Name: 一种简单、快速、有效的透明斑马鱼胚胎肿瘤异种移植分析方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习一种快速高效的斑马鱼胚胎异种移植方法，用于肿瘤行为研究。该方案结合细胞染色与流式细胞术评估疾病负担，为血液癌症研究提供经济可靠的体内模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R37AI110985和P30CA006927、宾夕法尼亚联邦拨款、白血病与淋巴瘤学会以及Bishop基金支持。本研究还得到了福克斯蔡斯癌症中心核心设施的支持，包括细胞培养、流式细胞术和实验动物设施。&#160;我们感谢Jennifer Rhodes博士在福克斯蔡斯癌症中心负责斑马鱼和显微注射设施的维护工作。

斑马鱼的维持、喂养和饲养在标准水产养殖条件下于28.5 °C进行，如文献31所述。所有与斑马鱼相关的实验均在此温度下进行；然而，在异种移植后，动物在实验期间于34 °C下培养，此操作符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序。
1. 繁殖（注射前3天）
<ol>
	<li>在繁殖前一周，为配对的鱼提供干燥饲料（额外饲料；每条鱼5-6粒），以最大限度地提高动物健康状况，并增加繁殖配对产生的胚胎数量。</li>
	<li>在收集胚胎的前一天晚上，将待繁殖的鱼放入繁殖缸中，并用隔板将雄鱼和雌鱼分开，采用一雄多雌的交配方式，每条雄鱼配2条雌鱼。 
	注意：对于每个实验组包含100只动物、共4个实验组的实验，每次实验需使用20对繁殖鱼。要确定所需繁殖对的数量，可参考一个良好的估算值，即每对casper繁殖鱼可产生约50个胚胎。另一种选择是使用更具繁殖力的有色斑马鱼品系，并用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理以抑制色素形成31。实际操作中，实验规模应确保获得的胚胎数量为注射后1天（dpi）所需数量的两倍。</li>
</ol>
2. 胚胎收集（注射前两天）
<ol>
	<li>第二天早晨，移除隔板，使鱼类开始繁殖。</li>
	<li>移除隔板后20分钟（min），在培养皿中观察鱼缸中的胚胎。</li>
	<li>使用筛网收集胚胎，并置于含有胚胎水的90 mm培养皿中，胚胎水的配制方法如《斑马鱼手册》31所述。
	<ol>
		<li>配制胚胎水时，将1.5 mL储存盐溶液加入1 L蒸馏水中，并加入亚甲蓝至终浓度0.1%。储存盐溶液的配制方法为：将40 g海盐（材料表）溶解于1 L蒸馏水中。胚胎水的离子组成为 K+（0.68 mg/L）、Cl−（31.86 mg/L）、Na+（17.77 mg/L）、SO4−（4.47 mg/L）、Mg2+（2.14 mg/L）和 Ca2+（0.68 mg/L）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让斑马鱼继续繁殖额外一小时，并收集新产生的胚胎。</li>
	<li>将用于实验的胚胎合并在一起。</li>
	<li>傍晚时，移除所有未受精或已死亡的胚胎（可通过其异常形态识别），并更换新鲜的胚胎水。</li>
</ol>
3. 胚胎维持及注射工具准备（注射前一天）
<ol>
	<li>次日早晨，移除所有额外的死亡胚胎，并更换新鲜的胚胎水。</li>
	<li>将1.5%琼脂糖溶于胚胎水中，加热溶解后倒入90 mm培养皿中制备琼脂糖平板。每个90 mm培养皿需要30–35 mL该混合液。</li>
	<li>使用玻璃毛细管（硼硅酸盐）通过拉针仪制备无丝毛细针。在加热加压条件下拉制毛细管&#160;形成封闭末端，再用镊子剪开以获得理想的开口。通过测定单位时间内排出液体的体积来评估针尖开口的适用性（见下文，&#160;第6.3节）。 
	注意：玻璃毛细管可购买带或不带中心丝的型号。进行细胞注射时，优先选用无中心丝的毛细管。</li>
	<li>将毛细针置于用黏土（儿童彩泥）在90 mm培养皿内刻出的凹槽中，并加盖保存，直至使用（图2A）。</li>
</ol>
4. 使用 CM-Dil 标记白血病细胞的制备与标记（注射当天）
<ol>
	<li>在适合细胞生长的最佳条件下培养待移植的细胞。本实验所用的小鼠白血病细胞对核糖体蛋白 Rpl22 要么充足（M82；Rpl22+/+），要么缺乏（M109；Rpl22-/-），该蛋白具有肿瘤抑制功能32。</li>
	<li>将细胞在 50 mL 锥形管中离心收集。计数后，在室温（RT）下以 300 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。 
	注：所需细胞数量取决于实验范围和条件，但 1 × 106 个细胞是一个合适的起始点。</li>
	<li>进行 CM-Dil 染色 
	注：CM-Dil 染色可用于监测注射团块。
	<ol>
		<li>通过将 50 µg CM-Dil 冻干粉溶于 50 µL 二甲基亚砜（DMSO）中制备储存液（终浓度为 1 mg/mL 或约 1 mM）。</li>
		<li>将储存液按 4.8 µL 染料/mL 的比例稀释于含有所需支持性补充物的 1% 胎牛血清（FBS）/Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，制备工作液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于染色工作液中，浓度为 1 × 106/100 µL。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 10 分钟。 
