利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

神经元依赖于沿轴突进行的双向物质运输，以维持功能性突触和神经连接。运输功能障碍被认为是多种神经退行性疾病发病机制中的关键因素。我们的目标是鉴定与疾病相关的 tau 蛋白修饰破坏轴突运输的机制。

我们发现，多种病理形式的tau蛋白会破坏哺乳动物神经元中的正常轴突运输。这一效应依赖于调节轴突运输的磷酸化信号通路的改变。这些破坏代表了tau蛋白在疾病中引起神经毒性的潜在机制。

特定蛋白质的修饰形式可在多种神经退行性疾病中破坏正常的快速轴突运输。然而，我们尚未完全理解这些效应的潜在机制。本文提供了一种可重复且简单的实验方案，用于鉴定与疾病相关的蛋白质表达如何影响哺乳动物神经元中的快速轴突运输。

本方案提供了一种可重复的检测方法，用于研究哺乳动物原代神经元中的轴突运输，该方法易于修改，可同时检测多种货物蛋白以及具有特定病理修饰的目的蛋白的表达。此外，该方法还允许靶向敲低其他通路组分，以验证特定的作用机制细节。首先，向四孔玻璃底共聚焦培养皿的每个孔中加入750 µL多聚-L-赖氨酸溶液，进行包被处理。

将载玻片在室温下孵育过夜。孵育结束后，用无菌去离子水洗涤载玻片四次，晾干，并在不立即使用时于4°C保存。接下来，对小鼠幼崽进行解剖。

从枕骨大孔开始，使用显微解剖剪沿中线剪开皮肤和颅骨。操作时应将剪刀的下端尖部向上倾斜紧贴颅骨，以避免损伤脑组织。去除覆盖的皮肤，并小心移除颅骨，以暴露脑组织。

用镊子夹住颅骨的口鼻部位并翻转颅骨，使脑组织朝下置于盛有0.9%生理盐水的培养皿中。将脑组织从颅骨中翻出，并剪断神经和脑干，使脑组织完全脱离并落入生理盐水中。将培养皿置于解剖显微镜下。

解剖海马体时，首先将剪刀插入脑的正中线，倾斜剪刀使上侧刀片将一侧大脑半球向外推开，剪开以分离该半球与皮层下区域。在皮层处做一垂直切口，使额叶皮层位于切口前方，海马体位于切口后方。将剪刀的下端尖部插入所形成的孔中，沿皮层顶端小心剪开，至后端终止。

使用镊子小心地将皮层摆出，并完成后部切口。此时，海马应呈新月形。小心修剪残留的皮层，以保持海马的新月形。

接下来，使用镊子和剪刀去除海马体上的脑膜。将海马体切成四个相等的部分，并放入含有冰冷的无钙无镁缓冲液的15毫升锥形管中。首先从胚胎小鼠脑中分离出海马体，并将分离的组织置于冰冷的无钙无镁缓冲液（CMF）中。

接下来，移除 CMF，并用新鲜的冷 CMF 重复冲洗组织四次，每次冲洗之间轻轻摇动离心管。然后加入过滤的 0.125% 胰蛋白酶溶液，在 37 摄氏度孵育 15 分钟，每 5 分钟摇动一次。孵育结束后，去除胰蛋白酶溶液，并用冰冻的 CMF 洗涤两次。

然后加入三毫升胰蛋白酶失活溶液。接下来，为了分离细胞，使用连接三毫升注射器的14号针头，每次抽吸两秒，反复吹打30次。接着使用15号针头以每次两秒抽吸的方式继续吹打30次，然后用16号针头吹打20次，最后用18号针头吹打20次。

然后使用21号针头抽吸三次，每次持续三秒，重复15次以完成细胞解离。取一滴细胞悬液置于显微镜载玻片上，检查是否存在细胞团块。接下来，使用0.22微米注射器滤器过滤5毫升胎牛血清（FBS）。

将细胞悬液轻柔地铺加到15毫升锥形管中的FBS上。在4°C下以200×g离心5分钟。弃去FBS，将沉淀物重悬于1毫升温热的无抗生素神经基础培养基中。

用0.4%台盼蓝稀释细胞悬液并进行细胞计数。将细胞接种于预热的多聚-D-赖氨酸包被的四孔板中，每孔加入750 µL无抗生素的Neurobasal培养基。将细胞置于37°C、5% CO2的湿度控制培养箱中孵育。

转染原代海马神经元两天后，准备使用共聚焦显微镜进行成像。将活细胞培养腔室附件、60倍物镜及镜油预热至37摄氏度，并将腔室平衡至5% CO2环境。通过目镜在含有货物蛋白的通道中识别已转染的神经元。

接下来，单击扫描以成像神经元并识别 Psi 五通道的轴突起始段。将视野设置为 32 × 128 像素的矩形框，并移动该框以成像轴突起始段远端 50 至 150 微米区域。记录货物运输的方向性以及感兴趣区域（ROI）的方位，然后按“另存为”将其保存为文件。

请注意，后续图像中盒子上的点将出现在顶部和右侧。记录图像中靠近细胞体的一侧以及靠近轴突末端的一侧，以确保kymograph多段线的正确方向。将561激光功率设为1.40，针孔设为7.8，尺寸设为128像素平方，速度设为每秒32帧。

调节增益以清晰观察单个货物囊泡的运输过程，同时避免背景信号的干扰。从ROI下拉菜单中选择绘制矩形ROI，并绘制覆盖整个视野的ROI区域。然后右键单击并选择将其用作刺激ROI S1。接着，在ND设置选项卡中，单击采集图像以获取刺激前参考图像。

然后将刺激设置为 ROI S1，间隔设为无延迟，持续时间为 1.64 秒，循环次数设为七次。接着点击获取图像，以采集刺激后的参考图像。选择等待、不进行采集，持续两分钟，为荧光货物重新填充被漂白的 ROI 提供恢复期。

选择采集、间隔、无延迟，持续时间为五分钟，循环次数为8、615。在ND设置选项卡上单击“应用刺激设置”按钮，然后单击“立即运行”。同时至少采集两个神经元的转运视频用于分析。

将视野重置为整幅图像，然后在561和647通道中采集包含ROI框的完整神经元图像。记录图像采集时的XY坐标，用于后续固定后确认蛋白表达。本实验采用该方案对转染表达货物蛋白mA-Synaptophysin的神经元进行活细胞成像。

轴突起始段中神经束蛋白的胞外结构域也被标记。在轴突的兴趣区域进行了货物运输成像。此外，成像后的免疫荧光分析证实了tau蛋白与mA-Synaptophysin的共表达。