Name: 使用活细胞成像测量病理蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 了解活细胞共聚焦成像技术如何用于研究病理蛋白修饰对原代海马神经元轴突运输的影响。该方法通过转染和实时成像揭示tau蛋白异常导致神经退行性疾病的分子机制。

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感谢Chelsea Tiernan和Kyle Christensen在开发和优化本实验方案部分环节中所做的努力。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 NS082730（N.M.K.）、R01 AG044372（N.M.K.）、R01 AG067762（N.M.K.）和F31 AG074521（R.L.M.）；美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所密歇根阿尔茨海默病研究中心资助项目5P30AG053760（N.M.K.和B.C.）；美国国防部卫生事务助理部长办公室通过同行评审阿尔茨海默病研究项目资助W81XWH-20-1-0174（B.C.）；阿尔茨海默病协会研究资助20-682085（B.C.）；以及Secchia家族基金会（N.M.K.）的支持。

本方案已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案已成功应用于C57BL/6J背景的Tau基因敲除小鼠和野生型斯普拉格-道利大鼠。其他品系也应适用。
1. 原代海马神经元的分离获取
<ol>
	<li>用过滤的0.5 mg/mL多聚-L-赖氨酸（PDL）硼酸盐缓冲液（12.5 mM十水合硼酸钠和50 mM硼酸）包被4孔玻璃底培养板。每孔加入750 µL，室温孵育过夜。</li>
	<li>用无菌去离子水洗涤培养板4次。最后一次洗涤后自然晾干，并于4 °C短期保存（&#60;1周）。 
	注意：在洗涤前及洗涤过程中，切勿让PDL在玻片上干燥，否则会对细胞培养产生毒性。我们发现PDL包被玻片的长期储存可能影响神经元健康，而保持包被与接种之间时间间隔的一致性可降低不同批次培养存活率的差异。</li>
	<li>获取妊娠时间明确的小鼠或大鼠。 
	注意：妊娠时间明确的动物可从商业供应商订购，也可自行繁殖。胚胎发育第0天（E0）定义为发现阴道栓的当天。采用本方法，我们成功培养了E16–18期小鼠原代海马和皮层神经元。大鼠神经元通常也在胚胎第18天（E18）获取。</li>
	<li>在E18天，采用批准的方法处死妊娠雌鼠。剪开腹壁，取出两个子宫角，转移至含有冰冻0.9%生理盐水的培养皿中，冲洗至生理盐水澄清为止。 
	注意：我们通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（至少100 mg/kg）实施安乐死。</li>
	<li>断头处死胎鼠。从枕骨大孔（颅骨后部的开口）开始，使用显微解剖剪沿中线剪开皮肤和颅骨，将剪刀下端倾斜紧贴颅骨内侧，以避免损伤脑组织。</li>
	<li>去除覆盖的皮肤，并小心移除颅骨以暴露脑组织。</li>
	<li>用镊子夹住口鼻部，将颅骨翻转，使脑组织朝下置于盛有0.9%生理盐水的培养皿上方。将脑组织翻出颅腔，并剪断神经和脑干，使脑组织落入生理盐水中。</li>
	<li>将培养皿置于解剖显微镜下进行海马体解剖。将剪刀插入脑中线，倾斜剪刀使上刀片向外推开一侧大脑半球，剪开以分离大脑半球与皮层下区域。</li>
	<li>在皮层处做一垂直切口，使额叶皮层位于切口前方，海马体位于切口后方。将剪刀下端插入所形成的切口，沿皮层顶端小心剪开，至后端终止。</li>
	<li>用镊子轻轻掀开皮层，并完成后部的切断。此时海马体应呈新月形。小心修剪残留的皮层组织，使海马体保持圆润的新月形状。</li>
	<li>使用镊子和剪刀，轻柔地从海马体上剥离脑膜。 
	注意：彻底去除脑膜非常重要，以减少非神经元细胞的污染，同时避免损伤或撕裂海马组织。</li>
	<li>将海马体切成四个等份，放入盛有冰冻无钙无镁缓冲液（CMF；含0.1%葡萄糖、2.5 µg/mL两性霉素B和50 µg/mL庆大霉素的Dulbecco's PBS）的15 mL锥形管中。 
	&#8203;注意：为获得最佳效果，每次解离建议收集5–10只胎鼠的海马体。每只小鼠海马体可获得约300,000个细胞，大鼠海马体可获得约500,000个细胞。</li>
</ol>
2. 原代海马神经元的分离与接种
<ol>
	<li>用巴斯德移液管移除 CMF，并用新鲜的冷 CMF 轻柔地冲洗组织 4 次，每次冲洗之间轻轻旋转。</li>
	<li>移除 CMF，加入 3 mL 过滤后的 0.125% 胰蛋白酶溶液（用预热至 37 °C 的 CMF 稀释 2.5% 胰蛋白酶）。将组织在 37 °C 下准确孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻摇晃一次。 
	注意：胰蛋白酶溶液需在使用前立即配制。</li>
	<li>准备 5 mL 胰蛋白酶失活溶液（TIS；Hanks 平衡盐溶液，20% 新生牛血清和 1× DNase I 溶液 [10× 储存液：5 mM 醋酸钠，1 µM 氯化钙，0.5 mg/mL DNase I]）。</li>
	<li>移除胰蛋白酶溶液，并用冷 CMF 洗涤 2 次。加入 3 mL 冷 TIS。</li>
	<li>使用带有直径逐渐减小的针头的 3 mL 注射器通过吹打法解离细胞：分别用 14 G 针头吹打 30 次，15 G 针头吹打 30 次，16 G 针头吹打 20 次，18 G 针头吹打 20 次，21 G 针头吹打 15 次。前四种针头每次抽吸持续 2 秒，21 G 针头每次抽吸持续 3 秒。 
