Name: 微尺度神经元细胞培养装置的双光子聚合3D打印 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用双光子聚合3D打印技术制造微尺度神经元细胞培养装置，用于体外模块化神经网络研究。该方法通过精确控制物理结构来调控神经元信号传导，为神经科学和疾病建模提供新工具。

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M.G. 感谢欧洲创新理事会（欧洲创新理事会前沿技术项目，编号 862882，Arbor-IO 项目，FLAG-ERA 以及人脑计划，编号 650003）通过欧盟“地平线2020”框架计划以及国际高级研究学院（SISSA，神经科学领域）提供的经费支持。G.N. 感谢意大利大学与研究部（MUR）通过“卓越学科计划 2018–2022”（数学领域）提供的经费支持。我们感谢 M. Gigante、B. Pastore 和 M. Grandolfo 在 3D 打印、细胞培养和活体成像方面的协助，同时感谢 P. Massobrio 博士、P. Heppenstall 博士、L. Ballerini 博士、Di Clemente 博士和 H.C. Schultheiss 博士的有益讨论。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

所有涉及动物操作的实验程序均依照欧洲及意大利法律法规进行（2010年9月22日欧洲议会和理事会指令[2010/63/EU]；2014年3月4日意大利政府法令第26号），并已明确获得高等国际研究学院动物护理委员会（OpBA）的批准，同时获得意大利卫生部的正式授权（授权号：22DAB.N.UVD）。上述程序获得了来自切除大鼠脑组织的非感知性材料，用于本研究中所提出方法的实验验证。
1. 通过双光子聚合制备三维模具
<ol>
	<li>生成 CAD 文件 
	注意：以下步骤演示了一种通用的 3D 设计工作流程，使用计算机辅助设计软件（例如 SolidWorks）。本研究中描述的示例 STL 设计文件（图 2）可作为补充代码文件 1获取，也可通过 Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110）获取。&#160;
	<ol>
		<li>启动计算机辅助设计软件桌面应用程序。从顶部菜单栏中选择新建。</li>
		<li>在选项中选择零件：单个设计组件的 3D 表示。按下Ctrl + 5键组合以建立草图的俯视图。</li>
		<li>从侧边栏中选择草图，然后选择角矩形。通过单击选择矩形的一条边。当参数面板出现时，将长度设置为 100 个单位。</li>
		<li>对与前一条边垂直的边重复步骤 1.1.3：将其长度设置为 50 个单位。通过按住鼠标左键并拖动来选中整个矩形。</li>
		<li>在添加关系菜单中选择固定，以约束线条之间的几何关系。</li>
		<li>退出草图，并重复步骤 1.1.3 至 1.1.5，创建一个新的（较小的）矩形，与前一个草图重叠。</li>
		<li>从侧边栏中选择特征，然后选择拉伸凸台/基体：将大矩形和小矩形的深度分别设置为 5 和 10 个单位。</li>
		<li>在文件菜单中，将零件保存为 STL 格式（即标准三角剖分语言）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CAD 文件处理
	<ol>
		<li>将 STL 文件传输至配备 DeScribe 应用软件的个人计算机。</li>
		<li>启动Describe，在其文件菜单中打开 STL 文件。模型的 3D 表示将显示出来。</li>
		<li>在右侧菜单的方位部分，旋转模型以在空间中正确取向，并将其在平面上居中。</li>
		<li>通过选择右侧菜单中的缩放部分来调整整体缩放比例。</li>
		<li>从顶部的下拉菜单中选择IP-S 25x ITO Shell (3D MF) 配方。该设置指定 IP-S 为光刻胶，25x 为物镜放大倍数，氧化铟锡（ITO）涂层基底为打印基底，壳层与支架打印为运行模式，中等尺寸特征（MF）为特征尺度。</li>
		<li>按照向导操作，在壳层和支架部分均将切片距离设置为 1 µm，扫描间距设置为 0.5 µm。</li>
		<li>在导入向导的输出步骤中，在“分割”部分定义区块大小为 X = 200 µm，Y = 200 µm，Z = 265 µm，区块偏移为 X = 133 µm，Y = 133 µm，Z = 0，以确保微通道的精细结构不受拼接线影响。</li>
		<li>扫描模式采用默认设置：X-Y 平面使用 Galvo，Z 轴使用 Piezo。</li>
		<li>点击保存，在接下来的文本菜单中，将 var $baseLaserPower = $shellLaserPower 替换为 var $baseLaserPower = 75，以将打印最底层的激光功率降低至 75%。</li>
		<li>将上述步骤生成的 GWL 文件传输至专用于双光子聚合（2PP）3D 打印的工作站。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D 打印与样品显影
	<ol>
		<li>启动NanoWrite应用软件。打印机初始化后，点击软件界面上的更换样品台，插入样品台并安装物镜。</li>
		<li>将 25x 物镜安装到物镜转换器的适当位置。使用设置为测量电阻的电子万用表识别玻璃基底哪一侧涂有 ITO：仅在 ITO 涂层侧会测得较低阻值，如 100–300 Ω。</li>
		<li>将玻璃基底放置在样品台上，使 ITO 涂层侧朝上。使用胶带将其牢固固定。</li>
		<li>在化学通风橱内，将一滴 IP-S 光刻胶滴加至玻璃基底中心。</li>
		<li>将样品台插入 3D 打印机，使树脂液滴面向物镜（即朝下）。</li>
		<li>通过软件的文件菜单加载 GWL 文件。选择接近样品，使物镜靠近树脂液滴。</li>
		<li>选择查找界面，以基于两种材料折射率的差异检测 ITO-光刻胶打印界面。</li>
		<li>选择开始任务以启动打印。打印完成后，按下更换样品台以取出样品台。</li>
		<li>取出样品台，小心取下带有打印结构的基底。将玻璃基底浸入丙二醇甲醚乙酸酯（PGMEA）中，在通风橱内显影 20 分钟。</li>
		<li>将基底从 PGMEA 中取出，再浸入异丙醇中 5 分钟。在化学通风橱内让打印结构自然风干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印后处理与模具安装
	<ol>
		<li>通过紫外光（即 365–405 nm）照射对打印结构进行固化，功率足够时照射 5–20 分钟（具体功率详见讨论部分）。</li>
		<li>在层流洁净台内，小心地将打印结构从玻璃基底上剥离。在 35 mm × 10 mm 培养皿底部滴加约 2 µL 树脂。</li>
		<li>将打印结构小心地置于液滴上方，使树脂流至结构下方。再通过紫外光照射 5 分钟进一步固化打印结构。</li>
		<li>用培养皿盖盖好后，转移至烘箱中进行热固化，80 °C 下持续 30 分钟。切勿预热烘箱，以避免打印结构变形或破裂。固化完成后，打印结构将永久附着于培养皿底部。此后，该已安装的打印结构将被称为模具。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从模具制备PDMS装置及细胞培养基底