	注：染色条件需根据所用细胞进行优化（如时间等）。本实验中所用细胞需在不同温度下进行两次独立的 10 分钟孵育，以达到最佳染色效果。</li>
	<li>用 10 mL 的 1× HBSS 在室温（RT）下洗涤一次。</li>
	<li>将细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，然后用 10 mL HBSS 重悬，重复相同步骤进行第二次洗涤。</li>
	<li>将染色后的肿瘤细胞以 40,000 个细胞/µL 的浓度重悬于含 1% FBS 的 PBS 及所需支持性补充物中，并将细胞悬液维持在 34 °C 直至注射。 
	注：本研究所用细胞系的维持需要支持性补充物（例如 1% FBS 和细胞因子）。具体补充物及异种移植条件可能需根据研究中的特定细胞系进行调整。此处选用 PBS 而非培养基，以避免对卵黄产生潜在毒性。</li>
</ol>
5. 脱膜
<ol>
	<li>在体视显微镜下使用胰岛素注射器，在2倍放大条件下，于受精后2天（2 dpf）手动去除casper斑马鱼胚胎的卵膜。用一根针刺穿卵膜，同时用另一根针固定卵膜。 
	注意：不建议使用蛋白酶（pronase）进行去卵膜处理，因为这有时会导致胚胎健康状况下降。选择在受精后2天（2 dpf）去卵膜更为理想，因为此时操作更简便，且胚胎比更早期（如1 dpf）时更不易受损。</li>
	<li>去卵膜过程中，需小心避免针头接触胚胎。若针头意外触碰或损伤胚胎卵黄，可能导致胚胎死亡。</li>
	<li>通过更换胚胎培养液，清除已脱落的卵膜碎片。</li>
</ol>
6. 设置显微注射仪和注射针
<ol>
	<li>打开显微注射仪和泵，设置适合细胞显微注射的条件。建议以9–11 psi的注射压力和0.5秒（s）的注射时间作为剪切针尖和设定孔径的起始参数。</li>
	<li>将肿瘤细胞系悬液（约5 µL）小心地单次吸入显微针中，避免产生&#160;气泡，以免干扰针内细胞流。</li>
	<li>使用镊子（Dumont 5号）剪切针尖末端，形成一个每0.2–0.3秒可喷出10–15纳升（nL）细胞悬液的孔径。 
	注：上述nL&#160;体积的计算使用校准毛细管进行，其中1 mm = 30 nL。简而言之，先将注射时间设为0.5 s，每次剪切针尖后按下注射键，并用校准毛细管收集液滴，然后在显微镜下利用刻度测量收集液体的长度。当0.5 s内注射量达到30 nL时停止剪切针尖。随后将注射时间调整为0.2–0.3 s（即每次注射约10–15 nL细胞）。</li>
</ol>
7. 注射用胚胎的制备
<ol>
	<li>在显微镜下选择健康的胚胎，剔除具有发育异常的胚胎，如心包水肿或躯干短小或弯曲的胚胎。</li>
	<li>使用三卡因甲磺酸盐（MS-222；胚胎水中浓度为 0.16 g/L）在 90 mm 培养皿中对胚胎进行 1 分钟的麻醉处理。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管吸取胚胎，将 10–15 个胚胎以侧位排列在 1.5% 琼脂糖平板上（图 2B-D）。</li>
	<li>用巴斯德吸管吸去多余水分，仅保留维持胚胎&#160;存活所需的最少胚胎水。</li>
</ol>
8. 注射操作步骤
<ol>
	<li>在显微镜下检查，确保细胞已聚集在针尖处。</li>
	<li>使用校准过的针头向胚胎卵黄内注射0.2–0.3秒（对应10–15 nL，约含400–600个细胞）。</li>
	<li>对所有胚胎重复注射操作，然后将其收集至新鲜的胚胎水中。 
	注意：由于细胞容易在针尖处积聚，每注射15–20个胚胎后需重新剪切针尖。每次重新剪切后还需重新调整压力和时间，以确保每次注射的体积一致。</li>
	<li>为确保对两组不同移植细胞行为的比较具有有效性，需监测细胞团块的移植情况。可通过在注射后1小时（hpi）根据CM-Dil染色（在RFP通道中）对胚胎进行分选，将染色理想者（&#34;良好团块&#34;）与染色较差者（&#34;较差团块&#34;；图3，黄色箭头）区分开来。</li>
	<li>弃除具有较差团块的胚胎，或将其用于评估不同细胞剂量对疾病进展的影响。</li>
	<li>在当天结束前移除所有死亡胚胎，因其死亡通常与注射损伤有关，而非肿瘤生长所致。将未保留细胞的胚胎从分析中剔除&#160;，因为细胞可能已从注射部位泄漏&#160;。</li>
	<li>将注射后的胚胎置于直径90 mm的培养皿中，在34 °C条件下持续培养，每皿约放置60个胚胎。 
	注意：5 dpf后，胚胎生长将消耗完卵黄，因此在整个实验期间需为胚胎提供草履虫作为食物。为保证充分营养，应从6 dpf（4 dpi）至9 dpf（7 dpi）每日向胚胎投喂草履虫。草履虫可通过在最佳营养与温度条件下于烧瓶中培养进行扩增，具体方法见文献31。</li>
</ol>
9. 生存分析
<ol>
	<li>在接下来的7天内监测胚胎发育情况，每天更换胚胎培养用水。若实验涉及药物处理，为方便起见，可改为隔天换水。</li>
	<li>在整个分析期间检查胚胎健康状况，并记录死亡情况。 
	注意：本&#160;实验&#160;的实验周期为7天，但具体时长可根据异种移植肿瘤的侵袭性进行调整，可能更短或更长。</li>