	注意：也可使用其他吹打方法（例如火焰抛光的玻璃移液管14,15）。我们发现，使用标准化的金属注射器针头可显著减少细胞聚团和细胞活性的变异性。</li>
	<li>使用 21 G 针头将一滴细胞悬液置于显微镜载玻片上，检查是否存在细胞聚团。若观察到多个聚团，则通过 22 G 针头再吹打三次并重新检查。重复此过程直至获得均一的单细胞悬液，整个过程中需注意轻柔吹打。</li>
	<li>使用 0.22 µm 注射器滤器过滤 5 mL 胎牛血清（FBS）。将细胞悬液轻柔地铺在 15 mL 圆锥形离心管中的 FBS 上层。离心细胞（4 °C 下 200 × g，5 分钟）。</li>
	<li>尽可能移除上清 FBS，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于 1 mL 温热（37 °C）的无抗生素神经基础培养基（NBM；添加 1× 谷氨酰胺替代物和 1× B-27）中。</li>
	<li>将细胞悬液用台盼蓝（0.4%）稀释后进行细胞计数。 
	注意：自动细胞计数器建议采用 1:1 稀释，血细胞计数板手动计数建议采用 1:60 稀释。若需继续进行细胞接种，此时神经元存活率应高于 90%，这将显著提高解离后神经元培养的健康程度。</li>
	<li>在预热的多聚赖氨酸（PDL）包被的四孔板中，以每孔 175,000 个细胞（70,000 个细胞/mm2）的密度，用 750 µL 无抗生素 NBM 接种细胞。此外，在 PDL 包被的 24 孔板中，每孔加入 200,000 个细胞于 1.5 mL 无抗生素 NBM 中，用于后续第 3 节所述转染实验中的条件培养基制备。将细胞置于湿度控制、37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。 
	&#8203;注意：可根据实验结果调整细胞密度。密度过高会增加神经元成像难度，密度过低则可能对培养物健康和神经元存活产生负面影响。根据我们的经验，大鼠神经元的接种密度可低于小鼠神经元。</li>
</ol>
3. 神经元转染
注意：神经元可在体外培养第7天或第8天进行转染，转染效率及物质运输结果无显著差异。上述体积适用于四孔玻璃底培养板，每孔体积为750 µL。本方案描述的是使用脂质转染试剂进行转染的方法。使用前请将培养基和转染试剂恢复至室温。
<ol>
	<li>将4.4 µL转染试剂加入127.6 µL低血清培养基中，配制转染试剂工作液。用手轻轻摇动混匀，室温孵育30分钟。</li>
	<li>在脂质转染孵育期间准备DNA储备液。将200 ng荧光载体DNA（pFIN mApple-突触素；12,112个碱基对）和200 ng用于表达目标蛋白的DNA（所用tau质粒为pCMV tau-Flag构建体；5,036个碱基对）加入减血清或无血清培养基中，终体积为32 µL。12加入0.8 µL转染增强试剂（每1 µg DNA加入2 µL），用手充分混匀。 
	注意：我们发现RFP的衍生物（如mApple或mCherry）效果最佳，但GFP也可使用。此外，可加入表达基因沉默小发夹RNA（shRNA）的DNA构建体，以验证目标蛋白表达所引起表型的潜在机制。为此，在DNA混合物中加入每种三种DNA构建体各150 ng，并相应调整转染增强试剂的用量。改变DNA或脂质体转染试剂的参数可能影响转染效率，可根据对转染效率高低的需求进行优化调整。</li>
	<li>向每管DNA中加入32 µL脂质体转染混合液。用手轻轻摇动混匀。室温孵育30分钟。</li>
	<li>缓慢加入64 µL DNA/转染试剂混合物至细胞中，将移液器枪头置于培养基液面下方，并以蛇形轨迹缓慢移动。加样至所有孔后，用手轻轻来回摇晃培养板3次，以进一步混匀，随后将培养板放入培养箱中。于37 °C、5% CO₂条件下培养2 2小时。 
	注意：神经元对温度和pH的变化极为敏感，且此类变化可能发生迅速，因此应尽量减少神经元在培养箱外的时间。</li>
	<li>转染后2小时，使用含神经束蛋白抗体的条件培养基进行半量换液。换液前立即从24孔板培养的细胞中收集1.5 mL无抗生素的条件性NBM培养基，向其中加入0.75 µL神经束蛋白186（NF-186）抗体（终浓度500 ng/mL）。 
	注意：NF-186 抗体可识别神经束蛋白（neurofascin）的胞外结构域，该结构域在轴突起始段（AIS）富集，可用于明确识别轴突以进行成像。</li>
	<li>转染后18小时进行完全换液&#160;含二抗的条件培养基。将1 µL与AlexaFluor 647偶联的山羊抗兔二抗加入3 mL来自24孔板的预收集无抗生素NBM条件培养基中，充分混匀。</li>
</ol>
4. 神经元成像
<ol>
	<li>转染后第2天准备成像。将共聚焦显微镜的活细胞培养室附件预热至37 °C（包括60倍物镜和镜油），并将培养室平衡至5% CO2。</li>
	<li>使用高倍物镜和活细胞培养室对细胞进行成像。 
	注意：我们使用激光扫描共聚焦显微镜配备60倍、1.40 NA物镜，但其他共聚焦系统（如转盘式）或宽场荧光显微镜，只要能够实现高成像帧率，也可使用。</li>
	<li>通过目镜在含有货物蛋白的通道中目视识别已转染的神经元。随后，在Cy5通道中成像以确定轴突起始段（AIS）的位置（图1）。</li>
	<li>将视野设置为32像素 × 128像素的矩形框，并将其移动至轴突上距离AIS远端约50–150 µm的区域进行成像。记录货物运输的方向性以及感兴趣区域（ROI）的取向。后续图像和视频中，该矩形框的顶部和右侧将分别对应于点的位置。请记录图像中哪一侧靠近胞体，哪一侧靠近轴突末端，以便在步骤5.1中正确绘制kymograph多段线。 