<ol>
	<li>PDMS 器件制备
	<ol>
		<li>准备20 mL 基质与固化剂按10:1（质量比）混合的混合物试剂 未聚合的PDMS。每个装置根据其所需高度，使用1-2 mL PDMS混合物即可。将多余的未聚合PDMS储存于-20 °C以备后续使用。</li>
		<li>在层流罩下，将混合物彻底搅拌4分钟。随着混合物均匀地裹入气泡，其外观将变得不透明。</li>
		<li>将混合物转移至一个50 µL的µ管中，在168 x g条件下离心 g 5 分钟，以去除混合物中的气泡并获得澄清的外观。</li>
		<li>用10 µL疏水剂（如Repel-silane ES）处理模具，静置7分钟，以确保后续聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合后能顺利从模具上脱离。</li>
		<li>用70%乙醇冲洗模具1次，再用去离子水冲洗2次。将模具置于超净工作台中自然晾干。</li>
		<li>将PDMS混合物缓慢倾倒至模具中，直至达到器件预定的最终高度。为防止气泡产生，应缓慢倾倒，并尽量靠近模具表面进行。</li>
		<li>将模具盖好，转移至已预热并稳定在 80 °C 的烘箱中，固化 18 分钟。对于高度超过 5 mm 且不超过 1 cm 的器件，将固化时间从 18 分钟延长至 25 分钟。</li>
		<li>在层流罩内，轻轻将固化的PDMS块从模具上剥离，并置于玻璃培养皿中的异丙醇内浸泡至少10分钟。异丙醇可去除未交联的PDMS。始终确保PDMS块被液体覆盖。</li>
		<li>更换异丙醇，然后在体视显微镜下，使用眼科穿刺刀小心地切出装置的中央方形区域（本研究中标识为目标区域），再沿边缘继续切割，以获得装置的最终形状。</li>
		<li>从异丙醇中取出装置，浸入乙醇中30分钟，然后用无菌去离子水冲洗3次。此后须始终保持无菌状态。</li>
		<li>在超净工作台内，将装置转移至新的培养皿中，保持其盖子微开。让其完全自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设备安装与细胞培养基底的制备
	<ol>
		<li>将每个微电极阵列（MEAs）浸入70%乙醇中30分钟以灭菌，然后用无菌去离子水冲洗3次。</li>
		<li>使用无菌精细镊子，在层流罩和体视显微镜下，将PDMS装置安装至MEA内侧区域。将PDMS装置的一侧与MEA内侧区域中心对齐，该区域含有基底集成的微电极，使源区和靶区两侧均仅暴露少量微电极（参见 图2). 
		注意：本实验无需将MEA微电极与PDMS装置的微通道对齐。可轻轻按压装置，以实现PDMS装置与MEA表面之间的紧密密封。务必避免镊子尖端接触微电极。</li>
		<li>将带有PDMS器件的MEA插入等离子清洗仪腔室中，通过空气等离子体进行表面活化。首先启动真空泵，对腔室抽真空4分钟。随后，轻微打开空气阀门，以控制空气缓慢进入。关闭空气阀门并开启等离子发生器，调节射频功率至10 W至18 W之间。</li>
		<li>当出现发光现象后，让过程继续运行80秒。然后关闭等离子体发生器，关闭真空泵阀门，并缓慢打开进气阀。打开腔室，取出MEA。 
		注意：如果等离子体处理过程中将微电极阵列（MEA）暴露于非无菌环境，请将每个MEA置于超净台内的紫外灯下照射30分钟，以确保无菌性。</li>
		<li>向MEA中加入1 mL聚乙烯亚胺（PEI）0.1%（w/v）溶液，于37 °C孵育过夜。吸除PEI溶液，用无菌去离子水洗涤5次。向MEA中加入1 mL细胞培养基，在接种细胞前进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 神经元细胞培养与电生理学
<ol>
	<li>提前准备好解剖液、消化液以及溶液1-3（见 表1).</li>
	<li>解离神经元细胞培养
	<ol>
		<li>用镊子轻轻夹住出生0-1天的Wistar新生大鼠的吻部，使用锋利的剪刀迅速断头。</li>
		<li>剥离头皮，使用精细剪刀沿颅骨矢状中线剪开，然后在小脑交界处进行冠状切口穿过颅骨。</li>
		<li>去除颅骨，用精细的解剖铲挖出脑组织，并转移至冰冷（4 °C）的解剖液中。</li>
		<li>去除皮层下组织、海马和脑膜。将组织切成小块（即 1-2 mm）3）并转移至15 mL离心管中。弃去溶液，用新鲜解剖液冲洗组织，随后用消化液洗涤。</li>
		<li>弃去消化液，加入1 mL溶液1，37 °C孵育5 min。弃去溶液1，用新鲜解剖液冲洗组织。然后加入1 mL溶液2，4 °C静置10 min。</li>
		<li>弃去溶液2，用新鲜的解剖液冲洗组织。然后加入1 mL溶液3，通过缓慢吹打溶液20至30次进行机械解离。当出现均匀浑浊的单细胞悬液时，加入解剖液将体积调至3 mL。</li>
		<li>通过在 100 x g 条件下离心混合物收集细胞沉淀 g 孵育5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL预热的培养基中。</li>
		<li>计数细胞（例如使用细胞计数板），并相应调整细胞接种液的密度。</li>
		<li>以每毫升接种液含有1.8 × 10⁵个细胞的理论细胞密度，向每个MEA中加入1 mL接种液6 （约 6500 个细胞/毫米²）2）。将接种好的多电极阵列（MEAs）置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育2每2天更换一次培养基，使用新鲜配制的培养基（即每周新配制的培养基）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞外电生理学 
	注意：解离的神经元细胞培养物在 2–3 周后达到完全成熟的电生理表型 体外以下部分描述了一种使用商用MEA应用软件（Experimenter）进行细胞外刺激的实验方案，用于对模块中培养的神经元群体（即Source或Target）之一施加电刺激，同时记录成熟神经网络中两个神经元群体的电活动。
	<ol>
		<li>将一块MEA轻轻安装至多通道电子放大器探头内，置于干燥培养箱中（37 °C，5% CO₂）2）并静置10分钟。可单独制备定制的PDMS盖，作为每个MEA的紧密覆盖物，以减少水分蒸发并维持无菌状态。</li>
		<li>启动 Experimenter 软件。将采样率设置为 25 kHz，然后按下按钮开始数据采集 开始数据采集在数据展示面板中，显示每个通道记录的细胞外活动的原始轨迹。</li>
		<li>监测自发活动，通过视觉识别并选择在全网络自发同步活动爆发期间有活动的3对相邻微电极，这些微电极可来自源侧或靶侧微电极。</li>
		<li>在软件的刺激器面板中，为每个以双极配置连接的刺激微电极对设置参数：选择双相脉冲波形，将峰值幅度设为 ±800 mV，脉冲持续时间设为 200 µs。</li>
		<li>设置记录仪，在刺激前记录300毫秒，刺激后记录1000毫秒。</li>
		<li>以交错方式进行所需次数的重复操作，对源端和目标端依次重复步骤 3.3.3 至 3.3.5。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Applications of 3D-Printing for Micro-Scale Neuronal Cell Culture Devices