	<li>利用CM-Dil荧光评估疾病负荷（图4A），并通过Kaplan-Meier分析确定基因改变或药物处理对存活率的影响，并以图形方式展示（例如使用GraphPad Prism软件；图4B）33。</li>
</ol>
10. 胚胎单细胞悬液制备用于流式细胞术分析
注意：异种移植后可通过流式细胞术分析评估疾病负荷；然而，该方法需要对肿瘤细胞进行永久性标记。使用逆转录病毒或慢病毒递送的红色荧光蛋白（RFP）或 mCherry 是有效的，因其信号可显著超越斑马鱼细胞的自发荧光，而绿色荧光蛋白的信号则会被斑马鱼细胞的自发荧光所掩盖。
<ol>
	<li>选择所需 dpi 阶段的胚胎进行分离。此处展示的是 5 dpi 胚胎（图 5）。</li>
	<li>每种条件初始收集 30–40 个胚胎，但胚胎数量可根据发育阶段及移植细胞的侵袭性进行调整。&#160;按上述方法对胚胎进行麻醉。 
	注意：如图所示，可将胚胎分组作为重复样本，以确保统计学显著性（图 5B）。</li>
	<li>将胚胎转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>每份样品使用 100 μL 无钙林格氏液（配方31）以溶解卵黄，低钙环境可软化胚胎组织，从而实现更有效的组织解离。</li>
	<li>使用 200 μL 移液枪头间歇性吹打 5 分钟，以去除卵黄。</li>
	<li>将 0.05% 胰蛋白酶/PBS（不含酚红指示剂）预热至 29 °C，并每毫升胰蛋白酶溶液中加入 27 μL 胶原酶 IV（100 mg/mL）。每份胚胎样品需使用 1 mL 消化液。</li>
	<li>向每份去卵黄的胚胎样品中加入 1 mL 胰蛋白酶/胶原酶混合液，在 29 °C 下孵育 30–35 分钟。</li>
	<li>每隔 5 分钟使用 1 mL 移液枪头在此溶液中上下吹打胚胎，直至胚胎结构（脊柱）不再可见。</li>
	<li>加入 200 μL 胎牛血清（FBS）以终止反应。</li>
	<li>充分混匀后，在 29 °C 下继续孵育 5 分钟，以确保胰蛋白酶完全失活。 
	注意：组织解离过程中采用 29 °C 是为了避免在 37 °C 下引发斑马鱼细胞的热休克死亡；但如果无需保持斑马鱼细胞活性，消化可在 37 °C 下进行。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>用 4 °C 的 PBS 重悬细胞沉淀，并按上述条件离心。</li>
	<li>重复洗涤一次，然后通过 70 µm 细胞滤网过滤细胞。</li>
	<li>离心收集细胞沉淀，随后进行染色以用于流式细胞术分析。 
	注意：若需培养原代斑马鱼细胞，则需再用 4 °C 的 PBS 洗涤两次，并重悬于 L15 培养基（含抗生素和 10% FBS）中。</li>
</ol>
11. 荧光激活细胞分选（FACS）：异种移植细胞的染色与分选
<ol>
	<li>用染色缓冲液（含1% FBS的HBSS）重悬细胞悬液，300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀用染色缓冲液重悬，并加入针对移植细胞的抗体，以提供第二个标记物（除RFP或mCherry外），用于区分移植细胞与斑马鱼细胞。本实验中，每份样品使用50 µL抗小鼠CD45抗体（APC-CD45），按1:50稀释（图5）。</li>
	<li>4 °C孵育20分钟后，加入1 mL染色缓冲液，同上洗涤以去除未结合的抗体。</li>
	<li>弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于200 µL含活细胞染料Helix NP Blue（1 µM）的染色缓冲液中，用于活/死细胞区分。</li>
	<li>将细胞悬液转移至5 mL圆底聚碳酸酯管中，用于流式细胞术分析。 
	注意：平行染色肿瘤细胞对照有助于在流式细胞术分析时更清晰地设门。</li>
</ol>
12. 流式细胞术
<ol>
	<li>开启可用的流式细胞仪，并使用低流速（每秒500个事件或更低）来设置参数。</li>
	<li>使用肿瘤细胞对照（即用于异种移植的相同细胞）设置FSC（前向散射）、SSC（侧向散射）、BV421/CasB（活性）、CE-594（mCherry）和APC（CD45.2）通道的电压。 
	注意：需要使用单染样本建立补偿设置，以消除不同荧光染料之间的信号重叠。</li>
	<li>使用未注射的胚胎样本建立能够同时容纳移植细胞和斑马鱼细胞的检测设置。</li>
	<li>将流速提高至每秒8000个事件，并为每个样本记录100万个事件。</li>
	<li>使用适当的分析软件分析所得数据，首先通过绘制FSC-H与FSC-A（高度与面积）选择单细胞，然后绘制图像以筛选活细胞。FlowJo软件广泛用于此类分析。</li>
	<li>利用肿瘤细胞对照，在FSC-A与SSC-A图上圈定移植细胞的门控区域，然后使用指示染料（本例中为CD45和mCherry）进一步确认（图5B）。 
	注意：为肿瘤选定的大小门控区域也会包含斑马鱼细胞，这为归一化处理和疾病负荷的确定提供了依据。</li>
	<li>使用上述相同的门控设置分析胚胎样本。最终的肿瘤染色与荧光蛋白指示图将提供疾病负荷的量化指标（图5C）。 
	注意：此处绘制了接受足量细胞注射的胚胎与接受不足量细胞注射的胚胎之间疾病负荷差异的比较。</li>
	<li>如有需要，可通过流式细胞术对胚胎中的肿瘤细胞进行分选，用于后续分子分析。</li>
</ol>