	注意：选择感兴趣区域时，所成像的孤立轴突区域应相对笔直，并在两端与视野相交。整个轴突片段应位于同一焦平面上。该区域应能清晰显示活跃的货物运输。过度明亮的神经元通常表达了高水平的货物蛋白及目标蛋白，可能对神经元产生毒性，应予以避免。</li>
	<li>将561激光功率设为1.40，针孔设为7.8，尺寸设为128 px2，速度设为32帧/秒。调节增益以清晰观察单个货物囊泡的运输过程，同时避免背景信号干扰（通常增益在10至50之间可获得高质量的kymograph）。 
	注意：由于使用了高灵敏度的GaAsP探测器，因此可实现极低的激光功率，从而避免潜在的光毒性效应和运动货物的光漂白。针孔尺寸尽可能设为最大，以增加焦深，确保整个ROI被完整成像，因为轴突可能并未完全平贴于载玻片表面。</li>
	<li>通过在ROI下拉菜单中选择绘制矩形ROI…来设定ROI。绘制ROI使其覆盖整个视野。右键单击ROI并选择用作刺激ROI：S1。</li>
	<li>在ND Setup选项卡中设置ND Setup，包含以下步骤： 
	注意：此为五步采集方案，仅需设置一次，之后每次采集视频时均由软件自动执行。
	<ol>
		<li>采集图像，以获取刺激前参考图像。</li>
		<li>刺激；ROI：S1；间隔：无延迟；持续时间：1.64秒，循环次数：7。此步骤通过激光多次脉冲漂白背景荧光。</li>
		<li>采集图像。此步骤获取刺激后参考图像。</li>
		<li>等待；无操作；2分钟。此步骤提供恢复期，使荧光标记的货物蛋白重新填充被漂白的ROI区域。</li>
		<li>采集；间隔：无延迟；持续时间：5分钟，循环次数：8,615。此步骤在5分钟成像期间以最高速度连续采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成ND Setup方案设置后，点击ND Setup选项卡上的应用刺激设置按钮。准备就绪后点击立即运行，以开始采集货物运输视频。这将启动步骤4.7中的ND采集方案。 
	注意：尽管帧率设定为32帧/秒，实际帧率可能略低（约28.7帧/秒）。该数值应被准确记录，用于第5节中kymograph的精确分析。理想情况下，活细胞运输成像应尽可能采用最高速帧率（例如&#62;25帧/秒），以更清晰地解析货物运动。</li>
	<li>将视野重置为完整图像；然后，在561和647通道中采集并保存包含ROI框的整个神经元图像。记录图像采集时的XY坐标，用于后续固定后确认目标蛋白的表达情况。</li>
	<li>至少从两个神经元采集运输视频用于分析。确保每个独立重复实验的数据来源于单次原代神经元培养所测变量的均值（即非来自单个神经元）。 
	注意：对于每次原代神经元培养，我们在每种条件下采集2–4个神经元的视频。</li>
	<li>通过移除培养基并加入预热的4%多聚甲醛&#160;在室温下孵育20分钟来固定细胞。移除固定液后，用TBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。 
	注意：对于多聚甲醛固定，我们使用细胞骨架缓冲液（一种常用于维持细胞骨架结构的缓冲液，成分为10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸[MES]、138 mM KCl、3 mM MgCl2和4 mM EGTA，pH 6.1）。其他缓冲液（如TBS、PBS）也可用于固定。</li>
	<li>通过免疫细胞荧光染色确认所分析的神经元同时表达了目标蛋白和荧光标记的货物蛋白。使用Tau12抗体染色以确认外源性tau蛋白的表达，使用β-III微管蛋白（Tuj1）抗体验证神经元在整个成像过程中保持健康状态。 
	&#8203;注意：采用这些方法时，几乎所有转染细胞均能观察到两种DNA构建体的共表达。</li>
</ol>
5. 生成并分析动态图像（Kymographs）
注意：可以使用多种不同的程序生成和分析线扫图（kymograph）。我们简要介绍免费提供的 KymoAnalyzer（v. 1.01）软件，该软件包含六个 ImageJ（v. 1.51n）插件16。这些插件可从恩卡拉萨实验室网站（https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer）的开发者处下载。该网站还提供有关此软件使用的更详细说明。
<ol>
	<li>根据实验条件和重复次数对步骤 4.9 中生成的视频进行分组。运行 BatchKymographGeneration 宏，并选择相应的文件夹。在该特定图像中，从轴突的近端起始处开始绘制用于追踪轴突的 kymograph 多段线。生成的 kymograph 将存储在所选文件夹中（图 2）。</li>
	<li>通过运行 Tracks 宏，选择单个视频文件夹，选择 是 以添加轨迹，然后点击以追踪每个颗粒的运动轨迹，从而手动分配轨迹。首次点击应在轨迹顶部，之后每当颗粒速度或方向发生变化时均需再次点击，使多段线与 kymograph 上颗粒的轨迹重叠。当多段线覆盖整个轨迹后，点击 确定。重复此过程，直至所有轨迹均被分配。</li>
	<li>运行其余宏，并根据成像参数设置 帧率 和 像素大小。首先运行 CargoPopulation，然后运行 NetCargoPopulation，最后运行 Segments。当提示输入 像素大小 和 帧率 时，输入相应数值（本设置中分别为 0.22 µm 和 28.7 帧/秒）。最后，运行 poolData 宏，以计算并汇总所选文件夹中所有 kymograph 的运输参数数据。</li>
	<li>绘制数据文件中的结果，并比较不同实验条件之间的差异，每个独立重复由单次神经元收获中所有分析神经元的平均值表示。</li>
</ol>

