Name: CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: 了解CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测技术，用于便携式癌症诊断。该方法通过工程化分子工具提高疾病检测灵敏度，实现肿瘤相关蛋白酶活性的体外分析。

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本研究部分得到了美国国家癌症研究所科赫研究所支持基金（编号 P30-CA14051，斯旺森生物技术中心）、美国国家环境卫生科学研究所核心中心基金（P30-ES002109）、科赫研究所大理石癌症纳米医学中心、科赫研究所前沿研究计划（通过凯西和柯特·马布尔癌症研究基金）以及弗吉尼亚和D.K.路德维希癌症研究基金的资助。A.E.V.H. 获得了美国国立卫生研究院资助的博士前培训基金（T32GM130546）。S.N.B. 是霍华德·休斯医学研究所研究员。L.H. 获得了美国国家癌症研究所K99/R00独立之路奖以及波士顿大学启动资金的支持。

所有动物实验均经作者所在机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验需在标准的动物护理设施中进行，包括饲养箱、无菌操作台、麻醉设备以及符合伦理终点的安乐死措施。所有实验均按照机构和国家指南执行，并由机构的兽医人员监督。实验所用的雌性BALB/c小鼠购自商业来源（见材料表），在研究开始时年龄为6至8周。定制合成的DNA序列、crRNA、基于FRET的肽底物探针及传感器肽序列详见补充表1。
1. 蛋白酶激活肽底物的选择
<ol>
	<li>根据已发表的文献方法13，采集并制备健康肺组织或含有肿瘤结节的肺组织样本。
	<ol>
		<li>将组织在预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中进行匀浆（每毫升 PBS 含 200 mg 组织），使用组织解离管将组织自动解离为单细胞悬液。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 6,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液至新离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 25 分钟。</li>
		<li>使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度（参见材料表）。</li>
		<li>向样品中加入 PBS，配制成浓度为 0.33 mg/mL 的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤评估蛋白水解活性。
	<ol>
		<li>在 384 孔板中，向每个孔加入 5 µL、6 µM 的基于荧光共振能量转移（FRET）的肽底物探针。每种探针均需设置三个重复。 
		注：基于 FRET 的肽底物探针包含一段短肽序列（6–8 个氨基酸，设计为特异性靶向某种或某类蛋白酶），其两端分别连接荧光基团和淬灭基团。两种 FRET 探针示例见补充表 1。完整的探针文库可参见 Hao 等人.13。</li>
		<li>在室温下以 180 × g 离心 10 秒，确保探针沉降至孔底。</li>
		<li>向每个孔中加入 25 µL 浓度为 0.33 mg/mL 的组织样品或 40 µM 的重组蛋白酶13。 
		注：组织样品或重组蛋白酶的终浓度可能需要根据其内在的蛋白水解活性进行优化。例如，蛋白水解活性较高的组织（如肠道组织）可能需要更高的稀释倍数，以便监测初始酶切反应。</li>
		<li>在室温下短暂以 180 × g 离心，使探针与组织裂解液充分混合。</li>
		<li>立即开始使用酶标仪在 37 °C 条件下每 2 分钟检测一次荧光信号，持续 1 小时（λex：485 nm；λem：535 nm），以监测探针的切割情况。 
		注：应根据具体的荧光基团-淬灭基团组合选择合适的激发和发射波长。本研究中，参数（λex：485 nm，λem：535 nm）适用于 FAM 荧光基团。</li>
		<li>使用 Python 软件（参见材料表）进行酶动力学分析，相关程序包可从 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 获取。该脚本通过前 8–10 个初始时间点的线性拟合斜率计算初始反应速率（V0）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 传感器的配制与表征
<ol>
	<li>合成DNA与蛋白酶激活肽（PAP）的偶联物。
	<ol>
		<li>将含3'-DBCO基团的20-mer硫代磷酸酯DNA报告分子（1.1当量，参见材料表）与C端为半胱氨酸的叠氮末端PAP在100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中于室温孵育&#62;4小时。若过夜反应，则在4 °C下孵育。</li>
		<li>使用配备适用于生物分子分离色谱柱的高效液相色谱（HPLC）系统纯化产物（参见材料表）。设置HPLC梯度洗脱程序：起始为5% A相缓冲液（0.05% TFA溶于H2O），等度保持20分钟，随后在65分钟内线性升至80% B相缓冲液（0.05% TFA，99.95%乙腈），流速为0.3 mL min-1，收集保留时间约为31分钟的偶联产物。</li>
		<li>采用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对纯化后的偶联物进行验证14（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合成DNA编码的活性依赖型纳米传感器。
	<ol>