<ol><li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front Neuroeng. 4, 13(2011).</li>
<li>Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+generation+and+propagation+of+synchronized+bursting+in+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).</li>
<li>Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+neural+networks+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Inst+Electr+Electron+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing neural networks in culture.</a> Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).</li>
<li>DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+propagation+of+temporal+and+rate+information+between+cortical+populations+during+coherent+activation+in+engineered+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks.</a> Front Neural Circuits. 10, 32(2016).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J Neural Eng. 9 (3), 036010(2012).</li>
<li>Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionality+shapes+the+dynamics+of+cortical+interconnected+to+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks.</a> J Neural Eng. 15 (5), 056044(2020).</li>
<li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PLoS One. 9 (9), e107400(2014).</li>
<li>Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Neural circuits on a chip.</a> Micromachines. 7 (9), 157(2016).</li>
<li>Aebersold, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BBrains+on+a+chip%26%2334%3B%3A+Towards+engineered+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Tren+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">34;Brains on a chip&#34;: Towards engineered neural networks.</a> TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).</li>
<li>Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complexity+emerging+from+anatomical+constraints+in+the+brain%3A+The+significance+of+network+modularity+and+rich-clubs%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs.</a> Sci Rep. 6, 38424(2016).</li>
<li>Eytan, D., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+effective+topology+underlying+synchronization+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).</li>
<li>Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potential+activity+in+a+predefined+microtunnel+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046031(2011).</li>
<li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+corticostriatal+network+on-a-chip+reveals+the+contribution+of+the+presynaptic+compartment+to+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease.</a> Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).</li>
<li>Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+outgrowth+of+dissociated+neurons+on+patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates.</a> J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).</li>
<li>Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+micropatterned+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks.</a> Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).</li>
<li>Staii, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+and+guidance+of+neurons+on+gold+surfaces+by+directed+assembly+of+proteins+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy.</a> Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).</li>
<li>Fricke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+rat+cortical+neurons+by+microcontact+printed+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients.</a> Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).</li>
<li>Gladkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cultured+neuron+networks+in+vitro+with+predefined+connectivity+using+asymmetric+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels.</a> Sci Rep. 7 (1), 15625(2017).</li>
<li>le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barbed+channels+enhance+unidirectional+connectivity+between+neuronal+networks+cultured+on+multi+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays.</a> Front Neurosci. 9, 412(2015).</li>
<li>Peyrin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+diodes+for+the+reconstruction+of+oriented+neuronal+networks+in+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers.</a> Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+Spec+Top%22%5BJournal%5D)">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> J Vis Exp. (119), e55276(2017).</li>
<li>Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+custom+microfluidic+devices+for+research+and+educational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications.</a> J Vis Exp. (153), e60307(2019).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

