗粒（AuNPs）胶体和 0.1 mL 的 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 8.5），混合均匀。</li>
	<li>以 50 rpm 转速旋转孵育 60 分钟，并在室温下静置孵育。</li>
	<li>加入 0.1 mL 浓度为 10 mg mL−1 的 BSA BBS 溶液，以 50 rpm 转速旋转，室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 20,187 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟。</li>
	<li>小心使用移液器吸取并分离上清液，保留沉淀的 AuNPs-Ab 复合物。</li>
	<li>将 AuNPs-Ab 沉淀重悬于 500 µL BBS 缓冲液中，并通过超声处理使其充分分散。</li>
	<li>再次在 20,187 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟。 
	注意：重复分散和离心操作共 3 次。</li>
	<li>向悬浮液中加入 50 µL 偶联缓冲液，混匀后即可用于偶联区域的点样。</li>
</ol>
4. 移动应用程序开发
<ol>
	<li>图像处理与机器学习开发
	<ol>
		<li>通过收集超过900张DEN-NS1-PADs的自动对焦图像来构建监督图像模型的数据集，涵盖不同浓度、相机品牌（12-13百万像素）、旋转角度（90° 和 180°）以及光照条件等多种情况。每种特定条件下应收集约30张图像。</li>
		<li>通过在所收集的图像中标注两个感兴趣区域（即检测区和对照区），确定并标注监督学习所需的真值标签。</li>
		<li>设计一种算法以识别背景条带。定位检测区与对照区之间的中心线，计算其中点，并建立一个与两个主区域平均尺寸成比例的方形区域，同时保持相同的旋转方向。</li>
		<li>利用步骤4.1.1和4.1.2中的数据集及真值标签，构建图像分割模型，用于识别感兴趣区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>应用算法
	<ol>
		<li>将训练好的图像分割模型应用于新图像，以自动定位检测区、对照区和背景区。</li>
		<li>使用基本的图像处理技术，分别获取三个感兴趣区域（检测区、对照区和背景区）各自的单一强度值。</li>
		<li>将图像转换为三维数组表示形式（y, x, 通道），以便访问像素值。</li>
		<li>通过对RGB值取平均将图像转为灰度图，并使用公式（255-x）进行反相处理。</li>
		<li>通过减去背景区域的值，对检测区和对照区的数值进行归一化。</li>
		<li>利用预先建立的校准曲线计算NS1的浓度。</li>
		<li>根据归一化灰度强度导出的0.1103截断值，将结果分类为阳性或阴性37。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 校准曲线与灵敏度
<ol>
	<li>准备人血清中的NS1样本，用于浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 µg mL-1的标准曲线校准。</li>
	<li>将每种浓度的样本各50 µL滴加到加样区域，并每组进行三次重复测量。</li>
	<li>让样本完全通过毛细作用渗入检测装置，可能需要20–30分钟以获得结果。</li>
	<li>孵育5分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄装置的图像。</li>
	<li>使用ImageJ软件和定制的移动应用程序分析检测线和质控线区域。</li>
	<li>基于ImageJ和移动应用程序的数据绘制标准曲线。</li>
	<li>使用以下公式（1–3）计算空白限（LOB）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）： 
	LOB = 空白数据均值 + 1.645 × ð（空白数据的标准偏差）（1） 
	LOD = LOB + 1.645 × ð（最低浓度数据的标准偏差）（2） 
	LOQ = 空白数据均值 + 10 × ð（空白数据的标准偏差）（3）</li>
</ol>
6. 使用临床样本进行基于纸张的免疫测定
<ol>
	<li>按照良好的临床规范，在住院第一天采集30名患者的外周血300 µL，并将其处理至紫色头盖的EDTA管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以2,884 × g离心20分钟。</li>
	<li>使用移液器将液体成分（血浆）转移至干净的聚丙烯管中。</li>
	<li>立即将血浆在−20 °C冷冻保存，以备后续分析。</li>
	<li>将20 µL血浆加至检测装置顶部的加样区域，然后加入30 µL洗涤缓冲液（含0.05% v/v Tween 20的1×磷酸盐缓冲液）。</li>
	<li>让样本完全通过毛细作用渗入装置，此过程可能需要20–30分钟以获得结果。</li>
	<li>在室温孵育5分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄装置图像。</li>
	<li>使用ImageJ软件和定制的移动应用程序分析检测线和质控线区域。</li>
</ol>
7. 使用移动应用程序进行定量分析
注意：纸质免疫分析的强度在移动应用程序中进行分析（图2）。
<ol>
	<li>在智能手机上打开已开发的移动应用程序。</li>
	<li>选择使用相机或从图库上传，以通过相机拍摄或从设备图库中选择图像来选取或上传数据源。</li>
	<li>进入分析界面，点击屏幕上的分析按钮。</li>
	<li>等待应用程序分析数据并显示结果。</li>
</ol>