		<li>将2 mg多价PEG（40 kDa，8臂，含马来酰亚胺反应性基团，参见材料表）溶解于1 mL 100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，并经滤膜（截留分子量：0.2 µm）过滤。</li>
		<li>向PEG溶液中加入C端为半胱氨酸的DNA-肽偶联物（2当量，参见材料表），于室温反应&#62;4小时。若过夜反应，则在4 °C下孵育。</li>
		<li>使用商品化的葡聚糖-琼脂糖复合基质柱，在快速蛋白液相色谱（FPLC）系统上通过尺寸排阻色谱法去除未偶联的组分（参见材料表）。以PBS为流动相进样，并在260 nm处监测DNA吸收，在280 nm处监测肽段吸收。</li>
		<li>使用超滤离心管（截留分子量MWCO = 10 kDa）根据制造商推荐转速浓缩所合成的纳米传感器（参见材料表）。</li>
		<li>使用单链DNA定量检测试剂盒（参见材料表）及酶标仪在激发波长λex：485 nm和发射波长λem：535 nm条件下测定DNA浓度。将纳米传感器储存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征DNA编码的活性依赖型纳米传感器。
	<ol>
		<li>通过动态光散射（DLS）测定DNA编码纳米传感器的流体动力学粒径。 
		注：纳米传感器预期粒径范围为15–50 nm，平均粒径为20–30 nm。若需更窄的粒径分布，可在步骤2.3中使用FPLC分离不同分子量的窄分布组分。</li>
		<li>使用超滤离心管（MWCO = 10 kDa）将纳米传感器浓缩至0.5 mg/mL（以DNA浓度计），并将样品加载至安装在冷冻样品台上的碳膜覆盖铜网上。采用冷冻透射电子显微镜（200 kV，放大倍数10,000–60,000）观察其形貌14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 传感器植入与尿液采集
<ol>
	<li>收集尿液以进行基线测量。
	<ol>
		<li>将小鼠放入定制的饲养箱中（参见 补充图1以96孔板为基础。</li>
		<li>固定小鼠，并轻轻按压膀胱，使残留尿液排到培养板上。</li>
		<li>将小鼠放回正常饲养环境后，用移液器将96孔板中收集的尿液（约100–200 µL）转移至1.5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立小鼠肿瘤的临床前模型。
	<ol>
		<li>通过尾静脉注射，将表达荧光素酶的MC26-Fluc细胞系（100,000个细胞/只）接种至6至8周龄的BALB/c雌性小鼠（参见 材料表）。每周使用以下方法监测肿瘤进展 体内 荧光成像系统 
		注意：此特定细胞系注射后约在第2周出现发光信号指示的可见肿瘤负荷。在肿瘤进展期间，需定期仔细检查荷瘤动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在肿瘤植入后的不同时间点注射纳米传感器。
	<ol>
		<li>在无菌 PBS 中制备含有纳米传感器的注射溶液（最大体积 200 µL），浓度为每 DNA 条形码 1 nmol。</li>
		<li>向每只实验小鼠静脉注射200 µL PBS中的传感器溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在传感器注射后1小时，按照步骤1.1-1.3所述，采集健康对照组和荷瘤小鼠的尿液样本。 
	&#8203;注意：新鲜尿液样本可直接用于DNA条形码分析，或立即在冰上冷冻。</li>
</ol>
4. 基于DNA条形码的CRISPR检测：基于荧光的方法
<ol>
	<li>使用新鲜尿液样本或解冻样本&#160;冰上的冻存样品。以800 x g离心尿液样品 g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将试剂混合 补充表 2，加入Cas12a酶（参见 材料表用移液器轻轻吹打反应液，最后充分混匀。37 °C 下孵育反应体系 30 分钟。</li>
	<li>运行报告反应，如图所示 补充表3，使用步骤2的产物进行三次重复实验。最后加入步骤2的反应液，并迅速放入酶标仪中。</li>
	<li>检测 Lba通过酶标仪在37 °C下每2分钟测量一次荧光，持续3小时，以检测Cas12a的激活（λex：485 nm 和 λem：535 nm）以监测DNA报告分子的切割动力学。</li>
	<li>为分析荧光测量数据，可使用位于 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 的 Python 软件包进行酶动力学分析。该脚本可计算初始反应速率（V0使用最初8-10个时间点的线性拟合斜率进行计算。</li>
</ol>
5. 基于CRISPR的DNA条形码检测：纸质平台
<ol>
	<li>将尿液样本在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。 
	注意：并行进行基于荧光和基于试纸的 CRISPR 检测的尿液样本检测。</li>
	<li>混合补充表 2中的试剂，在 37 °C 下孵育 30 分钟。 
	注意：此孵育步骤与基于荧光的 CRISPR 检测中的步骤相同。</li>
	<li>使用 FAM-生物素标记的 DNA 报告分子在试纸条上进行侧向流动分析的报告反应（参见材料表）。将补充表 4中的试剂与第 2 步的产物混合于 96 孔板中，用铝箔覆盖后在 37 °C 下孵育 1 小时。 
	注意：根据上述基于荧光的 CRISPR 检测实验中实时动力学监测结果，选择最佳孵育时间。</li>
	<li>向一个新的 96 孔板孔中加入 80 µL PBS，再向该孔中加入 20 µL 第 3 步的样本。</li>
	<li>将一条侧向流动试纸条放入每个孔中，等待液体迁移至试纸条顶端（&#60;5 分钟）。观察试纸条上是否出现对照带和/或样本带。</li>
	<li>拍摄侧向流动试纸条的图像，并使用 ImageJ 量化条带强度。</li>
</ol>