尽管双光子聚合（2PP）技术已有数十年历史，但其在微米尺度聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制 molding 中的应用却是近年来的新进展43,44。在此背景下，以下将讨论若干要点，以帮助用户有效重复本项工作。
在进行3D模型设计时，应确保模型不存在孔洞或自相交的情况。将模型保存为STL格式时，应优先选择二进制文件格式，因其文件体积小于ASCII编码格式，尤其适用于具有复杂几何结构或尺寸达毫升量级的物体设计。使用二进制STL文件还能在后续准备机械部件进行3D打印的过程中降低CPU负载。 STL文件中特征的物理尺寸以无量纲单位表示。在STL文件的后处理过程中，这些单位将被解释为微米。因此，建议在准备文件时预先采用目标单位，即微米。打印模型的精度由用于近似表示的镶嵌三角形面片数量决定。若面片数量不足，将导致表面粗糙度不理想。然而，若为追求过高的精度而使用过多的面片，将带来较高的计算负载，导致文件处理速度变慢。
在3D打印过程中，通过在x-y平面内快速使用振镜扫描以及在z方向上使用压电运动，将飞秒激光束聚焦于任意给定的三维体素内，从而形成三维实体结构。然而，当打印结构超出振镜和压电装置的空间覆盖范围时，必须通过程序将物体分割为多个区块。尽管这对于毫米尺度的打印部件是必要步骤，但区块之间的连接处会形成（不完美的）拼接线。因此，仔细优化区块数量以及在x、y和z方向上拼接线的位置至关重要，以避免拼接线破坏最终物体的关键几何特征。气泡可能由于多种原因在打印界面处形成（例如，基底或光刻胶中的杂质和不均匀性），并对打印结构的质量和完整性产生负面影响。此外，较高的激光功率可能导致气泡出现频率增加。降低打印部件最底层的激光功率，可最大限度减少气泡形成的几率。作为将整个部件以实心结构打印的替代方案，可采用壳-支架（shell-and-scaffold）方法。该方法仅打印部件的外表面（壳）以及内部的三棱柱状结构单元，这些单元由水平层状结构（支架）分隔，将未聚合的树脂限制在小的封闭区域中。此方法显著缩短了打印时间，尤其适用于毫米级结构。然而，由于仍有未聚合的树脂存在，打印后的紫外光（UV）照射步骤至关重要，以确保部件完全的机械稳定性；但该步骤必须谨慎进行，以避免打印部件发生形变。后固化时间取决于所选树脂的类型、部件厚度以及紫外光功率40。为获得最佳效果，建议先进行初步试验：使用一滴光刻胶在紫外照射后观察其截面，以估算实现完全深度固化的所需时间。通常的固化时间范围为5至20分钟。
对于PDMS复制模塑，在没有洁净室设施的情况下，制备具有微米级结构特征的PDMS器件时实现清洁加工可能具有挑战性：空气中的微粒可能附着在PDMS高度粘附的表面，阻碍器件与基底之间的密封，或堵塞单个微通道。在层流罩内执行实验步骤，并持续用异丙醇保护PDMS表面，可显著降低污染风险。固化温度及其持续时间直接影响PDMS的交联程度及最终的物理特性。特别是，固化后PDMS的粘附性是一个关键因素。一方面，PDMS器件与用于神经元细胞培养的表面（例如玻璃盖玻片或MEA）之间需要形成紧密密封，以有效限制神经突的通过；另一方面，PDMS器件应可逆地附着于表面，以便在移除器件时不会损坏精密的绝缘层MEA。尽管PDMS在固化过程中会发生收缩，且可通过预先按比例放大模具进行校正，但在本文所述的温度和固化时间条件下，收缩率将小于2%42，对单层PDMS器件的影响不显著。总体而言，为获得最佳效果，应严格遵循推荐的固化温度和时间参数。
方法优势与局限性的概述 
本文提出一种基于双光子直写激光技术的方法，用于快速制备微米级聚合物器件，以开展模块化神经网络的实验研究。与软光刻技术相比，只要具备可运行的功能性双光子聚合（2PP）3D打印系统，该方法无需高水平的技术专长即可实施。值得注意的是，该方法可在一天内实现从计算机辅助设计（CAD）构建的三维模型到功能性聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件的转化，从而为从概念设计到实体实现提供了直接且高效的途径。具体而言，采用壳-支架（shell-and-scaffold）打印模式可显著缩短模具制备时间，因为仅需打印其体积的一部分。对打印部件进行后续紫外（UV）固化可确保其机械稳定性与耐用性，本文中经50次PDMS浇铸循环验证，性能保持良好。
与传统方法相比，双光子聚合（2PP）三维打印具有明显优势，尤其在制造具有显著高宽比、高分辨率要求以及复杂三维几何结构的模具时，这一优势尤为突出。采用标准紫外光刻技术制造主模具时，受限于光刻胶厚度约为200 µm。若需实现更高的结构和更大的高宽比，则必须采用复杂的旋涂与曝光循环序列35、成本高昂的LIGA技术（光刻、电铸和模塑）或深反应离子刻蚀（DRIE）工艺36。相比之下，正如Kumi等人在2010年的开创性研究中所展示的那样37，2PP技术在打印部件的高宽比方面几乎不受限制，可实现从亚微米级到毫米级的结构。本文示例展示了一种各部分高度差异显著的模具微加工过程，其中微通道高度（5 µm）与模具最大高度（545 µm）之间相差超过100倍（见图2）。
此外，遵循本方案所述的协议规范，可轻松实现亚微米级分辨率。相比之下，通过紫外光刻技术提高模具分辨率则需要较高的资金投入。采用在石英基底上沉积铬工艺、标称分辨率为600 nm的高精度掩模，其价格比分辨率为250 µm的激光打印透明胶片掩模高出数个数量级35，但可参见Pirlo等人41的研究。为适用于实验室内部使用，所选方法必须具备成本效益。对于许多生物实验室而言，传统软光刻或直写激光技术的整体费用构成了应用障碍。尽管可以通过采购并组装关键组件来降低这两种技术的使用门槛，但该方法仍需要额外的专业知识，并且仍需较大的资金投入。在此背景下，一个关键考量因素是直写激光技术所能实现的更广泛的应用范围。与主要局限于微模具制造的传统软光刻技术不同，双光子聚合（2PP）三维打印技术展现出显著的多功能性。其潜在应用涵盖微流控、微光学、集成光子学以及微机械等多个领域。这使得投资该技术作为多个不同科学领域的共享平台具有吸引力。例如，本方案中开发的基于2PP的技术，即源于本机构神经科学与数学系之间的跨学科合作成果。此外，光刻胶的开发目前也是一个活跃的研究领域，有望进一步拓展2PP三维打印技术的应用范围。一个典型例子是近期推出的IP-PDMS树脂。该树脂聚合后形成的结构具有类似于PDMS38的特性，从而实现了对具有复杂表面形貌或包含中空结构的生物相容性微结构的直接微加工。这些复杂结构正是传统复制模具工艺难以实现类似效果的主要障碍。
作为该方法的示范，已有证据表明在模块化神经网络的两个模块之间形成了单向连接。通过双光子聚合（2PP）技术制造的微尺度模具具有足够的耐久性，可承受多次聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸，并具备所需的微米级精度。总之，本文所述方案的应用范围远不止所展示的案例。随着双光子聚合（2PP）打印技术的普及程度不断提高，其实施所需的初始投资将逐步降低，而潜在应用范围也将持续扩大。