Smartphone-Integrated Dengue NS1 Paper-Based Diagnostic Device

作者声明无利益冲突。

基于智能手机的读取系统的一个重要设计参数是能够对样本进行可重复的图像处理。本研究中，为简化操作并提高便利性，使用三种不同品牌的智能手机（配备1200万至1300万像素摄像头）直接拍摄图像，未使用成像箱或其他附件。图像采集过程中的多种可变条件，如摄像头分辨率、图像采集时间、光照条件和环境因素，均可能影响设备上检测线和质控线的颜色强度。通过采用归一化信号强度，可最小化不同采集时间对纸基微流控芯片（PAD）光照和干燥程度所导致的信号强度变化，从而在不同时间点采集的图像间保持信号一致性36。背景信号扣除被作为一种提升颜色强度测量准确性的策略，有效减轻了光照条件的影响。我们的研究结果与先前研究一致，均表明基线或背景扣除技术在降低环境干扰方面具有显著效果39,40。
关于使用成像盒或无附件方法哪种更具优势的持续争论，对图像处理具有重要意义39,41。成像盒可通过最小化成像条件的变异，提高图像处理结果的稳健性41,42,43。在本研究中，我们采用了一种基于云端机器学习的移动应用程序进行图像处理。该方法利用基于云的平台中的机器学习，自动对图像数据进行分类、提取和增强。该应用程序有效识别并处理了图像中的感兴趣区域，包括背景、检测区和对照区。此步骤对于区分这些区域至关重要38。先前研究表明，涉及机器学习的图像处理在对照样本与检测样本的结果分类方面表现更优43,44,45。在本研究中，通过采用固定位置和背景扣除法，从纤维素µPADs中获得了稳定的背景信号，从而提高了移动应用程序所提供读数的一致性和分类准确性40,43。
在纸基免疫测定的一致性表现方面，制备方法起着重要作用。在之前的一项研究36中，已对DEN-NS1-PAD的设计与制备方法中的多个优化条件进行了研究，包括PLL浓度、封闭物质浓度以及NS1抗体浓度等。该装置已成功在缓冲液、细胞培养物和人血清中对NS1蛋白进行了定性和定量检测。
血清成分引起的基质效应可能在检测血清样本时干扰设备的检测限。然而，结果表明，所开发的免疫分析法能够成功检测血清样本中的NS1浓度，其结果与商业化的快速诊断试剂盒（RDT）相当（表2）。通过肉眼观察和移动应用程序获得的结果（图4）均显示良好，凸显了该检测方法在血清检测中的有效性。尽管血清较高的黏度可能影响分析时间，但并不妨碍结果的判读36。使用移动应用程序可为样本检测提供更多阳性结果，因为移动应用程序显著提高了样本检测的灵敏度46。值得注意的是，尚需进一步与登革病毒NS1的分子检测方法（如RT-PCR15,47,48）进行比较，以确定是否存在潜在的假阳性或假阴性结果。
当考虑血液等更复杂的样本基质时，本研究的一个显著局限性便显现出来。血液中存在的成分可能会干扰该装置的检测限。在此类情况下，使用额外的吸水垫以增强运行缓冲液的吸收是一种潜在的解决方案。这种改进可促进血液凝固，利用纤维素的止血特性，通过影响血小板实现49。另一种方法是在样本垫上施加4% (w/v)的生理盐水液滴，以增强血液凝固。先前的研究表明，氯化钙和氯化钠等盐类可诱导红细胞（RBC）凝集50,51。Na+可通过抑制红细胞表面的双电层并降低红细胞之间的电荷排斥作用，使血液中红细胞的悬浮状态失稳。此外，高浓度的盐也会诱导血液聚集52。同时，Na+的反离子价态电荷会削弱红细胞带电双电层的厚度，导致红细胞脱水聚集。添加4% (w/v)的生理盐水溶液（NaCl）有助于在纤维素纸上实现血浆分离51。然而，必须谨慎优化盐浓度，以避免对血液聚集和金纳米颗粒聚集产生不良影响53,54。
商用蜡印打印机在原型制作的成本和简便性方面提供了理想组合。由于这些打印机已于2016年停产，因此需要采用其他制造方法，例如喷墨打印55、丝网打印56和光刻技术57。办公用碳粉打印机是制造微流控纸分析装置（µPAD）的良好选择。在200 °C下加热60分钟，碳粉中的聚酯树脂可形成具有多种设计的疏水图案58。
本研究中使用的抗体NS1血清型二由公司指定。然而，我们发现该抗体也可与所有其他血清型发生交叉反应36,37。针对DENV-4的检测灵敏度较低（87.5%），相较于其他血清型。DENV-1和DENV-2的检测灵敏度约为88.89%，DENV-3则为100%37。这些结果与先前研究一致，后者也报道了快速诊断试验（RDT）对DENV-4的灵敏度低于其他血清型59。该检测设备的总体灵敏度约为88.89%，特异性约为86.67%。值得注意的是，DEN-NS1-PAD的实际灵敏度可能高于商用RDT。然而，RDT的阳性预测值（PPV）为84.62%，准确率为87.67%。值得注意的是，DEN-NS1-PAD在感染最初5至6天内检测登革病毒感染的表现更优，而RDT仅在前5天内有效37。
综上所述，将便携式纸质免疫分析法（DEN-NS1-PAD）与智能手机应用程序相结合，在登革病毒NS1检测方面具有广阔的应用前景。与肉眼观察相比，该移动应用程序在定量血清样本中的NS1时显著提高了检测的灵敏度和效率。该应用程序的优势包括缩短分析时间、操作简便，以及在不同智能手机设备、检测位置和光照条件下均具有良好的兼容性。然而，仍需进一步优化以提升其灵敏度和整体性能。同时，有必要对纸质免疫分析法进行改进，以提高其在处理血液样本时的检测性能。此外，还需开展更全面的评估，采用更多数量的原发性感染血清型以及来自不同患者（儿童和成人）的选定样本，进一步验证DEN-NS1-PAD在登革病毒检测中的应用价值。