Utilizing Larval Zebrafish for Efficient In Vivo Tumor Studies

<ol><li>Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharma%2C+G+%22Preclinical+Animal+Models+of+Cancer%3A+Applications+and+Limitations%22">Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations</a>. , Springer. Singapore. (2022).</li>
<li>Singhal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancement+in+breast+cancer+research%3A+Insights+from+model+organisms-Mouse+models+to+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish.</a> Cancers. 15 (11), 2961(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+in+cancer+therapy%3A+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).</li>
<li>Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuochi%2C+S+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).</li>
<li>Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intraperitoneal%2C+orthotopic%2C+and+metastatic+xenograft+models+of+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer.</a> Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).</li>
<li>Deroose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+imaging+of+tumor+xenografts+and+metastases+in+mice+with+combined+small-animal+PET%2C+small-animal+CT%2C+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging.</a> J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).</li>
<li>Zeng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+evolution%2C+interfering+factors%2C+applications%2C+and+challenges+of+patient-derived+xenograft+models+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice.</a> Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).</li>
<li>Adhish, M., Manjubala, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+zebrafish+models+in+understanding+human+diseases-A+review+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models.</a> Heliyon. 9 (3), e14557(2023).</li>
<li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+mainstream+model+for+in+vivo+systems+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology.</a> Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).</li>
<li>Choe, S. -K., Kim, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+powerful+model+for+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).</li>
<li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer%3A+the+state+of+the+art+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer+avatars%3A+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+xenograft+assay+of+human+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis.</a> F1000Res. 7, 1682(2018).</li>
<li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+in+vivo+zebrafish+model+of+human+multiple+myeloma+to+study+preclinical+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy.</a> Blood. 128 (2), 249-252 (2016).</li>
<li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+drug+screening+in+zebrafish+xenografts+reveals+high+efficacy+of+dual+MCL-1%2FBCL-XL+inhibition+against+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma.</a> Cancer Lett. 554, 216028(2023).</li>
<li>Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaxi%2C+D+%22Handbook+of+Animal+Models+and+its+Uses+in+Cancer+Research%22">Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research</a>. , Springer. Singapore. (2022).</li>
<li>Li, X., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+zebrafish+patient-derived+xenograft+tumor+models+in+the+development+of+antitumor+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents.</a> Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenograft+model+as+a+preclinical+platform+for+uveal+melanoma+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery.</a> Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).</li>
<li>Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+screening+to+identify+anti-metastatic+drugs+in+Twist1a-ER%28T2%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish.</a> Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).</li>
<li>Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%2Ftumor+xenograft+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li>
<li>Casey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+pediatric+brain+tumors+into+immune-competent+hosts+for+long-term+study+of+tumor+cell+behavior+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response.</a> J Vis Exp. (123), e55712(2017).</li>
<li>Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+transplantation+device+for+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (174), e62767(2021).</li>
<li>Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+larval+xenografts+and+tumor+behavior+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis.</a> J Vis Exp. (172), e62373(2021).</li>
<li>Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+behavior+of+human+breast+cancer+cells+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish.</a> J Vis Exp. (122), e55459(2017).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768(2011).</li>
<li>Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+cancer+using+zebrafish+xenografts%3A+drawbacks+for+mimicking+the+human+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment.</a> Cells. 9 (9), 1978(2020).</li>
<li>Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+analyses+using+small+fish+models+reveal+new+mechanisms+that+regulate+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yakugaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis.</a> Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Oregon. (2000).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+ribosomal+protein+L22+promotes+transformation+by+induction+of+the+stemness+factor%2C+Lin28B%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B.</a> Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).</li>
<li>Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+survival+analysis%3A+Kaplan-Meier+estimate%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ayurveda+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate.</a> Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).</li>
<li>Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+zebrafish+patient-derived+xenografts+from+pancreatic+cancer+for+chemosensitivity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing.</a> J Vis Exp. (195), e63744(2023).</li>
<li>Murali Shankar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+CAR-NK+cell-mediated+killing+efficacy+and+pharmacokinetics+in+a+rapid+zebrafish+xenograft+model+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer.</a> Front Immunol. 14, 1254821(2023).</li>
<li>Takahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+lineage+cells+on+zebrafish+embryo+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart.</a> Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Regan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+long-term+label-retaining+colon+cancer+stem+cells+identifies+novel+regulators+of+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence.</a> iScience. 24 (6), 102618(2021).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