CRISPR-Cas Synthetic Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

<ol><li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li>
<li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li>
<li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li>
<li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Canc+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+new+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomarkers%3A+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li>
<li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262(2020).</li>
<li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li>
<li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216(2021).</li>
<li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li>
</ol>

S.N.B.、L.H. 和 R.T.Z. 被列为与本研究内容相关的专利申请的发明人。S.N.B. 持有 Glympse Bio、Satellite Bio、Lisata Therapeutics、Port Therapeutics、Intergalactic Therapeutics 和 Matrisome Bio 的股权，并在 Vertex 担任董事；同时为 Moderna 提供咨询服务，并从 Johnson &amp; Johnson、Revitope 和 Owlstone 获得委托研究资助。

本文展示了一种高度可定制的平台，用于通过便携式尿液检测进行多重癌症检测。该检测利用微创注射型传感器评估与疾病相关的蛋白水解活性。当被肿瘤蛋白酶激活时，肽底物的切割信号会被放大 通过 DNA条形码释放至尿液中。尿液样本中的合成DNA报告分子可通过基于CRISPR-Cas的二级酶促扩增进行检测，检测方式包括荧光测定或简单的纸质试纸测试。DNA条形码技术是一种具有吸引力的合成生物标志物标记方法，可实现多重检测。通过化学修饰提高DNA条形码的稳定性，对于维持纳米传感器的稳定性至关重要。 体内具体而言，DNA条形码检测 通过 CRISPR-Cas12a 可通过使用全硫代磷酸酯修饰且骨架稳定的 DNA 条形码进行激活。由于此类化学修饰增强了稳定性，相较于天然 DNA 条形码，CRISPR-Cas12a 的激活速度有所降低。此外，在 crRNA 上引入末端修饰，或在 DNA 条形码中测试不同类型的修饰寡核苷酸，可能进一步提高基于 CRISPR 的 DNA 条形码检测的灵敏度15从而提高癌症诊断的检测限（LOD）。
<p class="jove...

