双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

我们主要关注大脑中结构与功能之间的关系，特别是微环路层面的相互作用。我们经常采用分离神经元细胞培养等简化实验体系，因为它们是研究电活动、突触传递以及集体状态产生机制的宝贵模型。我们提出的方法适用于快速制备微米级聚合物器件。

该方法可立即用于培养皿中模块化神经网络的实验研究，且无需在软光刻技术方面具备高深的专业技能。本方法及我们简单的概念验证实验，使得模块化神经网络的设计成为可能，从而能够定义其结构并控制生物信号的传递。药物筛选以及对病理状态的研究将直接得益于这些复杂的体外神经元网络。

首先，从顶部菜单栏启动设计软件桌面应用程序，选择“新建”，然后选择“零件”，即单个设计组件的三维表示。为确定草图的俯视图，请按 Ctrl 键和数字 5。从侧边栏中选择“草图”，然后选择“角矩形”。

单击矩形的一条边，在参数面板中将长度设置为 100 个单位，并将垂直边的长度设置为 50 个单位。按住鼠标左键拖动以框选该矩形并选中它。在“添加关系”菜单中，选择“固定”以约束各线条之间的关系。

从侧边栏创建一个新的小重叠矩形后，选择特征并选择拉伸基体。将大矩形的深度设置为5，小矩形的深度设置为10个单位。遵循这些基本原理，可以设计出更复杂的对象。

最后，从文件菜单中将部件以 STL 格式保存。首先，生成并处理以 STL 格式保存的计算机辅助设计文件。将玻璃基板放置在支架上。

使用电子万用表确认玻璃基板上涂有氧化铟锡（ITO）的一侧朝上，并用胶带将玻璃片完全固定。在化学通风橱内，将一滴IPS光刻胶滴加至玻璃基板中心，然后将载物片插入3D打印机，使树脂液滴朝向物镜。通过软件的文件菜单加载GWL文件，选择“接近样品”，然后选择“寻找界面”。

选择“开始作业”以启动打印，完成后按“更换基板”。轻轻取下带有打印部件的基底，并在通风橱中将玻璃基底依次浸入PGMEA和异丙醇中孵育。对空气干燥后的打印部件进行固化时，需暴露于365至405纳米的紫外光下照射5至20分钟。

在超净工作台内，轻轻将打印好的部件从玻璃基底上取下，并将其放置于培养皿中一滴两微升的树脂液滴上。经过五分钟的紫外光照射后，盖上培养皿，并在80摄氏度下孵育30分钟。首先，使用双光子聚合技术打印一个三维模具，并将其固定在培养皿上，该培养皿现称为模具。

制备装置时，将模具与10微升疏水剂孵育7分钟，然后用70%乙醇冲洗，再用去离子水冲洗两次。将先前配制好的PDMS混合物轻轻加至模具上，直至达到装置预定的最终高度。将覆盖好的模具置于预热至80°C的烘箱中孵育18分钟。

然后在层流罩内轻轻将固化的PDMS块从模具上剥离，放入玻璃培养皿中的异丙醇中浸泡10分钟。在体视显微镜下，使用眼科穿刺刀小心切割出中央的方形区域，然后沿器件边缘进行切割。随后将器件浸入乙醇中30分钟。

在超净工作台内，将装置转移至新的培养皿中并使其干燥。首先，获取一个3D打印的模具，并制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置。为对微电极阵列（MEA）进行灭菌，将其浸入70%乙醇中30分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次。

使用无菌精细镊子，在体视显微镜下将PDMS装置安装到MEA的内侧区域。将PDMS装置的一侧与MEA内侧区域的中心对齐。在通风橱内，向MEA中加入1毫升0.1%聚乙烯亚胺溶液，并在37摄氏度下孵育过夜。

用去离子水冲洗MEA五次后，加入1毫升细胞培养基，将MEA置于37摄氏度培养。接着，将含有180万个从幼鼠脑组织中分离的神经元细胞的1毫升培养液接种到MEA上，并进行培养。首先，使用3D打印的模具制备PDMS装置。

将神经元细胞接种于安装在PDMS上的MEA中。将MEA轻轻安装至置于干燥37摄氏度环境中的多通道电子放大器的头部支架内，孵育10分钟。启动实验者软件，将采样率设置为25千赫兹，然后点击开始数据采集以启动数据记录。

在数据展示面板中，显示每个通道记录的细胞外活动的原始轨迹。进入软件的刺激器面板，选择三对在网络级爆发期间有活性的相邻微电极，并选择双相脉冲波形。将峰值幅度设为 800 毫伏，脉冲持续时间设为 200 微秒。

为实现双极配置，需选择并设定相邻电极的参数值。最后，将记录器设置为刺激前300毫秒、刺激后1000毫秒，并按下“开始数据采集”以启动记录。活体成像显示，荧光标记的神经突从微通道中的源端向靶端延伸生长。

电生理学分析表明，在模块化神经元网络中，源和靶的诱发电反应具有不对称性，而未使用PDMS的对照组则未表现出这种模式。