Visualizing Proteins in Primary Hippocampal Neurons by Live&#45;Cell Imaging

<ol><li>Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+tauopathies%3A+disease+relevance+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms.</a> Front Neurosci. 11, 572(2017).</li>
<li>Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+axonal+transport+misregulation+in+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tau and axonal transport misregulation in tauopathies.</a> Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+defects+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport defects in neurodegenerative diseases.</a> J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).</li>
<li>Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+extruded+axoplasm+from+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon.</a> Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).</li>
<li>LaPointe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminus+of+tau+inhibits+kinesin-dependent+axonal+transport%3A+implications+for+filament+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity.</a> J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+forms+of+tau+inhibit+kinesin-dependent+axonal+transport+through+a+mechanism+involving+activation+of+axonal+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases.</a> J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+in+the+amino+terminus+of+tau+prevents+inhibition+of+anterograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport.</a> Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).</li>
<li>Pigino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+fast+axonal+transport+is+a+pathogenic+mechanism+for+intraneuronal+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+huntingtin+inhibits+fast+axonal+transport+by+activating+JNK3+and+phosphorylating+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fast+axonal+transport+by+pathogenic+SOD1+involves+activation+of+p38+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase.</a> PLoS One. 8 (6), e65235(2013).</li>
<li>Combs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontotemporal+lobar+dementia+mutant+tau+impairs+axonal+transport+through+a+protein+phosphatase+1gamma-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).</li>
<li>Christensen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphomimetics+at+Ser199%2FSer202%2FThr205+in+tau+impairs+axonal+transport+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons.</a> Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. (65), 3634(2012).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Cox, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+isoform-specific+tau+aggregates+suggests+a+common+toxic+mechanism+involving+similar+pathological+conformations+and+axonal+transport+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition.</a> Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).</li>
<li>Tiernan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophosphorylation+of+tau+at+S422+enhances+SDS-stable+dimer+formation+and+impairs+both+anterograde+and+retrograde+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport.</a> Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).</li>
<li>Mueller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau%3A+a+signaling+hub+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tau: a signaling hub protein.</a> Front Mol Neurosci. 14, 647054(2021).</li>
<li>Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+maintenance+of+the+axon+initial+segment+and+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity.</a> J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).</li>
<li>Basu, H., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuoVadoPro%2C+an+autonomous+tool+for+measuring+intracellular+dynamics+using+temporal+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance.</a> Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