登革病毒（DENV）感染是传播速度最快的蚊媒疾病1，全球每年有超过3.9亿人感染，其中9600万例出现临床症状，200万例发展为重症，死亡人数超过2.5万1,2。根据世界卫生组织（WHO）估计，约有39亿人面临登革热感染风险，其中约70%分布在亚太地区，主要集中在东南亚3。2019年，向世界卫生组织报告的登革热病例数达420万例，其中泰国报告至少13.6万例登革热病例，因登革病毒感染导致144例死亡4。泰国的登革热疫情每年均发生在雨季，时间为4月至12月，城市和农村地区均有暴发，尤以东北部地区为甚。
登革病毒（DENV）感染具有多种临床表现，从无症状、轻度登革热（DF）到重度登革出血热（DHF）不等。重度DHF的主要特征是血管通透性增加，继而引发休克和器官功能障碍1。了解可导致血管渗漏的分子通路，对于开发有效的登革热治疗方法至关重要。登革病毒非结构蛋白1（NS1）是在病毒感染早期分泌的一种糖蛋白5,6，其功能是作为病毒RNA复制的辅助因子7。NS1可通过与Toll样受体4（TLR4）和内皮细胞糖萼结合，触发细胞因子释放，从而导致血管渗漏8,9。体外研究表明，NS1可与内皮细胞相互作用并诱导细胞凋亡，这一状况可能导致内皮功能障碍和血管渗漏10。在重症患者中，NS1抗原水平显著升高，并与血清白细胞介素（IL）-10水平呈正相关11。登革病毒NS1还可通过诱导IL-10表达并抑制DENV特异性T细胞反应，参与疾病发病机制12,13。此外，登革病毒NS1蛋白与重症临床疾病相关，疾病前3天内NS1浓度&#62; 600 ng mL-1 与DHF的发生密切相关14。
登革热NS1抗原在登革出血热（DHF）患者体内的持续存在可作为重症登革热的标志物6。目前已有多种方法可用于临床样本中NS1的检测，例如酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速检测法15。在临床环境中，测定NS1蛋白浓度的金标准方法是ELISA法。然而，ELISA方法成本较高，且需要专业技术人员和实验室设施16。因此，针对即时检测（POCT）中NS1蛋白的检测与定量技术的开发仍在持续进行。在过去十年中，基于纸张的免疫分析方法，如侧向流动检测（LFAs）和微流控纸基分析装置（µPADs），因其操作简便、检测快速、成本低廉和特异性高而成为广受欢迎的诊断工具17,18,19。在基于纸张的免疫分析中，已采用多种标记物来产生信号，例如金纳米颗粒（AuNPs）20、磁性纳米颗粒21,22、量子点23以及荧光材料24,25。其中，AuNPs由于其生产成本低、易于制备、稳定性好以及信号读取简单，成为纸基免疫分析中最常用的标记物。目前，用于登革热NS1检测的侧向流动检测（LFAs）已在临床实践中广泛应用26,27。然而，传统的LFA标记检测通常依赖肉眼观察，仅能提供定性结果。
在过去十年中，全球已广泛使用超过50亿部智能手机，这为开发便携式检测技术提供了巨大潜力28,29。智能手机具备多种功能，如内置物理传感器、多核处理器、数字摄像头、USB端口、音频接口、无线通信功能以及应用程序软件，使其适用于多种生物传感器平台30。此外，无线技术可实现数据的快速传输，适用于实时和现场监测31。Mudanyali 等人将基于纸张的免疫分析技术与智能手机结合，开发出一种便携、无需额外设备、快速、低成本且用户友好的疟疾、结核病和艾滋病即时检测（POCT）平台32。Ling 等人报道了一种结合智能手机摄像头的侧向层析检测方法，用于定量检测牛奶中的碱性磷酸酶活性33。Hou 等人也开发了一种基于智能手机的双模成像系统，可对侧向层析检测中的颜色或荧光信号进行定量分析34。此外，将智能手机用作比色和定量读取设备，可在肉眼无法可靠判断目标物是否存在时，显著提高检测灵敏度35。
登革热诊断领域的一项突破性进展——DEN-NS1-PAD36,37,38（下文简称设备），提供了一种便携且高效的解决方案。该设备采用蜡印微流控纸质芯片技术，通过图像处理实现对NS1蛋白的高灵敏度和高特异性定量检测。为进一步提升其实用性，我们开发了一款用户友好的智能手机应用程序，用于比色和定量读数。利用来自泰国医院患者的临床样本进行的验证，凸显了该设备在实时患者评估中的即时应用价值。本项创新标志着登革热即时诊疗管理的重要进步，有望在资源有限的医疗环境中彻底改变诊断模式。