斑马鱼异种移植已成为小鼠研究的一种快速、可靠且经济高效的替代方法12。尽管已有多种斑马鱼异种移植方法被报道，但我们对该方法的改进取得了显著优化。除了对操作相关参数进行标准化之外，这些改进特别聚焦于加快肿瘤注射的速度，从而能够在每个实验组中增加动物数量，并利用肿瘤标记来监测注射质量及注射后的生物学行为。
尽管本文所述对该方法的改进具有巨大潜力，但成功实施该策略仍需要经验丰富的操作人员，并针对具体应用进行优化。我们采用了白血病细胞，因此，实体瘤的应用可能会带来额外挑战。此类肿瘤可能易于发生聚集，从而导致细胞团注过程中的递送变异性；然而，即便在此类情况下，RFP标记仍应能够实现注射后对细胞团质量的有效质控。该优势优于GFP标记或绿色染料，因其信号易受自发荧光干扰而难以分辨。最后，本文对影响成功率的大多数参数（胚胎健康状况、水产养殖温度、注射针孔径、注射压力等）进行了标准化，从而最大限度地降低了该过程的变异性。
在斑马鱼异种移植实验中，注射位点的选择是一个重要考虑因素。本文表明，相对于其他技术上更具挑战性的注射位点（如卵周隙34、库维叶管35和心室内注射（心室）36），卵黄注射相对容易操作。卵黄注射的缺点在于卵黄是胚胎发育过程中的重要器官，因此必须谨慎控制注射针的直径和压力，以避免因注射损伤导致胚胎死亡。本文所述方法通过尽量减少损伤，并在注射后1天（1 dpi）时剔除任何明显受损或死亡的胚胎，从而缓解了这一问题，因为这些情况与肿瘤生长无关。关于注射位点的另一个考虑是，不同的微环境对异种移植肿瘤增殖的支持能力可能存在差异。因此，或许可在进行更具挑战性的原位注射之前，先采用卵黄注射。卵黄注射的主要优势在于无需精确判断胚胎发育阶段，因而能够更快地对大量胚胎进行注射，更有利于维持胚胎健康，并提高检测移植肿瘤细胞行为差异的统计效力。
注射后的疾病进展监测通常通过 Kaplan-Meier 分析评估其对存活率的影响37；然而，疾病负荷检测也可提供重要信息。对于停留在注射部位的移植细胞，只要肿瘤细胞的标记方法不受自发荧光干扰，即可采用多种显微镜技术定量肿瘤负荷29。CM-Dil 染料易于分辨且不受自发荧光影响，因此适用于定量局部细胞的肿瘤负荷。当肿瘤细胞未停留在注射部位而发生播散时，则面临挑战。在此类情况下，结合使用不可逆遗传标记（如红色荧光蛋白）的流式细胞术，是监测标准化胚胎批次中疾病负荷的有效方法，因为可通过与斑马鱼细胞不同的物种特异性染料来分析标记的肿瘤。CM-Dil 的一个缺点是其会因细胞分裂而被稀释38。因此，采用 RFP 或 mCherry 对肿瘤进行遗传标记具有显著优势。结合肿瘤特异性抗体检测 mCherry 表达，可在宿主斑马鱼细胞产生的复杂背景信号中可靠地识别出移植细胞。
综上所述，本研究中采用的优化斑马鱼异种移植方法及分析技术，使这一原本已十分强大的实验平台得到了显著改进。

分析肿瘤在基因改变或药物处理下的行为反应 体内 是癌症研究中的一个基本要素1,2,3,4此类研究通常涉及使用免疫缺陷型小鼠（Mus musculus）模型5然而，小鼠异种移植研究在诸多方面存在局限性，包括容量有限、实验周期长、成本高昂，以及需要复杂的成像设备来监测体内肿瘤的进展6,7相比之下，斑马鱼模型（Danio rerio可实现更高的容量、更短的持续时间、更低的成本，并且由于其透明性，可简便地监测疾病进展8,9.
斑马鱼是一种发育完善的脊椎动物模型系统，具有体外发育和高繁殖力的特点，单条雌鱼可产下超过100个胚胎10。此外，斑马鱼胚胎具有透明性，便于利用荧光相关技术（如报告基因）直观观察发育过程。最后，由于关键发育过程在进化上的保守性，斑马鱼成为多种研究的理想模型，包括移植恶性细胞行为的研究11,12。野生型斑马鱼胚胎会发育出黑色素细胞，使其在2周龄时变为光学不透明；但这一限制已被casper胚胎（roya9; mitfaw2）的建立所克服，这类胚胎终生保持透明13。由于其优良的光学特性，casper斑马鱼是移植肿瘤细胞的理想受体14,15,16。过去二十年中，将肿瘤细胞异种移植至斑马鱼的研究日益重要17,18,19,20,21。斑马鱼胚胎具有先天免疫系统，但在幼体阶段缺乏适应性免疫，因此在功能上处于免疫缺陷状态，这使其能够有效作为移植肿瘤异种移植物的宿主22。
已针对斑马鱼胚胎及成体中的肿瘤移植建立了多种实验方案，这些方案考虑了多种不同的变量23,24,25,26,27。研究探索了在斑马鱼体内多个不同部位进行肿瘤接种的方法，包括卵黄、卵周腔、心脏等位置的注射，并涵盖了不同的发育阶段16,28。斑马鱼异种移植养殖的环境温度也至关重要，因为斑马鱼通常在28 °C下培养，而哺乳动物细胞的最佳生长温度为37 °C。因此，必须采用一个折中的温度，既能被斑马鱼耐受，又能支持肿瘤生长，34 °C似乎能够同时满足这两个条件29。异种移植后对肿瘤行为和进展的分析是另一个研究重点，涉及多种成像技术以及生存分析方法的应用30。斑马鱼模型的一个主要优势在于可提供大量实验动物，从而为研究肿瘤行为的体内实验带来强大的统计学效力；然而，以往的方法由于注射过程中繁琐的固定操作，严重限制了这一潜力的发挥。
在此，我们通过建立一种简单、快速的胚胎分期方法来克服这一局限性，该方法利用透明的casper斑马鱼品系实现高通量分析及注射质量监控。该方法包括在受精后2天（dpf）将异种移植物注射到casper斑马鱼胚胎的卵黄囊中。我们将异种移植后胚胎的存活情况作为肿瘤行为分析的一部分进行观察。此外，我们通过制备单细胞悬液并结合流式细胞术分析，进一步展示了异种移植后疾病负荷的评估方法（图1）。