越来越多的证据表明，多种与神经退行性疾病相关的致病蛋白会破坏神经元中的快速轴突运输。这可能是这些疾病中神经毒性的共同机制。为了更好地理解这些蛋白破坏运输过程的机制，我们需要能够回答特定问题的工具和模型。本文所述方法可用于研究致病蛋白如何在啮齿类动物原代海马神经元中对囊泡运输产生负面影响的机制。
原代神经元提供了一个易于操作且仍保持快速轴突运输调控所有功能特性的实验体系。基于脂质体的神经元转染效率通常不高（我们通常观察到每孔有5-15个转染成功的神经元），但相比其他方法仍具有若干优势。首先，相对较低的转染效率使研究者能够清晰地观察来自单个孤立神经元胞体的突起过程。当与轴突初始段（AIS）的活细胞标记物（如neurofascin）联合使用时，可明确识别用于成像的轴突。先前的研究已证明，采用该方法对AIS进行活细胞成像不会影响AIS的功能20。
其次，脂质体转染还允许在几乎所有表达荧光运载蛋白的细胞中实现多个DNA质粒的共转染。这些质粒易于替换，因此可以方便地制备编码同一蛋白不同修饰形...

神经元依赖于轴突中货物的双向运输，以维持功能性突触和神经连接。轴突运输功能障碍被认为是多种神经退行性疾病发病机制中的关键因素，这些疾病包括阿尔茨海默病（AD）及其他tau蛋白病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病1,2,3。事实上，多种与疾病相关蛋白的病理学修饰会负面影响运输功能（详见综述4）。开发研究病理蛋白在疾病中发挥毒性作用机制的方法，对于理解神经退行性疾病并确定潜在的治疗干预靶点至关重要。
利用分离的鱿鱼轴浆模型，研究人员在轴突运输领域取得了一系列重要发现，包括传统驱动蛋白的发现、调控马达蛋白的激酶和磷酸酶依赖性通路，以及病理蛋白破坏轴突运输调控的机制4,5。将病理形式的tau蛋白灌注到鱿鱼轴浆中会抑制顺向快速轴突运输（FAT），该效应依赖于tau蛋白磷酸酶激活结构域的暴露，从而激活蛋白磷酸酶1（PP1）6,7,8。PP1进一步激活糖原合成酶激酶3（GSK3），后者磷酸化驱动蛋白轻链，导致其与运输货物解离。阿尔茨海默病（AD）中的另一类病理蛋白是β-淀粉样蛋白（amyloid-β）。寡聚形式的β-淀粉样蛋白通过激活酪蛋白激酶2（casein kinase 2）抑制双向快速轴突运输，该过程同样涉及驱动蛋白轻链的磷酸化9。此外，携带多聚谷氨酰胺扩展的亨廷顿病理蛋白以及与家族性肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的SOD1突变体，分别通过c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase）的活性，在鱿鱼轴浆模型中破坏轴突运输10,11。
尽管鱿鱼轴浆模型在研究病理性蛋白对轴突运输影响方面仍具有重要价值，但因设备和样本获取受限，其广泛应用受到限制。我们开发了一种利用活细胞共聚焦显微镜成像技术对啮齿类动物（小鼠和大鼠）原代神经元进行运输检测的方法。该模型基于哺乳动物神经元，采用广泛可得的细胞来源和显微镜系统，具有良好的可调节性和可操作性。例如，可通过表达多种病理性蛋白（如携带与疾病相关的修饰）来鉴定这些蛋白的特定修饰如何影响轴突内的运输过程。同样，也可使用多种荧光标记的货物蛋白来检测货物特异性的变化。此外，通过靶向调控可能介导这些效应的特定蛋白的表达（如基因敲低或过表达），可相对简便地研究其潜在的分子机制。该方法还可轻松适用于来自多种动物模型的原代神经元。
本文介绍了一种活细胞轴突运输检测的详细实验方案，该方法此前已在原代海马神经元中应用，用于证明与额颞叶脑叶变性症（FTLD）相关的突变型tau蛋白（P301L或R5L tau）可双向增加荧光标记的货物蛋白&#160;的暂停频率12。此外，敲低PP1γ亚型可逆转这种暂停效应12。这些结果支持了上述模型，即病理性tau蛋白通过异常激活由PP1启动的信号通路，进而介导轴突运输的破坏6,7,12。在另一项研究中，我们发现tau蛋白在S199/S202/T205位点的模拟磷酸化（与tau蛋白病相关的致病性AT8磷酸化表位）会增加货物蛋白的暂停频率以及顺向运输片段的速度，且这些效应依赖于tau蛋白N端的磷酸酶激活结构域13。这些实例凸显了该模型在揭示病理性蛋白如何干扰哺乳动物神经元中轴突运输机制方面的实用性。
本文详细描述了一种方法，首先从原代小鼠海马神经元的收获、解离和培养开始，随后转染携带与荧光蛋白融合的货物蛋白的神经元，最后进行活细胞成像及图像分析。我们以突变型tau蛋白对囊泡相关蛋白突触素双向运输的影响为例，展示了该方法的应用。然而，该方法中感兴趣的致病蛋白和运输货物蛋白具有可替换性，因此是一种研究轴突运输的通用性技术。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>DOT</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 带 21 G 针头的注射器</td><td>Fisher</td><td>14-826-84</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 塑料注射器</td><td>Fisher</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>14 G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-817-203</td><td></td></tr><tr><td>15 G 针头</td><td>Medline</td><td>SWD200029Z</td><td></td></tr><tr><td>16 G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-817-104</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-840-97</td><td></td></tr><tr><td>22 G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-840-90</td><td></td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>50-980-495</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>RRID:AB_2535813</td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Arruga 