尽管人们已投入大量努力来识别肿瘤生物标志物（如脱落的蛋白质和DNA），但由于这些标志物在循环系统中丰度极低或易迅速降解，癌症诊断领域仍面临挑战1。作为一种补充策略，生物工程合成的生物标志物能够选择性响应疾病特征并产生放大的信号，为实现准确且可及的诊断提供了新途径2,3。为了辅助检测，这些合成生物标志物利用肿瘤依赖性的激活机制（如酶促放大）生成具有更高信噪比的分析物4。本文利用一类与癌症相关的酶——蛋白酶，激活可注射的纳米级传感器，使其释放可在血液或尿液等生物流体中检测到的疾病报告分子5,6。鉴于肿瘤具有异质性，开发一组蛋白酶激活型传感器可实现多分析物检测，将不同的蛋白酶切割事件整合为“疾病特征谱”，从而以更特异、多重的方式评估癌症的发生与进展。
蛋白酶激活的合成生物标志物已被开发出来，其由肽底物与惰性载体表面偶联而成7注射时 体内这些肽被携带至肿瘤部位，随后由肿瘤蛋白酶进行酶切，释放出可在血液或尿液中被检测的报告分子。基于蛋白酶激活的合成生物标志物的多重检测，要求混合物中的每种合成生物标志物均标记有独特的分子条形码。为此，已发展出多种方法，包括质谱条形码和配体编码的报告分子。8,9,10与这些多重检测方法相比，后者可能仅限于少数几种信号可能性，而DNA条形码技术则能够提供更多的组合，以适应人类疾病状态的高度复杂性和异质性。为了扩展合成生物标志物的多重检测能力，通过为每种报告分子标记独特的DNA序列以用于检测，从而实现传感器的条形码编码。 通过 CRISPR-Cas核酸酶用于放大生物流体信号 离体这些单链DNA（ssDNA）条形码被设计用于结合互补的CRISPR向导RNA（crRNA），从而激活CRISPR-Cas12a的靶标触发式附属核酸酶活性11这种核酸酶活性可用于切割报告DNA链，通过荧光动力学或试纸条进行检测。
除了通过蛋白酶（in vivo）和CRISPR-Cas（ex vivo）实现分子扩增外，蛋白酶激活型合成生物标志物的另一项关键设计特征是利用纳米材料的药代动力学特性，以提高生物流体中诊断信号的浓度10。其中一种方法是采用纳米颗粒载体，以延长表面偶联肽底物的循环时间。本研究选择聚乙二醇（PEG）树状大分子作为纳米载体，因其具有相对较小的流体动力学直径和多价性，有助于提高向肿瘤的递送效率。PEG载体的尺寸足够小以促进肿瘤递送，但又大于肾脏肾小球滤过屏障约5 nm的截留阈值，因此只有被切割后的肽底物才能经肾脏滤过进入尿液，从而利用肾脏的尺寸筛选机制实现信号富集12。本实验方案概述了在临床前小鼠模型中合成与应用DNA条形码标记的活性依赖型纳米传感器的多步骤流程，重点介绍了CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测方法的建立过程。该团队已利用此方法在多种癌症类型的小鼠模型中实现疾病状态的分类13。得益于其灵活的设计原理，该纳米传感器的三个功能组分——纳米载体（PEG聚合物）、刺激响应模块（蛋白酶激活底物）和生物流体报告分子（DNA条形码）——均可根据具体应用需求精确替换，从而通过定制靶向和释放特异性实现模块化设计。

<table><tbody><tr><td>10x NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6002SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>带有 3&amp;rsquo;-DBCO 基团的 20-mer 硫代磷酸酯 DNA 报告分子</td><td>IDT</td><td></td><td>定制 DNA</td></tr><tr><td>配备 Vydac 214TP510 C4 柱的 Agilent 1100 高效液相色谱系统</td><td>&amp;nbsp;Agilent</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA 快速蛋白液相色谱（FPLC）</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Amicon 超滤离心管（MWCO = 10 kDa）</td><td>EMD millipore</td><td></td><td>提供多种规格</td></tr><tr><td>含 C 端半胱氨酸的叠氮封端 PAP 肽</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>定制肽</td></tr><tr><td>crRNAs&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>参见补充表 1</td></tr><tr><td>冷冻透射电子显微镜</td><td>JEM-2100F</td><td>JEOL</td><td>冷冻电镜</td></tr><tr><td>含半胱氨酸末端的 DNA-肽偶联物</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>定制肽</td></tr><tr><td>动态光散射（DLS）</td><td></td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>EnGen &lt;em&gt;Lba&lt;/em&gt;Cas12a (Cpf1)，100 &amp;micro;M</td><td>New England Biolabs</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>实验动物</td><td>Taconic Biosciences</td><td>BALB/cAnNTac</td><td>6&amp;ndash;8&amp;thinsp;周龄</td></tr><tr><td>gentleMACS C 型管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>HybriDetect 通用侧向流动检测试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>基质辅助激光解吸/电离&amp;ndash;飞行时间（MALDI&amp;ndash;TOF）质谱分析&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex MALDI&amp;ndash;TOF</td></tr><tr><td>MC26-Fluc 细胞系</td><td></td><td></td><td>美国马萨诸塞州总医院 Kenneth K. Tanabe 实验室</td></tr><tr><td>多价 PEG（40 kDa，8 臂），含马来酰亚胺反应基团</td><td>JenKem</td><td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td><td></td></tr><tr><td>Python，版本 3.9</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/</td></tr><tr><td>Quant-iT OliGreen ssDNA 检测试剂盒及 Quant-iT OliGreen ssDNA 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>O11492</td><td>ssDNA 检测试剂盒</td></tr><tr><td>ssDNA FAM-T10-淬灭剂和&amp;nbsp; FAM-T10-生物素报告底物</td><td>IDT</td><td></td><td>定制 DNA</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL 色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9909-44</td><td>用于 FPLC</td></tr><tr><td>Tecan Infinite Pro M200 酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas的多组分合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