<table><tbody><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>70 微米细胞筛</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>90 毫米培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S43565</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Apex bioresearch</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（APC anti-mouse CD45.2 Antibody）</td><td>Biolegend</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSymphony A5</td><td></td></tr><tr><td>校准毛细管</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1424-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>细胞示踪染料 CM-dil</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶（Collagenase IV）</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 55 号镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>型号 SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（硼硅酸盐）</td><td>World precision instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Helix NP Blue</td><td>Biolegend</td><td>425305</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Instant ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>型号 SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td>M9140-100G</td><td></td></tr><tr><td>微量移液加载器（长头型，用于细胞加载）</td><td>eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>P1000 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter instruments</td><td>型号 P-97</td><td></td></tr><tr><td>PM 1000 细胞微量注射仪</td><td>MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td><td>PM1000</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulphate，即氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Ethyl 3-aminobenzoate methanesulphate）</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼成鱼辐照饲料（干饲料）</td><td>Zeigler</td><td>388763</td><td></td></tr></tbody></table>

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

体内肿瘤行为研究是癌症研究中的常规手段；然而，使用小鼠模型在成本和时间方面存在显著挑战。本文中，我们提出幼年斑马鱼作为一种移植模型，相较于小鼠模型具有多项优势，包括操作简便、成本低廉以及实验周期短。此外，在幼体阶段斑马鱼缺乏适应性免疫系统，因此无需构建或使用免疫缺陷品系。尽管已有成熟的斑马鱼胚胎异种移植实验方案，本文介绍了一种改进的方法，包括胚胎分期以实现快速移植、存活率分析，以及利用流式细胞术评估疾病负荷。通过胚胎分期，可实现细胞快速注射至幼鱼卵黄，并对细胞进行标记以监测注射细胞团的一致性。注射后，对胚胎存活情况进行评估，直至注射后7天（dpi）。最后，通过荧光蛋白标记移植细胞并结合流式细胞术分析，进一步评估疾病负荷。流式细胞术的实现依赖于一种标准化的斑马鱼胚胎细胞悬液制备方法，该方法也可用于建立斑马鱼细胞的原代培养。综上所述，本文所述方法可在每个实验组使用更多数量的动物，以更快速、更经济的方式实现对肿瘤细胞体内行为的评估。