微型胚胎囊钳，弯型；4&quot;&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-5163</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>B-27 补充剂 (50x)，无血清</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat 24 孔多聚赖氨酸培养板&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-774-124</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 3 1/2&quot; 长 8 x 0.15 mm 角度尖头剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>细胞计数装置</td><td></td><td></td><td>自动或手动</td></tr><tr><td>配备活细胞培养室附件的共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦成像软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (Worthington)</td><td>Fisher</td><td>NC9185812</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fatal-Plus 溶液</td><td>Vortech Pharmaceuticals, LTD</td><td>NDC 0298-9373-68</td><td>戊巴比妥钠；也可使用其他经批准的安乐死方法&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>Gibco</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>谷氨酰胺替代物</td></tr><tr><td>汉克氏平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 版本 1.51n</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Life-Line 版本 2017 年 5 月 30 日：https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>KymoAnalyzer (版本 1.01)</td><td>Encalada 实验室</td><td></td><td>软件包包含全部 6 个宏：https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022050</td><td>需与 P3000 转染增强试剂共同使用</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MES 一水合物</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪刀 3.5&quot; 直型尖/尖</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus 培养基</td><td>Gibco</td><td>A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurofascin (A12/18) 小鼠 IgG2a</td><td>加州大学戴维斯分校/美国国立卫生研究院 NeuroMab</td><td>75-172</td><td>RRID:AB_2282826；250 ng/mL；适用于大鼠神经元，不适用于小鼠神经元</td></tr><tr><td>Neurofascin 186 (D6G60) 兔 IgG</td><td>Cell Signaling</td><td>15034</td><td>RRID:AB_2773024；500 ng/mL；适用于小鼠神经元，尚未在大鼠神经元中测试</td></tr><tr><td>新生小牛血清</td><td>Gibco</td><td>16010-167</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>P3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022057</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 x 10 mm 玻璃</td><td>Fisher</td><td>08-748B</td><td>用于解剖；高压灭菌</td></tr><tr><td>培养皿，100 x 20 mm 玻璃</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td>用于放置子宫角；高压灭菌</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P7886-100MG</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯锥形离心管 (15 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯锥形离心管 (50 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>十水合四硼酸钠</td><td>VWR</td><td>MK745706</td><td></td></tr><tr><td>直刃手术剪，钝/尖</td><td>Fisher</td><td>13-810-2</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>注射器滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>514-1263</td><td></td></tr><tr><td>齿状拇指敷料钳，4.5&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 4 孔玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>80427</td><td></td></tr></tbody></table>

