一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

我们致力于在分子水平上深入理解正常与恶性造血过程的调控机制，并利用这些研究成果开发治疗血液系统肿瘤的新疗法。肿瘤异种移植模型是评估基因改变或治疗手段对肿瘤行为影响的不可或缺的工具。然而，小鼠异种移植模型成本高昂、耗时较长，且应用范围有限。

利用斑马鱼进行肿瘤异种移植可克服上述所有缺点。在本方案中，我们展示了一种简便且快速的异种移植接种方法，可提高实验通量。此外，我们采用细胞染色来评估接种物的质量，并进一步通过流式细胞术评估或定量疾病负荷，以检测肿瘤的进展。

我们计划利用这种方法来发现阻断Ras/MAP激酶级联功能的新途径，该通路驱动了绝大多数人类癌症的发生。我们将不是通过抑制Ras/MAP激酶级联的催化活性，而是通过阻止其对所修饰的致癌底物进行磷酸化的能力来实现这一目标。首先，获取在适宜移植条件下培养的白血病细胞。

计数细胞后，在室温下以300 g离心5分钟，弃去上清液。进行CM-Dil染色时，将细胞重悬于工作液中，使每100微升含有1×10⁶个细胞，于37摄氏度孵育10分钟。用10毫升1×HBSS在室温下洗涤细胞两次。

在300 ×g离心5分钟后，将细胞重悬于含1% FBS的PBS中，调整细胞密度至每微升40,000个细胞。然后打开显微注射仪和泵。设定注射压力为9至11磅每平方英寸，注射时间为0.5秒，用于剪切针尖并设定喷口大小。

用微量移液器小心地单次加入约五微升肿瘤细胞悬液至微针中，避免产生气泡。使用Dumont 5号镊子剪断针尖，形成可支持喷射的开口。随后在显微镜下挑选健康的斑马鱼胚胎，剔除任何具有发育异常的胚胎。

使用玻璃巴氏吸管吸取麻醉后的胚胎，并将10至15个胚胎以侧向位置排列在1.5%琼脂糖平板上。去除多余水分，仅保留维持胚胎存活所需的最低水量。接着，在光学显微镜下确认针头切割良好且带有细胞。

将相当于400至600个细胞的10至15纳升溶液注入胚胎卵黄中，持续0.2至0.3秒。所有胚胎注射完毕后，将其收集至新鲜的胚胎水中。注射后一小时，观察细胞团块，以区分染色效果或团块质量优良的胚胎与染色效果或团块质量较差的胚胎。

CM-Dil 染色和荧光蛋白标记使得能够通过显微镜监测疾病进展，并且在注射两种基因不同的白血病细胞系后，胚胎的存活率下降。首先，获取已注射经 CM-Dil 预染色白血病细胞的斑马鱼胚胎。将麻醉后的胚胎转移至 1.5 毫升离心管中，使用 P200 移液器在 100 微升无钙林格溶液中溶解卵黄，持续 5 分钟。

将每份去卵黄的胚胎样品与1毫升胰蛋白酶-胶原酶溶液在29摄氏度下孵育30至35分钟。每5分钟使用P1000枪头在此溶液中上下吹打胚胎一次，直至背柱结构不可见为止。为终止反应，向离心管中加入200微升胎牛血清（FBS）。

充分混匀后，于4°C继续孵育5分钟。在4°C、300 g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液后，用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次，并通过70 μm细胞筛网过滤细胞。

洗涤细胞后，将细胞沉淀重悬于含有针对移植细胞的抗体的染色缓冲液中。在4°C下孵育20分钟。离心收集细胞沉淀。

将细胞重悬于200微升含有1微摩尔Helix NP Blue的染色缓冲液中。将细胞混合物转移至5毫升圆底聚碳酸酯管中，进行流式细胞术检测。双重标记可用来测量良好与较差团注接种之间肿瘤负荷的差异。