在行为状态下的生物体中研究神经元活动面临诸多挑战。例如，由于需要保持脑组织的完整性，对脑组织的物理接触受到限制，因此通常只能考虑脑的表层区域。在完整组织中分离特定靶标往往是一项艰巨的任务，有时甚至无法实现。尽管分离的均质神经元培养体系便于研究神经环路中单个（亚）细胞组分的分子、生化和生物物理特性，但其失去了完整大脑所具备的真实连接性和解剖学结构。这些根本性限制促使研究人员致力于寻找一种折中方案，以实现 体内 在避免复杂性的同时，结构仍可被构建 体外 按需1,2,3,4,5,6,7,8,9特别是，模块化神经元培养在过去几十年中一直是广泛研究的主题，旨在解决如下所述的脑生理学关键问题。
组织结构：&#160;In vivo 研究表明，大脑在解剖结构上呈层状排列，具有特定的细胞类型和精确的投射阵列。功能检测揭示了神经元网络以节点集合和模块形式组织，并具有精确的连接模式10,11。然而，由于涉及的突触数量庞大，以及发育过程和活动依赖性可塑性效应相互交织，使得在 in vivo 条件下无法充分研究连接性及微环路基序的作用。
信号传递：在体内或随机的体外培养中，评估信号传递具有挑战性。要检测轴突传导及其全程的动作电位，需要通过表面功能化或化学图案化引导神经突生长，从而在细胞外记录的电活动信号中获得较高的信噪比12。
转化相关性： 要阐明在不同病理条件下突触前与突触后组分各自独特的功能，必须能够分别获取这些组分。具有受限连接性的模块化培养体系可有效分离突触前和突触后组分，是实现这一目标不可或缺的工具13。
获得神经元培养中某种形式结构的方法有多种，大致可分为化学和物理表面调控两类。9前者的方法14,15 依赖神经元细胞对某些（生物）化学化合物的黏附倾向。这需要以微米级精度并按照特定图案，将黏附性或吸引性分子沉积在表面。尽管这种方法能够使细胞表面部分区域按照预期图案被覆盖，但化学方法本身存在固有局限性，在引导神经突生长方面的成功率相对较低16完全控制轴突方向性需要建立特定化学物质的空间梯度，以调控轴突导向17后者涉及物理表面操控，更常用于构建神经元网络结构。 体外神经元细胞通过几何限域结构（如显微腔室、壁障、通道等）被物理性地限制在特定位置，这些结构由生物相容性聚合物（如聚二甲基硅氧烷，PDMS）构型而成3,5,6,7,18,19,20 固化并成型为微流控装置。该 事实上的 用于PDMS微流控芯片制备的方法是软光刻技术21，其中在微米尺度上制备二维掩模，并在紫外光照射下用于选择性刻蚀硅基材料。简而言之，通过旋涂法将一种可紫外光固化的树脂（即光刻胶）涂覆在硅片表面，其厚度由树脂的黏度和旋转速度决定。随后，将带有图案的掩模置于光刻胶上方并进行紫外光照射。掩模中透明的区域对应目标区域，允许紫外光透过并引发光刻胶分子的局部交联。未曝光区域的光刻胶则通过溶剂清洗去除，从而形成主模具。该主模具可反复用于固化选定的弹性体（如PDMS），从而复制出任意数量、具有所需几何结构的微结构。该制造方法是制备微流控器件最常用的方法22软光刻技术的主要局限性或许在于其需要较高的初始资金投入，以及生物实验室对所需技术和专业知识的不熟悉。设计复杂的多高度、高宽比结构时，掩模的制备以及软光刻所需的步骤均具有相当的技术难度。23 且通常需要外包。尽管已提出一些替代性且低成本的方法，但这些方法并不总能满足生物原型制作对高精度的要求24.
本文介绍了一种基于双光子聚合（2PP）和增材制造的替代性制造方法。该方法操作简便，无需专门的微加工或微光刻技术专业知识。2PP微制造研究领域兴起于20世纪90年代末25，此后经历了指数级增长26。有关该技术基本原理的更多内容可参见其他文献26。简而言之，通过在三维空间中聚焦激发光脉冲，2PP利用多光子吸收对光强的非线性依赖特性，实现受限吸收，从而确保在极小局部区域内进行精确且选择性的激发。本质上，将负性光刻胶（一种在光照下溶解度降低的材料）暴露于低占空比的飞秒激光脉冲聚焦光束中27。这种方法可在低平均功率下产生高强度脉冲，从而实现聚合反应而不损伤材料。光诱导产生的自由基单体相互作用形成自由基低聚物，引发聚合反应，并在光刻胶中扩展至一个特定体积，即体素（voxel），其尺寸取决于激光脉冲的强度和持续时间28。
本研究包含两个部分：A）设计并快速制备一种可重复使用多次的3D打印模具，用于生产一次性聚合物神经元细胞培养装置（图1）；B）将这些装置机械耦合到平面神经元细胞培养基底表面，甚至可耦合到能够进行多点生物电信号记录的基底集成微电极阵列上。
本文简要描述了3D机械模型的计算机辅助设计，并详细介绍了制作3D打印模具及 fabrication PDMS器件的步骤。
可使用多种计算机辅助设计软件来生成初始的三维物体模型，并制作STL文件以控制双光子聚合（2PP）打印过程。在材料表中，所列的第一个和最后一个软件均为免费提供或附带免费许可。构建三维模型始终需要先创建一个二维草图，随后在后续建模步骤中将其拉伸。为说明这一概念，本实验方案部分重点介绍了一种通用的三维CAD软件设计流程，最终形成由多个重叠立方体组成的结构。如需更全面的信息，可参考材料表中列出的大量在线教程和免费培训资源。
然后将生成的STL文件转换为一系列由3D打印机执行的指令（即切片过程）。对于所使用的特定双光子聚合（2PP）3D打印机，采用DeScribe软件导入STL文件，并将其转换为专有的通用写入语言（GWL）格式。2PP打印过程的成功取决于多个参数，尤其是激光功率及其扫描速度、拼接（stitching）以及层间扫描（hatching-slicing）距离。这些参数的选择，连同物镜和光刻胶的选用，取决于设计中最小结构特征以及预期的应用需求。因此，参数优化对于满足不同设计场景和应用需求至关重要。在本研究中，采用推荐的参数配置IP-S 25x ITO Shell（3D MF）作为打印参数设置。最终，打印出具有足够机械稳定性的部件，在满足必要分辨率的同时，尽可能缩短3D打印时间。
本研究展示的模具设计及相关STL文件包含一个方形框架，用于将细胞培养空间分隔为两个区域：外部区域（下文称为“源区”）和内部区域（下文称为“靶区”）。这两个区域通过一组微通道相连，每个微通道均具有锐角边界的特征，其设计可特异性阻碍神经突从靶区向源区生长，但不阻碍反向生长，从而促进在两个区域上生长的神经元之间形成单向突触连接。
早期研究采用不同几何形状的微通道以促进神经突的定向生长，例如三角形结构18、带倒刺的通道结构19以及逐渐变窄的通道20。本文采用一种在微通道边界处设置锐角屏障的设计，并具有不对称的入口。这些微通道用于建立封闭内部区域（即靶区）与外部区域（即源区）之间的连通性。微通道起始段（来自源区一侧）的漏斗形状设计旨在促进轴突束的形成，并使其沿连接源区与靶区的最短路径（即直线路径）生长。相对的锐角所形成的三角形空间在靶区一侧具有更大的体积，旨在有效延缓神经突的路径寻找过程，同时有利于源自源区的神经束快速延伸并占据可用空间。将微通道长度设定为540 µm可有效筛选掉通常较短的树突生长39。此外，5 µm的通道高度可防止细胞胞体穿过微通道。总体而言，该结构被证实能够促进外侧源区模块与内侧靶区模块之间的单向连接，本文将其作为多种可行方案中的一种原理验证予以展示。
尽管通过双光子聚合（2PP）模具制备的聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件可附着于常见的细胞培养基底表面（如玻璃盖玻片或培养皿），但本研究中采用了市售的集成基底微电极阵列。未对三维设计针对微电极阵列布局进行优化，机械耦合过程在体视显微镜引导下完成，仅确保器件横跨阵列放置，导致源端和靶端两侧均存在部分微电极未被覆盖。该设计可实现对神经元细胞培养中受限连接功能效应的初步评估。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>BB 固化紧凑型聚合器</td><td>PCube Srl</td><td></td><td>波长 365–405 nm，功率 120 W</td></tr><tr><td>BioMed Amber 树脂 1 L</td><td>formlabs</td><td></td><td>用于将 3D 打印模具固定到培养皿的树脂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CAD 应用软件 SolidWorks</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes SolidWorks Corporation, US</td><td></td><td>Fusion 360（Autodesk Inc., US）、AutoCAD（Autodesk Inc., US）、PTC Creo（PTC corp., US）、SolidWorks（Dassault Syst&amp;egrave;mes SolidWorks corp., US）和 Tinkercad（Autodesk Inc., US）。&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; --------------------------------------&lt;br/&gt; 教程：https://www.mycadsite.com/tutorials.html&lt;br/&gt; 培训：https://www.autodesk.com/training</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>Tocris</td><td>#0106</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>DeScribe</td><td>Nanoscribe GmbH &amp;amp; Co.&amp;nbsp;KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;prime; 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>体外 MEA 记录系统 MEA2000 mini</td><td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IP-S 光刻胶</td><td>Nanoscribe GmbH &amp;amp; Co.&amp;nbsp;KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>犬尿酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MEA 记录应用软件（Experimenter）</td><td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51412C</td><td></td></tr><tr><td>NanoWrite</td><td>Nanoscribe GmbH &amp;amp; Co.&amp;nbsp;KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科穿刺刀 15&amp;deg;</td><td>HESTIA Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photonic Professional GT2（PPGT2）3D 打印机</td><td>Nanoscribe GmbH &amp;amp; Co.&amp;nbsp;KG</td><td>SN617</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>HARRICK PLASMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>Repel-silane ES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17133201</td><td></td></tr><tr><td>用于 3D MF DiLL 的钠钙玻璃 ITO 涂层基底</td><td>Nanoscribe GmbH &amp;amp; Co.&amp;nbsp;KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>集成基底的平面 MEA（120MEA100/30iR-ITO-gr）</td><td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td><td></td><td>TiN 电极，SiN 绝缘层，4 个内部参考电极，120 个记录电极，电极间距 100 &amp;micro;m，电极直径 30 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>单相异步双极真空泵&amp;nbsp;</td><td>CIMAMOTORI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