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含0.1% Tween 20、10%蔗糖和1%酪蛋白的硼酸盐缓冲液（BBS）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;结合区处理及封闭缓冲液</td></tr><tr><td>硼酸盐缓冲液（BBS）（25 mM 硼酸钠和150 mM 氯化钠，pH 8.2），添加1% BSA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>抗体与AuNPs结合过程中的洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>PAA Lab GmbH（德国）</td><td>K41-001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Merck</td><td>9005-46-3</td><td></td></tr><tr><td>2号层析滤纸&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>3002-911&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>透明覆膜</td><td>3M（文具店）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>文具店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠IgG抗体&amp;nbsp;</td><td>MyBiosource（美国）</td><td>MBS435013</td><td></td></tr><tr><td>金纳米颗粒（40 nm）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Serve Science Co., Ltd.（泰国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人IgG多克隆抗体&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>AG711-M</td><td></td></tr><tr><td>小鼠登革病毒NS1单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>MyBiosource（美国）</td><td>MBS834415</td><td></td></tr><tr><td>小鼠登革病毒NS1单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>MyBiosource（美国）</td><td>MBS834236</td><td></td></tr><tr><td>NS1 2型血清型抗原</td><td>MyBiosource（美国）</td><td>MBS 568697</td><td></td></tr><tr><td>含0.1% Tween 20的1× PBS用作</td><td></td><td></td><td>洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>塑料背板（10×30 cm）</td><td>Pacific Biotech Co., Ltd.（泰国）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Merck</td><td>104877</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1303-96-4</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 5 多功能酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手机</td><td>Huawei Y7、iPhone 11、Samsung a20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平板扫描仪</td><td>Epson Perfection V30</td><td></td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蜡质打印机&amp;nbsp;</td><td>Xerox ColorQube 8880-PS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Google Cloud AutoML Vision 目标检测文档</td><td>Google Cloud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkscape 0.91 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