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

沿轴突进行的货物双向运输对于维持功能性突触、神经连接以及神经元的健康至关重要。在多种神经退行性疾病中，轴突运输受到破坏，而投射神经元尤其脆弱，这是因为它们需要在长距离内运输细胞物质并维持大量的轴突结构。多种与疾病相关蛋白的病理学修饰对运输产生负面影响，包括tau蛋白、β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶以及亨廷顿蛋白，这提示了病理蛋白在疾病中发挥毒性的潜在共同机制。研究这些毒性机制的方法对于理解神经退行性疾病并确定潜在的治疗干预手段十分必要。
本实验中，培养的原代啮齿类动物海马神经元被共转染多种质粒，通过活细胞共聚焦成像观察荧光标记的货物蛋白的快速轴突运输，以研究病理蛋白对其影响。首先，从啮齿类动物中分离、解离并培养原代海马神经元。随后，将表达荧光标记货物蛋白以及野生型或突变型tau蛋白（作为病理蛋白的示例）的质粒DNA共同转染至神经元中。在活细胞中，利用可结合神经束蛋白（neurofascin）胞外&#160;结构域（轴突起始段蛋白）的抗体识别轴突，并对选定的轴突区域进行成像，以检测荧光货物蛋白的运输情况。
利用免费提供的 ImageJ 宏工具 KymoAnalyzer，我们对轴突运输的速度、暂停频率和定向 cargo 密度进行了全面表征，这些参数均可能受到病理蛋白存在的影响。通过该方法，我们鉴定出一种与病理性 tau 蛋白表达相关的表型，表现为 cargo 暂停频率增加。此外，可在转染体系中加入基因沉默的 shRNA 载体，以检测其他蛋白在介导运输障碍中的作用。该实验方案易于拓展应用于其他神经退行性疾病相关蛋白，是研究这些蛋白如何破坏轴突运输机制的一种可重复的方法。

利用这些方法，我们表征了在野生型或与疾病相关的tau蛋白存在条件下轴突运输的特征，以探究疾病中病理性tau蛋白诱导神经毒性的潜在机制12,13。KymoAnalyzer软件可计算并汇总指定文件夹内所有kymograph图的多种不同参数。运输速率仅在货物运动时计算（即分段速度），同时也计算包含暂停在内的总体速率（即净速度）。货物数量以总量、密度（#tracks/µm）或通量（#tracks∙µm-1∙s-1）表示。运行长度可单独或合并计算，以确定暂停之间移动的平均距离。货物暂停的特征包括持续时间、频率，以及货物处于非运动状态的时间百分比（即移动速度＜0.1 mm/s）。大多数测量参数均分别计算顺向和逆向运输方向的数据，以及两个方向的总和。此外，还计算运输方向逆转的频率和时间点。综合而言，这些参数可对特定轴突区域内目标蛋白存在条件下的货物运输进行系统而全面的表征。
我们表达了野生型tau蛋白，发现与表达GFP的对照神经元相比，...