异种移植 
整个实验与分析的全面概览如图所示 图1，涵盖从胚胎制备到通过存活率分析及流式细胞术检测疾病负荷来评估疾病进展的全过程。该方法在异种移植的可重复性和可扩展性方面实现了多项改进，并提供了一种评估疾病负荷的新途径。实验的成功高度依赖于移植细胞的健康状态，处于非健康状态或非对数生长期的细胞在移植后无法有效增殖。注射过程的持续时间也是一个关键参数。肿瘤细胞制备完成后，必须在3-4小时内完成向斑马鱼胚胎的注射。本研究所采用的方法通过将胚胎直接侧向固定在琼脂糖板上并注射至卵黄中这一简单改进，可在规定时间内实现更高数量胚胎的注射图 2C,D此外，必须选择合适的针头孔径，以确保注入足够数量的细胞（400–600个），同时避免孔径过大而损伤胚胎。另一个需要考虑的因素是注射压力。我们发现，当压力超过12–13 psi时，会破坏胚胎的卵黄，导致胚胎死亡。最后，该操作本身存在的另一项变异性在于注射的一致性。待注射的细胞会沉降到注射针的末端，使得对注射体积的精确控制变得困难。在进行异种移植时，理论上所有胚胎均可接受相同体积的注射，但实际上并非如此。图3）。转移的细胞数量可能因肿瘤细胞的行为（例如聚集）和操作者的技术水平而存在较大差异。我们通过CM-Dil染色/mCherry标记来解决这一不确定性，从而可在注射后对接受适当且一致细胞团块的动物以及接受较差团块的动物进行分类。CM-Dil染色具有一定的标记效果，但使用荧光蛋白标记更为有效，其额外优势在于可通过显微镜观察或流式细胞术监测疾病进展图4 和 图5).
肿瘤行为分析 
肿瘤进展可通过聚焦于RFP的简单荧光显微镜轻松监测图 4A）。同样，传统的生存监测可通过Kaplan-Meier分析（Log-rank检验和Wilcoxon检验）进行（图 4B令人印象深刻的是，与基于小鼠的异种移植研究（通常每组仅有8-10只动物）相比，采用本文所述的斑马鱼方法，每组动物数量超过60只并不困难。图4B）。这显著提高了分辨率 体内 研究。最后，我们还采用了一种基于流式细胞术的疾病负荷分析方法。该方法包括对等量的胚胎进行破碎处理，并通过流式细胞术分析所得单细胞悬液中的肿瘤细胞含量。通过结合肿瘤特异性细胞表面标志物与荧光蛋白指示剂，可利用流式细胞术明确鉴定异种移植的小鼠/人源细胞，从而实现对疾病负荷的评估（图5）。出于这一目的，红色荧光蛋白更具优势，因为绿色荧光蛋白无法在宿主斑马鱼细胞的自发荧光背景下提供可检测的信号。本研究中采用 mCherry 与 CD45 联合标记细胞，并用于异种移植过程中通过流式细胞术（FACS）进行细胞示踪与监测。双重标记使我们能够量化不同注射质量（良好注射与较差推注）之间肿瘤负荷的差异。图 5B,C).
<img alt="斑马鱼异种移植实验示意图；繁殖、胚胎收集、白血病细胞染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：整个异种移植及注射后分析流程的示意图。（A）繁殖设置、胚胎收集以及受精后2天（dpf）的形态示意图。（B）白血病细胞的制备、染色及向斑马鱼胚胎卵黄中的注射，用于异种移植。（C）异种移植后的分析，包括存活率检测和流式细胞术分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于丝状生长抑制的培养皿实验；微生物分析标记图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：注射所用工具的代表性图像。（A）培养皿中拉制好的玻璃微针。（B）用于胚胎分期的琼脂糖平板。（C,D）用于注射的胚胎加载平板，显示已分期的胚胎（C 面板为代表性示意图，D 面板为实际胚胎，红色圆圈标出）。D 面板右下角插图为分期胚胎的高倍放大视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼幼体基因型比较，显微镜图像，Rpl22+/+ 与 Rpl22-/-，荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：异种移植胚胎的代表性图像。 显示了在感染后1天（dpi）的 casper 胚胎卵黄中CM-Dil染料（红色）阳性细胞的明场和免疫荧光图像（整窝胚胎图像）。带有下方团块的胚胎用黄色箭头标示，形态异常的胚胎用星号标示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼感染进展、显微荧光成像、生存分析图表、Rpl22基因型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：通过荧光成像和生存分析评估疾病进展。（A）异种移植胚胎在感染后第4天和第7天的代表性图像。（B）Kaplan-Meier生存曲线，显示携带两种不同遗传背景白血病细胞系的胚胎生存分析结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用胰蛋白酶消化和细胞染色进行流式细胞术的过程；图表显示白血病细胞分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：异种移植斑马鱼中疾病负荷的流式细胞术分析。（A）细胞悬液制备及流式细胞术分析的示意图。简言之，在感染后第4天（4 dpi）将胚胎用胰蛋白酶和胶原酶消化为单细胞悬液，随后进行流式细胞术分析。（B）流式细胞术分析的代表性图谱，其中每个图中左侧为FSC-A与SSC-A图，右侧为CD45与mCherry信号图。（C）柱状图显示根据CD45与mCherry图谱获得的异种移植细胞的细胞统计结果，数据来自未注射、发育良好及发育较差的胚胎（每组重复实验n = 45、40和40，共3次重复实验；*p值 ≤ 0.05，采用GraphPad Prism 9软件中的非配对t检验并进行Welch校正计算）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。