几十年来，神经元培养一直是重要的实验模型。然而，这种模型缺乏三维细胞排列、神经突生长的空间限制以及真实的突触连接性。后者限制了在区室化背景下对结构与功能的研究，降低了培养系统在神经科学中的意义。尽管在节律产生、突触可塑性以及最终的大脑病理生理过程中，模拟ex vivo条件下突触连接的有序解剖结构至关重要，但实现这一目标并不容易。本文采用双光子聚合（2PP）技术作为一种三维打印方法，能够在微米尺度上快速制备基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的聚合物细胞培养装置。与基于微光刻的传统复制 molding 技术相比，2PP 微尺度打印可实现原型的快速且低成本的迭代。本实验方案详细说明了用于培养模块化神经元网络的 PDMS 基微流控装置的设计与制造过程。作为原理验证，本文展示了一种双腔室装置，用于物理限制神经连接。具体而言，该装置促进并允许在ex vivo发育过程中实现从一个腔室向另一个腔室的非对称轴突发育。为了探究单向突触相互作用的功能后果，选用商用微电极阵列来监测相互连接的神经元模块的生物电活动。本文阐述了两种方法：1）以微米级精度制备模具；2）在大鼠皮层神经元培养物中进行in vitro多部位细胞外记录。随着2PP三维打印成本的降低及其未来在全球范围内的普及，该方法将在世界各地的研究实验室中变得越来越重要。特别是在神经技术与高通量神经数据记录领域，简化in vitro模型的快速原型构建将有助于提升对in vivo大规模神经系统的实验控制能力与理论理解水平。