便携式纸质免疫分析法结合智能手机应用程序用于登革病毒ns1抗原的比色与定量检测

Portable Paper-Based Immunoassay Combined with Smartphone Application for Colorimetric and Quantitative Detection of Dengue NS1 Antigen

登革病毒（DENV）感染由伊蚊（Aedes）传播，是热带和亚热带国家重要的公共卫生问题。该病每年约有1000万例发病，导致20,000至25,000例死亡，尤其在儿童中较为严重，因此迫切需要实用的诊断工具。在感染早期阶段，登革病毒非结构蛋白1（NS1）的存在与细胞因子释放、血管渗漏以及内皮功能障碍相关，使其成为重症登革热的潜在标志物。
基于纸张的免疫分析方法，如侧向流动分析（LFAs）和微流控纸基分析装置（PADs），因其操作简便、快速、成本低廉、特异性强且易于解读，已广泛用作诊断检测手段。然而，传统的用于登革病毒NS1检测的纸基免疫分析通常依赖肉眼观察，仅能提供定性结果。为克服这一局限性并提高检测灵敏度，我们开发了一种高度便携式的登革病毒NS1检测方法——纸基分析装置（PAD）上的DEN-NS1-PAD，该方法结合智能手机应用程序作为比色和定量读取工具。该系统可直接对临床样本中的NS1浓度进行定量分析。
采集自患者的血清和血液样本被用于验证该系统原型的性能。结果可即时获得，适用于设备完善的医疗机构以及资源有限环境下的临床评估。这种基于纸质的免疫测定法与智能手机应用程序的创新结合，为登革病毒NS1抗原的增强检测与定量提供了有前景的解决方案。通过提升超越肉眼观察能力的检测灵敏度，该系统在改善登革热管理的临床决策方面具有巨大潜力，尤其适用于偏远或医疗资源匮乏地区。