体内研究肿瘤行为是癌症研究的常规手段；然而，使用小鼠存在成本高和耗时长等显著挑战。在这里，我们……

我们致力于在分子水平上深入理解正常与恶性造血过程的调控机制，并利用这些研究成果开发治疗血液系统肿瘤的新疗法。肿瘤异种移植模型是评估基因改变或治疗手段对肿瘤行为影响的不可或缺的工具。然而，小鼠异种移植模型成本高昂、耗时较长，且应用范围有限。利用斑马鱼进行肿瘤异种移植可克服上述所有缺点。在本方案中，我们展示了一种简便且快速的异种移植接种方法，可提高实验通量。此外，我们采用细胞染色来评估接种物的质量，并进一步通过流式细胞术评估或定量疾病负荷，以检测肿瘤的进展。我们计划利用这种方法来发现阻断Ras/MAP激酶级联功能的新途径，该通路驱动了绝大多数人类癌症的发生。我们将不是通过抑制Ras/MAP激酶级联的催化活性，而是通过阻止其对所修饰的致癌底物进行磷酸化的能力来实现这一目标。首先，获取在适宜移植条件下培养的白血病细胞。计数细胞后，在室温下以300 g离心5分钟，弃去上清液。进行CM-Dil染色时，将细胞重悬于工作液中，使每100微升含有1×10⁶个细胞，于37摄氏度孵育10分钟。用10毫升1×HBSS在室温下洗涤细胞两次。在300 ×g离心5分钟后，将细胞重悬于含1% FBS的PBS中，调整细胞密度至每微升40,000个细胞。然后打开显微注射仪和泵。设定注射压力为9至11磅每平方英寸，注射时间为0.5秒，用于剪切针尖并设定喷口大小。用微量移液器小心地单次加入约五微升肿瘤细胞悬液至微针中，避免产生气泡。使用Dumont 5号镊子剪断针尖，形成可支持喷射的开口。随后在显微镜下挑选健康的斑马鱼胚胎，剔除任何具有发育异常的胚胎。使用玻璃巴氏吸管吸取麻醉后的胚胎，并将10至15个胚胎以侧向位置排列在1.5%琼脂糖平板上。去除多余水分，仅保留维持胚胎存活所需的最低水量。接着，在光学显微镜下确认针头切割良好且带有细胞。将相当于400至600个细胞的10至15纳升溶液注入胚胎卵黄中，持续0.2至0.3秒。所有胚胎注射完毕后，将其收集至新鲜的胚胎水中。注射后一小时，观察细胞团块，以区分染色效果或团块质量优良的胚胎与染色效果或团块质量较差的胚胎。CM-Dil 染色和荧光蛋白标记使得能够通过显微镜监测疾病进展，并且在注射两种基因不同的白血病细胞系后，胚胎的存活率下降。首先，获取已注射经 CM-Dil 预染色白血病细胞的斑马鱼胚胎。将麻醉后的胚胎转移至 1.5 毫升离心管中，使用 P200 移液器在 100 微升无钙林格溶液中溶解卵黄，持续 5 分钟。将每份去卵黄的胚胎样品与1毫升胰蛋白酶-胶原酶溶液在29摄氏度下孵育30至35分钟。每5分钟使用P1000枪头在此溶液中上下吹打胚胎一次，直至背柱结构不可见为止。为终止反应，向离心管中加入200微升胎牛血清（FBS）。充分混匀后，于4°C继续孵育5分钟。在4°C、300 g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液后，用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次，并通过70 μm细胞筛网过滤细胞。洗涤细胞后，将细胞沉淀重悬于含有针对移植细胞的抗体的染色缓冲液中。在4°C下孵育20分钟。离心收集细胞沉淀。将细胞重悬于200微升含有1微摩尔Helix NP Blue的染色缓冲液中。将细胞混合物转移至5毫升圆底聚碳酸酯管中，进行流式细胞术检测。双重标记可用来测量良好与较差团注接种之间肿瘤负荷的差异。

a-simple-rapid-effective-method-for-tumor-xenotransplantation

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

一种简单、快速、有效的透明斑马鱼胚胎肿瘤异种移植分析方法

本视频介绍了一种将乳腺癌细胞显微注射到转基因斑马鱼胚胎卵周隙的方法。孵育后，我们在荧光显微镜下观察胚胎，以监测癌细胞的侵袭、播散和转移过程。...

zPDX-侵袭性分析：利用斑马鱼胚胎异种移植模型研究转移性癌细胞的侵袭行为

本视频介绍了利用斑马鱼异种移植模型评估体内肿瘤形成并研究治疗药物作用的方法。...

斑马鱼异种移植实验：一种评估治疗药物在斑马鱼体内对肿瘤发生抑制效果的方法

本视频展示了将斑马鱼脑肿瘤细胞原位移植到免疫健全的斑马鱼胚胎第四脑室的过程。该方法可实现对肿瘤细胞侵袭行为和长期动态的观察研究。...

斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的长期原位移植：一种将肿瘤细胞高效递送至斑马鱼胚胎第四脑室以长期分析肿瘤细胞行为的方法

癌症细胞移植是研究癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术依赖于免疫缺陷型动物。本文介绍一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫健全胚胎中的方法，用于长期分析肿瘤细胞行为 体内...

将斑马鱼儿童脑肿瘤移植到免疫健全宿主中以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应

该方法旨在通过将哺乳动物肿瘤细胞异种移植到血管带有荧光标记的斑马鱼胚胎中，建立体内肿瘤血管生成模型。通过成像观察异种移植的肿瘤及其相关血管，可定量评估血管生成反应。...

斑马鱼肿瘤异种移植模型中宿主血管生成反应的活体成像与定量分析

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。...

斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

胚胎学操作（如细胞切除和移植）是研究早期发育的重要工具。本方案描述了一种简单且有效的移植装置，可用于斑马鱼胚胎的此类操作。...

一种用于斑马鱼胚胎移植的简单高效装置

临床前模型旨在增进对癌症生物学的认识并预测治疗效果。本文描述了利用肿瘤组织碎片建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。对zPDXs进行化疗处理，并通过检测移植组织中细胞的凋亡情况来评估其治疗效果。...

建立胰腺癌斑马鱼患者来源异种移植模型用于化疗敏感性测试

本文介绍了一种利用先进的机器人注射系统将肿瘤异种移植物自动植入斑马鱼幼鱼的详细实验方案。此外，我们还提供了注射过程视频及验证数据，以展示该系统的成功运行效果。...

自动化斑马鱼幼鱼肿瘤移植用于癌症研究与医学

学习一种快速高效的斑马鱼胚胎异种移植方法，用于肿瘤行为研究。该方案结合细胞染色与流式细胞术评估疾病负担，为血液癌症研究提供经济可靠的体内模型。

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

探索更多视频