本文报道了一种双区聚合物（神经元）细胞培养装置的制备方法，展示了双光子聚合（2PP）三维打印技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件快速原型制作中的应用。具体而言，制备了一种用于具有单向突触连接的模块化神经网络的装置，并通过多部位细胞外电生理记录对其功能特性进行了表征。简而言之，采用市售的3D打印机通过飞秒激光直写技术加工出微米级模具。该打印机输出功率为50 mW，激光脉冲中心波长为780 nm，脉冲持续时间为80至100 fs。在制造过程中，激光束通过打印机的物镜（25倍，数值孔径NA=0.8）聚焦到负性光刻胶（IP-S）上，利用振镜系统控制x轴和y轴方向的扫描，压电平台控制z轴方向，从而完成打印体积的逐层扫描。打印体积被合理划分为若干200 mm × 200 mm × 265 mm的区块，最终形成总体尺寸为6500 mm × 6500 mm × 545 mm、标称容积为12.423 mL的模具。图2A展示了模具的二维示意图，标示了其尺寸及结构特征的大小；而图2B则显示了安装在微电极阵列（MEA）上的成品装置的局部放大照片。如前文所述方法制备的模具具有良好的耐用性，可重复使用超过50次以制造PDMS装置。
打印的模具用于浇铸PDMS装置，随后将该装置安装在集成有微电极阵列（MEA）的玻璃基底内侧区域，用于神经元电活动的多点胞外记录，并作为原理验证。采用商用基底集成MEA来监测模块化培养物在受到由位于各培养室内的部分微电极施加的空间局域胞外电刺激时的活动响应。每块MEA包含120个氮化钛（TiN）微电极，电极直径为30 µm，电极间距为100 µm。图2C-D展示了PDMS装置在MEA表面的放置位置。该装置各个微通道的几何特征以及图2C所示培养室的整体布局，实现了培养神经元的空间分隔。根据其所在区域，这些神经元可被区分为位于装置外区（源区）或内区（靶区）的神经元。轴突优先沿微通道的锐角边缘从源区向靶区定向生长。图2D展示了聚合物装置在MEA上的放置位置及其对位于源区或靶区内的记录电极的相对覆盖范围。需要注意的是，在本案例研究中，并未要求也未追求将装置内部微通道与MEA的一行或多行微电极进行精确对准。
不对称神经突生长的代表性证据如图所示 图3，期间 离体 发育过程，通过活体成像显示荧光标记的神经突，6天（图3A）以及细胞铺板后2天（图3B- D）。虽然靶区一侧的神经突在穿过装置时遇到尖锐角度的障碍物，阻碍了其在空间中的延伸，但源自源区一侧的神经突则持续生长并顺利穿过通道。这种不对称性有利于两个区室内的神经元之间形成从源区到靶区的单向轴突连接，这正是设计时的明确意图。该结果进一步通过电生理功能评估得到支持，即分别在两个区室内交替施加刺激后记录到的电反应。
3-4 周后 体外，当神经元网络达到完全成熟时29,30通过施加短暂的电刺激并监测其引发的神经元反应，可探究两个区室之间的功能连接性31随后，以交错方式仅向刺激源（Source）或仅向靶区（Target）细胞群施加双相电脉冲刺激（脉冲幅度为800 mV，重复次数N = 150，模块化培养样本数N = 6），刺激通过MEA上3组并列排列的平面微电极对以双极配置方式传递。因此，这3组电极对可位于MEA的刺激源区域，也可位于MEA的靶区区域。每次刺激所诱发的电反应在经过一定传播延迟后，可由MEA上的所有微电极检测到。记录时采样频率为25 kHz/通道，所得细胞外原始电信号以16位模数转换分辨率进行数字化。采用基于阈值跨越的峰值检测算法32 离线用于检测细胞外动作电位发生的时间，但未进行任何峰电位分类。 图 4A- B 清晰地揭示了诱发反应存在显著的不对称性，该反应重复150次，且依赖于刺激施加的位置，表明几何约束对连接性的偏好方向具有重要的功能影响。事实上，在刺激源侧时，源神经元群体的放电率——通过计算刺激周围峰电位时间直方图估算——如预期般升高，引发了一次完整的网络性动作电位爆发33,31,34 随后，目标群体的放电率在经过一段延迟后出现上升。然而，由于刺激是在目标群体内施加的，仅有目标群体的放电率增加，而源群体基本保持静息状态。 图4C-D 在无聚合物装置存在的情况下（即非结构化神经元培养），对对照培养物重复相同的刺激/反应范式，细胞外刺激同样进行了4次重复。在此类对照条件下，任一刺激所诱发的反应均未出现不对称性。尽管用于传递刺激的MEA微电极子集与模块化网络中使用的相同，但刺激传递的位置导致整个细胞群体产生相似的诱发反应。这证实PDMS装置促进了两个区室之间单向突触连接的形成。总体而言，在模块化培养物（N = 6）中观察到的不对称反应与在对照培养物（N = 4）中观察到的对称反应强烈表明，区室化结构导致了解剖连接的受限性 体外 系统。用于生成电生理数据的脚本及数据 图4，可通过 Zenodo 获取（https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990）。
<img alt="CAD 到 3D 制造流程；示意图；包括 CAD 设计、IP-S 光刻、PDMS 模具分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：双光子聚合微模具制备及 PDMS 复型工艺示意图。（A）在 CAD 软件中设计三维模型，并导出为标准三角网格语言（STL）格式文件，（B）通过树脂液滴（IP-S）内的激光诱导聚合实现双光子三维打印。（C）所得结构用作模具，用于重复制备 PDMS 复制品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于流体流动分析和传感器对准的微流控装置设计示意图和图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于神经元细胞培养的聚合物（PDMS）装置的自主快速原型制作示例。（A） 在不到 24 小时内，微尺度增材制造技术即可实现从 CAD 模型到 3D 打印母模的快速转化，并可立即且重复地使用该母模与生物相容性弹性体（如 PDMS）制备复制模具。（B-C） 所得 PDMS 装置与神经元细胞培养的平面基底耦合，此处以微电极阵列表示。针对 （A） 中特定样品设计，定义了两个腔室：一个称为“源”（Source），以 S 表示；另一个称为“靶”（Target），以 T 表示。（D） 每个腔室中接种的神经元仅能通过一系列微通道生长其神经突。当在 （C） 中通过体视显微镜引导进行适当对准时，两组集成于基底中的微电极将暴露出来，从而可对两个区室中邻近神经元的生物电活动进行刺激和记录。需注意的是，在此原理验证实验中，将微电极精确对准各个微通道并非优先目标。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于细胞运动分析和通路导航的荧光显微镜与微通道示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：细胞不可渗透的荧光报告分子的活体成像，可识别细胞接种数天后神经元延伸出的神经突。（A-D） 对基于图 1和图 2制备的模块化神经元培养装置（N = 4，共128个独立微通道），在细胞接种后2天和6天采集的代表性共聚焦荧光显微图像。（B-D） 显微图像采用40倍放大倍数并转换为反相灰度以增强可见性。微通道来自“源”区和“靶”区的末端分别用S和T表示。（A） 显示接种6天后培养物的宽视野扫描图像，其中“源”区（即内侧方形区域）和“靶”区（即外侧区域）均已被细胞充满。（B） 和（C） 分别显示接种后较早时间点（第2天）微通道“源”侧和“靶”侧神经突的生长情况。小黑三角形指示源自“源”区的疑似轴突束末端的代表性实例。箭头形状的微通道边界指向神经突沿边缘的延伸方向（B），其通路连续且被引导朝向“靶”区。相反方向上，在微通道靠近“靶”区末端的位置（C），从“靶”区起源并向“源”区延伸的神经突则被困于尖锐的拐角处。（D） 进一步揭示了微通道内部神经突外延生长的细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="刺激下的神经元放电率图，比较不同时间（毫秒）下装置效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：有无 PDMS 装置时神经元电反应的功能表征。采用多电极阵列（MEAs）作为细胞培养基底，并用于测量由短暂双相电刺激脉冲（即 200 µs，0.8 V）在双极配置下诱发的全网络范围的放电反应。使用 图 2 中的 PDMS 装置时，从“源”（红色）和“靶”（蓝色）记录到的神经元放电反应会因刺激施加位置的不同而有所差异。(A) 中可明显观察到轴突、突触及整合延迟，而 (B) 中则不明显，提示存在优势突触连接方向（即从“源”到“靶”）。(C-D) 在对照条件下（即无 PDMS 装置），在两组不同的 MEA 微电极上检测到的诱发反应不依赖于刺激施加的位置。图中曲线周围的浅色阴影区域表示瞬时均值的标准误差（N 次刺激 = 150）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液名称</td>
			<td colspan="3">成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚乙烯亚胺（PEI）0.1%</td>
			<td colspan="3">1 mL PEI 储存液，9 mL 无菌去离子水（DI 水）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>培养基（50 mL）</td>
			<td colspan="3">最低必需培养基（MEM），添加 20 μM 葡萄糖、50 μg/mL 庆大霉素、50 μM L-谷氨酰胺和 10% 热灭活马血清。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>解剖液（1000 mL）</td>
			<td colspan="3">Hanks′ 平衡盐 9.52 g，碳酸氢钠 350 mg，HEPES 2.83 g，D-(+)-葡萄糖 6 g，犬尿烯酸（终浓度 200 μM），D-AP5（终浓度 25 μM），庆大霉素 250 μL，牛血清白蛋白 300 mg，硫酸镁 1.44 g。调节 pH 至 7.3，避光保存于 4°C。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>消化液（100 mL）</td>
			<td colspan="3">氯化钠 800 mg，氯化钾 37 mg，磷酸氢二钠 99 mg，HEPES 600 mg，碳酸氢钠 35 mg，犬尿烯酸 200 μL（来自 100 mM 储存液），D-AP5 100 μL（来自 25 mM 储存液）。调节 pH 至 7.4，避光保存于 4 °C。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液 1</td>
			<td colspan="3">胰蛋白酶 5 mg，脱氧核糖核酸酶 I 1.5 mg，溶于 2 mL 消化液中。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液 2</td>
			<td colspan="3">胰蛋白酶抑制剂 5 mg，溶于 5 mL 解剖液中。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液 3</td>
			<td colspan="3">脱氧核糖核酸酶 I 1.5 mg，溶于 2.5 mL 解剖液中。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶液配制表。 有关产品描述，请参见材料表。
补充编码文件 1：该 STL 设计文件对应于图 2A中所示的结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/binary.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