选择合适的制备方法对于确保基于纸张的免疫分析装置具有可重复的检测性能至关重要。在本研究中，我们探索了多种制造工艺和材料，以展示一种基于纸张的免疫分析方法。我们所采用的方法利用蜡印系统在基于纸张的微流控装置中构建疏水屏障。该方法因其操作简便、快速且结果稳定而具有显著优势。值得注意的是，该方法避免了使用可能干扰蛋白质吸附并增加纤维素纸疏水性的光刻胶化学品。此外，蜡印技术能够确保流体通道尺寸的一致性，从而有助于实现可重复的检测性能。
形成疏水屏障后，将免疫测定所需的试剂施加到纤维素纸表面。通过静电吸附作用，PLL通过与胺基的正电荷以及抗体的负电荷相互作用，促进生物分子的固定。该步骤有助于在制造过程中实现抗体的修饰与固定，以及标记-抗体结合物的应用。重要的是，该步骤可并行进行。通过将修饰后的纸片叠加到带有黏性的塑料背板上，并用塑料薄膜封合，完成纸质免疫测定装置（DEN-NS1-PAD，如图1A所示）的组装。
本研究的主要目的是开发一种利用智能手机检测NS1浓度的用户友好型方法。该方法可作为居家和临床环境中的即时检测（POCT）设备使用。鉴于患者血清中NS1浓度范围较广，本研究基于实验结果采用了简单的线性模型。针对每个NS1浓度，制备了包含三个检测装置的数据集。在标准设置和最佳光照条件下，使用智能手机拍摄装置照片，无需使用暗箱。纸基微流控芯片（PADs）的检测区含有鼠源登革病毒NS1单克隆抗体，质控区则含有 goat anti-mouse IgG 抗体。采用夹心式检测模式，样本中NS1浓度越高，检测区红色颜色强度越强；而质控区的颜色强度则相对恒定。图1B展示了未经处理的智能手机拍摄图像，无需特殊设备即可实现良好的视觉观察效果。
通过专用的移动应用程序，我们对血清样本中 spiked NS1 浓度的信号强度进行了归一化处理，并建立了简单的线性模型——由该移动应用程序获得的系数相关性（r2）。移动应用程序获得的系数相关性（r2）为 0.92（图 3），符合预期。这种基于智能手机的方法优于肉眼观察，灵敏度显著提高了 178%。此外，针对归一化后的信号强度，计算了空白限（LoB）、检出限（LoD）和定量限（LoQ），结果如表 1所示。
采用真实世界的临床样本以验证DEN-NS1-PAD在临床环境中的实际功能。基于纸质的免疫测定法在20至30分钟内产生定性的颜色读出结果，可直接通过肉眼判断阴性或阳性。来自疑似登革病毒感染患者的血清样本被用于该检测设备。图4展示并比较了该设备与商用快速诊断试剂盒（RDT）所获得的结果。表2总结了目视判读结果及基于智能手机系统的分析结果。商用RDT与该设备的目视判读结果相似，均显示7例阳性与23例阴性。相比之下，仅用于该设备的基于智能手机的读取系统在临床样本中报告了9例阳性与21例阴性结果。
<img alt="色谱图示，展示流穿过程，标有样品施加区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：设计并制备的DEN-NS1-PAD图像。（A,B）单个通道来自蜡图案化的疏水屏障，分别描绘了三种状态：（C）加样前，以及（D,E）将样品溶液引入指定区域后的状态，分别显示（D）阴性结果和（E）阳性结果。样品溶液通过毛细作用沿通道移动（见标注箭头），依次与关键位置的组分发生反应——在结合区与AuNPs-Ab反应，在检测区与抗NS1抗体反应（提示登革病毒NS1阳性），在质控区与抗小鼠IgG反应。结果可通过肉眼直接观察，并可通过平板扫描仪或智能手机摄像头进行图像处理实现定量分析。缩写：AuNPs-Ab = 金纳米颗粒-抗体偶联物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="登革热NS1 PAD应用程序界面，展示逐步分析和结果：从数据输入到结果显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：手机移动应用程序界面截图。（A）在手机设备上运行的Android应用程序用户界面，（B）应用程序界面显示，（C）用户可选择使用摄像头或从图库上传图像的应用程序主菜单，（D）用于测试的相关图像显示，（E）分析倒计时时间的显示，（F）测试结果的显示，包括检测线和质控线的信号强度、感染判断结果（阳性/阴性）以及样本中NS1的浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="标准化信号与NS1浓度的线性回归图，y=0.3701x+0.0128，r²=0.9248。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：血清中NS1检测的线性校准曲线。 使用该设备并通过基于智能手机数据的应用程序进行图像分析。误差线表示±1个标准差，n = 3。缩写：T = 检测区；C = 质控区。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果；碘-淀粉试验；显示频率分析的示意图和柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66130/66130fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：临床样本检测中 DEN-NS1-PAD 的图像。 使用血清（50 µL）进行基于纸张的免疫分析。（A）阴性结果示例，（B）阳性结果，（C）总体结果及快速诊断试验（RDT）与基于纸张的免疫分析的比较。缩写：RDT = 快速诊断试验；Pos = 阳性；Neg = 阴性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66130/66130fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>肉眼观察</td>
			<td>手机应用程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空白限（LoB）</td>
			<td>-</td>
			<td>43.15 ng mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检出限（LoD）</td>
			<td>200 ng mL-1</td>
			<td>112.19 ng mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>定量限（LoQ）</td>
			<td>-</td>
			<td>373.58 ng mL-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：ImageJ 和移动应用程序对血清中 NS1 数据校准标准的空白限、检出限和定量限。 缩写：LoB = 空白限；LoD = 检出限；LoQ = 定量限。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">患者编号</td>
			<td colspan="2">肉眼观察</td>
			<td>智能手机应用程序</td>
			<td>ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDT</td>
			<td colspan="3">纸质免疫分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：血清样本的目视读取结果与基于智能手机的读取系统结果比较。 (+) 和 (-) 分别表示结果判读为阳性与阴性。

针对紧迫的登革热诊断需求，本文介绍了一种与智能手机应用程序集成的基于纸张的登革热NS1抗原检测装置（DEN-NS1-PAD），可用于定量临床血清/血液样本中的登革热NS1抗原浓度。该创新技术有助于在各类医疗环境中进行临床决策，即使在资源有限的地区也能提升登革热的管理水平。