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。

沿轴突进行的双向物质运输对于维持功能性突触、神经连接以及神经元的健康至关重要。轴突……

神经元依赖于沿轴突进行的双向物质运输，以维持功能性突触和神经连接。运输功能障碍被认为是多种神经退行性疾病发病机制中的关键因素。我们的目标是鉴定与疾病相关的 tau 蛋白修饰破坏轴突运输的机制。我们发现，多种病理形式的tau蛋白会破坏哺乳动物神经元中的正常轴突运输。这一效应依赖于调节轴突运输的磷酸化信号通路的改变。这些破坏代表了tau蛋白在疾病中引起神经毒性的潜在机制。特定蛋白质的修饰形式可在多种神经退行性疾病中破坏正常的快速轴突运输。然而，我们尚未完全理解这些效应的潜在机制。本文提供了一种可重复且简单的实验方案，用于鉴定与疾病相关的蛋白质表达如何影响哺乳动物神经元中的快速轴突运输。本方案提供了一种可重复的检测方法，用于研究哺乳动物原代神经元中的轴突运输，该方法易于修改，可同时检测多种货物蛋白以及具有特定病理修饰的目的蛋白的表达。此外，该方法还允许靶向敲低其他通路组分，以验证特定的作用机制细节。首先，向四孔玻璃底共聚焦培养皿的每个孔中加入750 µL多聚-L-赖氨酸溶液，进行包被处理。将载玻片在室温下孵育过夜。孵育结束后，用无菌去离子水洗涤载玻片四次，晾干，并在不立即使用时于4°C保存。接下来，对小鼠幼崽进行解剖。从枕骨大孔开始，使用显微解剖剪沿中线剪开皮肤和颅骨。操作时应将剪刀的下端尖部向上倾斜紧贴颅骨，以避免损伤脑组织。去除覆盖的皮肤，并小心移除颅骨，以暴露脑组织。用镊子夹住颅骨的口鼻部位并翻转颅骨，使脑组织朝下置于盛有0.9%生理盐水的培养皿中。将脑组织从颅骨中翻出，并剪断神经和脑干，使脑组织完全脱离并落入生理盐水中。将培养皿置于解剖显微镜下。 解剖海马体时，首先将剪刀插入脑的正中线，倾斜剪刀使上侧刀片将一侧大脑半球向外推开，剪开以分离该半球与皮层下区域。在皮层处做一垂直切口，使额叶皮层位于切口前方，海马体位于切口后方。将剪刀的下端尖部插入所形成的孔中，沿皮层顶端小心剪开，至后端终止。使用镊子小心地将皮层摆出，并完成后部切口。此时，海马应呈新月形。小心修剪残留的皮层，以保持海马的新月形。接下来，使用镊子和剪刀去除海马体上的脑膜。将海马体切成四个相等的部分，并放入含有冰冷的无钙无镁缓冲液的15毫升锥形管中。首先从胚胎小鼠脑中分离出海马体，并将分离的组织置于冰冷的无钙无镁缓冲液（CMF）中。接下来，移除 CMF，并用新鲜的冷 CMF 重复冲洗组织四次，每次冲洗之间轻轻摇动离心管。然后加入过滤的 0.125% 胰蛋白酶溶液，在 37 摄氏度孵育 15 分钟，每 5 分钟摇动一次。孵育结束后，去除胰蛋白酶溶液，并用冰冻的 CMF 洗涤两次。然后加入三毫升胰蛋白酶失活溶液。接下来，为了分离细胞，使用连接三毫升注射器的14号针头，每次抽吸两秒，反复吹打30次。接着使用15号针头以每次两秒抽吸的方式继续吹打30次，然后用16号针头吹打20次，最后用18号针头吹打20次。然后使用21号针头抽吸三次，每次持续三秒，重复15次以完成细胞解离。取一滴细胞悬液置于显微镜载玻片上，检查是否存在细胞团块。接下来，使用0.22微米注射器滤器过滤5毫升胎牛血清（FBS）。将细胞悬液轻柔地铺加到15毫升锥形管中的FBS上。在4°C下以200×g离心5分钟。弃去FBS，将沉淀物重悬于1毫升温热的无抗生素神经基础培养基中。用0.4%台盼蓝稀释细胞悬液并进行细胞计数。将细胞接种于预热的多聚-D-赖氨酸包被的四孔板中，每孔加入750 µL无抗生素的Neurobasal培养基。将细胞置于37°C、5% CO2的湿度控制培养箱中孵育。转染原代海马神经元两天后，准备使用共聚焦显微镜进行成像。将活细胞培养腔室附件、60倍物镜及镜油预热至37摄氏度，并将腔室平衡至5% CO2环境。通过目镜在含有货物蛋白的通道中识别已转染的神经元。接下来，单击扫描以成像神经元并识别 Psi 五通道的轴突起始段。将视野设置为 32 × 128 像素的矩形框，并移动该框以成像轴突起始段远端 50 至 150 微米区域。记录货物运输的方向性以及感兴趣区域（ROI）的方位，然后按“另存为”将其保存为文件。请注意，后续图像中盒子上的点将出现在顶部和右侧。记录图像中靠近细胞体的一侧以及靠近轴突末端的一侧，以确保kymograph多段线的正确方向。将561激光功率设为1.40，针孔设为7.8，尺寸设为128像素平方，速度设为每秒32帧。调节增益以清晰观察单个货物囊泡的运输过程，同时避免背景信号的干扰。从ROI下拉菜单中选择绘制矩形ROI，并绘制覆盖整个视野的ROI区域。然后右键单击并选择将其用作刺激ROI S1。接着，在ND设置选项卡中，单击采集图像以获取刺激前参考图像。然后将刺激设置为 ROI S1，间隔设为无延迟，持续时间为 1.64 秒，循环次数设为七次。接着点击获取图像，以采集刺激后的参考图像。选择等待、不进行采集，持续两分钟，为荧光货物重新填充被漂白的 ROI 提供恢复期。选择采集、间隔、无延迟，持续时间为五分钟，循环次数为8、615。在ND设置选项卡上单击“应用刺激设置”按钮，然后单击“立即运行”。同时至少采集两个神经元的转运视频用于分析。将视野重置为整幅图像，然后在561和647通道中采集包含ROI框的完整神经元图像。记录图像采集时的XY坐标，用于后续固定后确认蛋白表达。本实验采用该方案对转染表达货物蛋白mA-Synaptophysin的神经元进行活细胞成像。轴突起始段中神经束蛋白的胞外结构域也被标记。在轴突的兴趣区域进行了货物运输成像。此外，成像后的免疫荧光分析证实了tau蛋白与mA-Synaptophysin的共表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用活细胞成像测量病理蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

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活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

我们描述了一种通过荧光显微镜对活神经元中的线粒体进行长时间成像的实验方案。通过慢病毒介导表达线粒体靶向的荧光蛋白，并结合使用本实验室设计和构建的低成本载台式培养箱，可实现对样本的长期连续成像。...

神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像

本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。...

利用荧光恢复与荧光丢失光漂白技术评估培养神经元中膜蛋白的侧向扩散与胞吐作用

脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。...

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在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

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可视化培养小鼠神经元中轴突生长锥的塌陷及早期淀粉样蛋白β效应

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利用原代培养的海马神经元研究轴突起始段的组装

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

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拓展工具包 在体 内 轴突运输成像

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大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

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利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

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