在微米尺度上进行3D打印，能够快速制备用于神经元细胞培养的聚合物装置。作为原理验证，通过构建影响神经突生长的屏障和通道来限制神经元之间的结构连接，同时通过细胞外电生理记录观察此类操作的功能性后果。

神经元培养数十年来一直是重要的实验模型。然而，三维细胞排列、神经突生长的空间限制……

我们主要关注大脑中结构与功能之间的关系，特别是微环路层面的相互作用。我们经常采用分离神经元细胞培养等简化实验体系，因为它们是研究电活动、突触传递以及集体状态产生机制的宝贵模型。我们提出的方法适用于快速制备微米级聚合物器件。该方法可立即用于培养皿中模块化神经网络的实验研究，且无需在软光刻技术方面具备高深的专业技能。本方法及我们简单的概念验证实验，使得模块化神经网络的设计成为可能，从而能够定义其结构并控制生物信号的传递。药物筛选以及病理状态的研究将直接得益于这些复杂的体外神经元网络。首先，从顶部菜单栏启动设计软件桌面应用程序，选择“新建”，然后选择“零件”，即单个设计组件的三维表示。为确定草图的俯视图，按下 Ctrl 键和数字 5。从侧边面板中选择“草图”，然后选择“角矩形”。单击矩形的一条边，在参数面板中将该边长度设置为 100 个单位，并将相邻垂直边的长度设置为 50 个单位。按住鼠标左键拖动以框选该矩形并将其选中。在“添加关系”菜单中，选择“固定”以约束各线条之间的几何关系。从侧边栏创建一个新的小重叠矩形后，选择特征并选择拉伸基体。将大矩形的深度设置为5，小矩形的深度设置为10个单位。遵循这些基本原理，可以设计出更复杂的对象。最后，从文件菜单中将部件以 STL 格式保存。首先，生成并处理以 STL 格式保存的计算机辅助设计文件。将玻璃基板放置在支架上。使用电子万用表确认玻璃基板上涂有氧化铟锡（ITO）的一侧朝上，并用胶带将玻璃片完全固定。在化学通风橱内，将一滴 IPS 光刻胶滴加至玻璃基板中心，然后将载物片插入3D打印机中，使树脂液滴朝向物镜。通过软件的文件菜单加载 GWL 文件，选择“接近样品”，然后选择“查找界面”。选择“开始作业”以启动打印，完成后按“更换基板”。轻轻取下带有打印部件的基底，并在通风橱中将玻璃基底依次浸入PGMEA和异丙醇中孵育。对空气干燥后的打印部件进行固化时，需暴露于365至405纳米的紫外光下照射5至20分钟。在超净工作台内，轻轻将打印好的部件从玻璃基底上取下，并将其放置于培养皿中一滴两微升的树脂液滴上。经过五分钟的紫外光照射后，盖上培养皿，并在80摄氏度下孵育30分钟。首先，使用双光子聚合技术打印一个三维模具，并将其固定在培养皿上，该培养皿现称为模具。制备该装置时，将模具与10微升疏水剂孵育7分钟，随后用70%乙醇冲洗，再用去离子水冲洗两次。将先前配制好的PDMS混合物轻轻加至模具上，直至达到装置预定的最终高度。将覆盖好的模具置于预热至80°C的烘箱中孵育18分钟。然后在层流罩内轻轻将固化的PDMS块从模具上剥离，放入玻璃培养皿中的异丙醇中浸泡10分钟。在体视显微镜下，使用眼科穿刺刀仔细切割出中央的方形区域，然后沿器件边缘进行切割。随后将器件浸入乙醇中浸泡30分钟。在超净工作台内，将装置转移至新的培养皿中并使其干燥。首先，获取一个3D打印的模具，并制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置。为对微电极阵列（MEA）进行灭菌，将其浸入70%乙醇中30分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次。使用无菌精细镊子，在体视显微镜下将PDMS装置固定在MEA的内侧区域。将PDMS装置的一侧与MEA内侧区域的中心对齐。在通风橱内，向MEA中加入1毫升0.1%聚乙烯亚胺溶液，并于37摄氏度孵育过夜。用去离子水冲洗MEA五次后，加入1毫升细胞培养基，将MEA置于37摄氏度培养。接着，将含有180万个从新生大鼠脑组织中分离的神经元细胞的1毫升培养液接种到MEA上，并进行培养。首先，使用3D打印模具制备PDMS装置。将神经元细胞接种于安装在PDMS上的MEA中。将MEA轻轻安装至置于干燥37摄氏度环境中的多通道电子放大器的探头端，并孵育10分钟。启动实验者软件，设置采样率为25千赫兹，然后点击开始数据采集以启动数据记录。在数据展示面板中，显示每个通道记录的细胞外活动的原始轨迹。进入软件的刺激器面板，选择三对在全网络爆发期间有活性的相邻微电极，并选择双相脉冲波形。将峰值幅度设置为 800 毫伏，脉冲持续时间设置为 200 微秒。为实现双极配置，选择并设置相邻电极的参数值。最后，将记录器设置为刺激前300毫秒、刺激后1000毫秒，并按下开始数据采集按钮以启动记录。活体成像显示，荧光标记的神经突在PDMS装置的微通道中从源端向靶端延伸生长。电生理学分析表明，在模块化神经元网络中，源和靶的诱发电反应具有不对称性，而未使用PDMS的对照组则未表现出这种模式。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

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本研究描述了一种在自愈性可退火颗粒-细胞外基质复合材料内进行神经干细胞自由成型嵌入式3D打印的实验方案。该方案能够高保真地程序化构建相互连接的人类神经组织结构。...

微凝胶-细胞外基质复合支撑材料用于人源神经组织嵌入式三维打印

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

学习使用双光子聚合3D打印技术制造微尺度神经元细胞培养装置，用于体外模块化神经网络研究。该方法通过精确控制物理结构来调控神经元信号传导，为神经科学和疾病建模提供新工具。

双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

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