便携式纸质免疫分析法结合智能手机应用程序用于登革病毒NS1抗原的比色与定量检测

登革病毒（DENV）感染由伊蚊传播，是热带和亚热带国家重要的公共卫生问题。随着……

本研究的范围是利用基于纸张的分析装置，通过特异性生物标志物NS1检测登革热。我们的研究重点是开发一种简单、廉价、灵敏且特异的登革热检测装置。我们还开发了智能手机应用程序，以提高对实际样本中NS1检测的灵敏度和测量精度。我们的研究重点是开发一种基于PEC公式的微流控器件制备方法。这一创新技术旨在推动多种PEC设计的商业化，为实际应用提供可扩展的解决方案。本研究将PEC技术与智能手机应用程序相结合，在登革病毒NS1抗原检测方面展现出巨大潜力。相比肉眼观察，该移动应用程序显著提高了对血清样本中NS1抗原检测的灵敏度和效率。该方案简单、经济且可重复，可用于制备检测登革病毒NS1的纸基电化学传感器（PEC）。该PEC对登革病毒NS1具有高灵敏度和特异性，与智能手机联用后灵敏度将进一步提高。我们的目标是通过血液样本提升登革病毒NS1检测性能，评估交叉感染的细胞类型，并将其孵育于纸质微流控装置中，以实现多种疾病的联合检测。解决技术文化趋势对于推动所有疾病筛查和医疗护理的成功商业化至关重要。首先，在计算机上设计一种带有18个蜡图案的纸质分析装置。然后使用蜡打印机将该设计打印到纤维素纸上。将蜡印纸在实验室烘箱中于150摄氏度下熔化75秒。熔化后，将纸张存放在硅胶盒中，以备后续使用。随后，用移液器向装置的测试区域和对照区域各加入0.5微升0.025%的多聚赖氨酸。然后将装置置于65摄氏度的烘箱中孵育5分钟。向对照区和检测区各加0.5微升相应的抗体溶液。将液滴置于室温下的硅胶干燥箱中干燥30分钟。接下来，将封闭缓冲液加入样品结合区和检测区。将这些液滴置于室温下的硅胶干燥箱中干燥30分钟。将10微升抗NS1一抗抗体加入1毫升40纳米摩尔的金纳米颗粒胶体中，混匀。然后加入 0.1 毫升 0.1 摩尔的硼酸盐缓冲液。将混合物以 50 转/分钟旋转 60 分钟。用移液器将 0.1 毫升 BBS 中的 BSA 加入该混合物中。孵育前再次旋转。在4 °C条件下以20,187 G离心溶液30分钟。然后小心地将上清液从沉淀的金纳米颗粒抗体溶液中分离。将沉淀物重悬于500微升BBS中。接着，超声处理溶液以分散纳米颗粒。离心后，向悬浮液中加入50微升偶联缓冲液。然后将2 µL金纳米颗粒-抗体复合物溶液用移液器滴加至结合垫区域。组装纸质免疫测定装置时，小心地从粘性塑料背板卡片的背面揭去保护膜，以露出粘合面。将处理过的纤维素纸与粘性塑料背板卡片对齐，并轻轻按压固定。在纸张上覆盖一层塑料薄膜，并将薄膜与纸张压合在一起，以形成涂层表面。设计并制备了一种单通道免疫测定装置，样品溶液通过毛细作用沿通道渗透，并在关键位点与组分发生反应，从而产生可见的诊断结果。首先，将30名患者入院第一天采集的300微升外周血转移至紫色盖子的EDTA管中。在4°C条件下，以2884 G离心血液20分钟。将血浆转移至洁净的聚丙烯管中。随后，取20 µL血浆加入免疫分析装置的加样区域。现在用移液器将30微升洗涤缓冲液加入样本区域。待样本完全浸润检测装置后，用智能手机拍摄装置的图像。使用ImageJ和定制的移动应用程序分析检测区和对照区，以在移动应用程序中定量测定实验信号强度。在智能手机上启动开发的移动应用程序，选择使用相机或从图库上传，以选取或上传数据源。随后进入分析部分并点击“分析”。应用程序将处理数据并显示结果。基于纸张的免疫分析装置能够快速诊断登革热，其效果类似于一种 commercially available 的诊断检测方法。

portable-paper-based-immunoassay-combined-with-smartphone-application

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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