多重循环荧光免疫组织化学
2024年1月26日
多重循环免疫组织化学技术能够 原位 通过重复的抗原-抗体孵育、图像扫描以及图像对齐与整合，实现多种标志物的同步检测。本文介绍了利用该技术在肺癌及配对的脑转移样本中鉴定免疫细胞亚群的操作流程。
免疫组织化学的挑战在于选择合适的一抗和二抗单克隆抗体的物种来源，以避免交叉反应并获得更高的特异性，同时确保抗体的可靠性。必须进行标准化以优化抗体的稀释比例。与此同时，另一个挑战是精确对准受精卵细胞的位置及其亚细胞结构的定位。
本方案的使用符合技术发展，可用于分析三种淋巴细胞亚群的分布情况，即CD3阳性、CD3和CD8双阳性以及CD20阳性细胞。该分析基于C细胞计数及保守组织中的蛋白表达水平，同时亦可观察淋巴细胞浸润程度。
在我们的实验方案中，一抗和来自不同物种的荧光标记二抗被稀释成混合液，从而提高了实验效率。该混合液还可确保抗体与抗原之间的特异性结合。我们旨在研究肺癌脑转移过程中肿瘤微环境的重编程。
以及肿瘤浸润淋巴细胞与肿瘤细胞之间的细胞间相互作用。首先，获取原发性肺癌或肺癌脑转移组织。将肿瘤组织包埋在成对的石蜡块中，并使用切片机进行切片。
将其切成四微米厚的切片。将切片放入水中。用镊子挑选最佳切片，并将其贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
为增强组织黏附性，将载玻片置于65摄氏度的烘箱中孵育30分钟。进行脱蜡时，将载玻片浸入二甲苯，随后依次浸入浓度递减的乙醇溶液。然后用去离子水洗涤3分钟。
接下来，将玻片浸入柠檬酸钠缓冲液中。将玻片置于压力锅中进行高温高压处理，然后在蒸馏水中冷却至室温，持续三分钟。最后，用PBS洗涤玻片三次，每次五分钟。
首先，获取先前准备好的载有癌组织切片的玻片。配制一抗工作液混合物。将抗体复合物加至玻片切片上，并在室温下孵育一小时。
然后用含0.1%吐温的PBS缓冲液洗涤载玻片三次，每次五分钟。配制荧光标记的二抗混合液，将其逐滴加到载玻片上，在室温下避光孵育一小时。
然后在室温下进行第二轮一抗孵育，持续一小时。用含0.1% TWEEN的PBS溶液洗涤切片三次，每次五分钟，并用滤纸从组织边缘去除多余的水分。同样地，进行第二轮二抗孵育，并按照之前所示方法进行洗涤。
一分钟后，向组织中加入高锰酸钾试剂，用流水冲洗五分钟。随后用浓度递增的酒精进行脱水。最后加入 DAPI 完全覆盖组织切片，并加盖盖玻片用于多光谱成像。
多重免疫荧光成像显示，在肺癌脑转移组织中存在 CD3 阳性、CD8 阳性及 CD20 阳性细胞。
概述
本文介绍了一种用于多重循环免疫组织化学的实验方案，可实现对肺癌及脑转移样本中多个标志物的同步检测。该方法解决了抗体特异性以及免疫细胞亚群定位方面的技术难题。
关键研究要素
科学领域
- 免疫组织化学
- 肿瘤学
- 神经科学
背景
- 免疫组织化学需要谨慎选择抗体，以防止交叉反应。
- 抗体稀释的标准化对于获得最佳结果至关重要。
- 细胞结构的对齐是实现准确分析的必要条件。
- 本方案重点研究癌组织中的淋巴细胞亚群。
研究目的
- 提供多重循环免疫组织化学的详细实验方案。
- 提高在癌症样本中免疫细胞检测的特异性。
- 促进对肺癌及脑转移灶中淋巴细胞浸润的研究。
使用的方法
- 重复抗原-抗体孵育。
- 图像扫描与比对。
- CD3、CD8 和 CD20 阳性淋巴细胞的检测。
- 在保守组织中进行蛋白质表达分析。
主要结果
- 成功鉴定肺癌中的免疫细胞靶标。
- 展示淋巴细胞浸润水平。
- 有效可视化多种免疫标志物。
- 标准化提高了可重复性和特异性。
结论
- 该方案有助于加深对癌症中免疫反应的理解。
- 多重循环免疫组织化学是研究人员的一种有价值工具。
- 未来的研究可在此方法学基础上进一步推进癌症研究。
常见问题
行业重要性概述
多重循环荧光免疫组织化学技术可实现对肿瘤微环境中免疫细胞亚群及蛋白质靶标的高通量空间分析，有助于转化肿瘤学和免疫治疗研究。该方法通过量化临床相关组织中淋巴细胞的浸润程度及细胞间相互作用，提高靶点验证和机制去风险化研究的预测可信度。其可重复性和多重检测能力使其成为早期发现及转化研究管线中项目筛选和生物标志物驱动决策的关键技术。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可对肿瘤组织中的免疫细胞亚群及靶蛋白进行空间分辨的检测分析。
- 通过阐明免疫-肿瘤相互作用及淋巴细胞浸润模式，支持机制层面的风险评估。
- 有助于提高免疫肿瘤学项目中靶点选择的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的FFPE组织系统，用于下游多重标志物分析。
- 标准化抗体选择与稀释流程，确保结果可重复并获得定量数据。
- 实现稳定且可扩展的工作流程，适用于免疫标志物筛选及比较研究。
转化与临床前研究
- 将免疫谱分析与疾病相关模型相结合，例如肺癌和脑转移组织。
- 通过原位定量淋巴细胞亚群，支持转化生物标志物的开发。
- 为免疫靶点从发现到临床前验证的全过程提供连贯性支持。
流程与工作流整合
这种多重免疫组织化学工作流程通过实现对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中免疫特征的定量、空间分辨分析，连接了早期发现、靶点验证和转化研究。
- Discovery Biology：支持对免疫细胞分布和肿瘤微环境重编程的假设验证。
- Screening：提供可重复的定量标志物检测，用于检测方法的准备和比较分析。
- Analytics：提供细胞计数和蛋白质表达数据，以支持不同条件间的比较分析。
- Translational Research：将免疫标志物的定量结果与疾病模型对齐，确保生物标志物的一致性。
- Enterprise Reuse：提供标准化的多重检测平台，可适应多种组织类型和研究问题。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强免疫分析工作流程的可重复性、标准化程度和可扩展性。
- 战略价值：通过实现基于可靠生物标志物的有效分诊，优化“推进/终止”决策并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对免疫肿瘤学资产进行基于风险调整的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备免疫组织化学、抗体验证和荧光成像方面的专业知识。
- 需要获得经过验证的抗体、FFPE 组织处理技术以及多光谱成像基础设施。
- 需要跨团队统一抗体选择、稀释比例和成像方案的标准。
- 针对不同组织类型或免疫标志物组合，可能需要进行方法调整。
- 信噪比优化和避免交叉反应对于获得可靠结果至关重要。