构建用于精准诊断开发的合成生物标志物，使得通过超越传统生物流体检测所依赖的通路来实现疾病检测成为可能。合成生物标志物通常利用报告分子，这些分子可在生物流体中产生可读信号，以反映疾病发生和发展过程中局部病灶微环境内的生化改变。报告分子的药代动力学浓度以及疾病信号的生化放大效应，对于实现诊断检测的高灵敏度和高特异性至关重要。本文介绍了一种基于合成生物标志物形式的癌症诊断平台：该平台采用基于活性的纳米传感器，其携带经化学稳定化的DNA报告分子，当肿瘤微环境中出现异常的蛋白水解特征时，这些DNA报告分子可被释放。以合成DNA作为疾病报告分子，可通过其条形码功能实现多重检测，从而同时读取多种蛋白水解特征信号。释放至尿液中的DNA报告分子可通过CRISPR核酸酶进行检测，其原理是与CRISPR RNA发生杂交，进而在酶激活后产生荧光或比色信号。在本实验方案中，构建了DNA条形码标记的基于活性的纳米传感器，并在转移性结直肠癌的小鼠临床前模型中展示了其应用。该系统可根据疾病生物学特性高度灵活地进行调整，并能同时产生多个疾病信号，仅需给予纳米传感器、收集尿液并使用试纸检测，即可通过微创方式全面了解疾病特征，实现即时检测诊断。

提名蛋白酶激活的肽类底物 
为了设计能够反映组织中蛋白水解活性变化的传感器，首先使用一组肽探针库来表征组织中的蛋白酶活性13 (图1）。通过将新鲜或冷冻的组织样本与设计用于检测底物切割的FRET探针结合，可获得关于肿瘤微环境蛋白水解活性的重要信息。将含有FAM荧光基团和CPQ-2淬灭基团的FRET探针文库与组织样本共同孵育。根据荧光分光光度法测定结果，筛选出在假手术组织与肿瘤组织之间切割速率差异最大的探针，作为肽连接子用于后续实验 体内 纳米传感器图1A）。为了更好地理解肿瘤微环境的生理特性，并将蛋白酶的表达谱与活性谱进行有效比较，可将FRET探针与重组蛋白酶共同孵育，以关联底物切割与特定蛋白酶的活性，如两种示例探针所示 图1B.
传感器的配制与表征 
纳米传感...

本方案描述了一种由CRISPR-Cas介导的多组分合成尿液生物标志物检测方法，可通过体外分析肿瘤相关蛋白酶活性，实现癌症的即时诊断。

基于CRISPR-Cas的多组分合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

创建用于精准诊断开发的合成生物标志物，已实现通过超越传统疾病检测途径的通路来检测疾病。

心脏实验室正在开发分子和细胞工具，以精确追踪并调控疾病生物学过程。我们利用疾病组织的特异性信息，指导针对异质性疾病的响应性检测、成像和治疗工具的设计。体液为疾病检测与评估提供了便利的机会，但往往受限于相关分析物的含量过低。因此，该领域的许多研究正在致力于开发各种策略，以放大与疾病相关的信号，从而提高诊断检测（如BCR和表面等离子体共振）的灵敏度。我们的方法并不依赖于循环中的内源性疾病生物标志物，而是利用合成生物标志物，在注射的纳米传感器释放后报告疾病活动情况。我们的合成生物标志物是化学稳定的DNA条形码，可同时检测多种疾病微环境信号，并通过对应的条形码进行识别。

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CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

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高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

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了解CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测技术，用于便携式癌症诊断。该方法通过工程化分子工具提高疾病检测灵敏度，实现肿瘤相关蛋白酶活性的体外分析。

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