Name: 链霉亲和素亲和网格制备用于冷冻电子显微镜样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 学习制备链霉亲和素亲和网格用于冷冻电子显微镜样品制备。该方法利用脂质单层和生物素-链霉亲和素相互作用稳定生物素化样品，减少蛋白质变性和取向偏差，适用于低样品量的结构生物学研究。

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T.C. 获得了美国国家普通医学科学研究所分子生物物理学培训基金 GM-08295 以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号 DGE 2146752）的支持。R.G. 和 B.H. 获得了美国国立卫生研究院资助 R21-GM135666（授予 R.G. 和 B.H.）的支持。本研究部分由美国国家普通医学科学研究所资助 R35-GM127018（授予 E.N.）提供资金支持。E.N. 是霍华德·休斯医学研究所研究员。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>将市售的链霉亲和素用结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM KCl，5 mM EDTA，10% 海藻糖）稀释至终浓度为 0.5 mg/mL。确保最终海藻糖浓度为 10%。将 25–50 µL 分装液在液氮中速冻，并于 -80 ˚C 保存。</li>
	<li>将1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素)钠盐溶于体积比为65:35:8的氯仿/甲醇/水溶剂中，配制成终浓度为1 mg/mL的脂质溶液。将20–30 µL分装液置于玻璃小瓶中，单次使用，并于-80 ˚C保存。 
	注意：按质量称量配制溶剂更为准确。首先，将1.85 g超纯水与6.41 g高效液相色谱（HPLC）级甲醇混合，然后加入22.42 g氯仿以制备该溶剂。 
	&#8203;警告：在开始本实验方案前，请仔细阅读并理解制造商提供的氯仿和甲醇等有机溶剂的安全数据表及推荐操作说明。避免甲醇与皮肤直接接触。</li>
</ol>
2. 载网预处理
<ol>
	<li>将镀碳铜网在100%氯仿中浸洗两次，再在100%乙醇中浸洗一次。将网格置于洁净的滤纸上晾干。重复上述洗涤步骤，共进行三个循环。 
	注意：使用市售碳膜载网已获得可重复的成功，该载网碳膜厚度为10–12 nm（参见材料列表），孔径范围为0.6–2 µm。也可使用市售金膜载网，或按照Rubinstein实验室纳米制备方案自制的穿孔碳膜载网。14 也已成功使用。使用市售的较薄碳膜载网时，结果的可重复性较差。请勿使用铜网，因为铜会与样品中可能存在的有机胺发生反应。</li>
	<li>载网干燥后，在有孔碳载网的碳膜侧蒸发一层2.5–5 nm厚的碳层。碳层厚度由碳蒸发仪内置的石英晶体薄膜厚度测量仪控制。 材料表 文件。</li>
	<li>让新蒸发的碳老化（即变得更疏水）1周。</li>
</ol>
链霉亲和素晶格的制备
注意：为了在带孔碳膜电镜载网上生长二维链霉亲和素晶体，首先通过朗缪尔-施弗特转移法将生物素化脂质单层应用于碳膜的孔洞上（图1B）。脂质单层的制备步骤如下（图2）。滑石粉在蓖麻油与培养皿之间形成边界，一层薄的蓖麻油有助于在形成脂质单层时维持恒定的表面压力。使用在步骤2.2中蒸发碳的一侧来拾取单层膜，用结晶缓冲液洗去多余的脂质，然后将链霉亲和素溶液孵育在载网上以进行结晶。
<ol>
	<li>使用 70% 乙醇清洁实验台区域。</li>
	<li>用氯仿反复冲洗一支 5 µL 玻璃注射器数次以清洁，使用前确保注射器完全干燥。</li>
	<li>在使用前再次清洗碳支持膜载网，即将其浸入 100% 乙醇中清洗一次。将载网置于洁净的滤纸上自然晾干。</li>
	<li>在载网干燥期间，用 100% 氯仿和 100% 乙醇分别清洗每把抗毛细作用镊子，并使其完全干燥。</li>
	<li>在干净的 Parafilm 表面，为每个待制备的载网准备三滴 50 µL 的结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM KCl，5 mM EDTA，10% 海藻糖）。</li>
	<li>将一个未包被的 35 mm 培养皿盖内加入结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM KCl，5 mM EDTA，10% 海藻糖），并用镜头纸清洁液面表面。</li>
	<li>在培养皿边缘周围撒上分析纯级滑石粉。此步骤后续可作为指示剂，用于判断下步中蓖麻油扩散的范围。加入足量滑石粉形成屏障，防止蓖麻油接触培养皿边缘。但滑石粉过多会限制可用于形成脂单层的有效空间。</li>
	<li>将 200 µL 移液器吸头浸入蓖麻油中，获取一个中等大小的液滴（约 20 µL），使其悬挂在吸头末端。将此液滴接触培养皿内缓冲液表面，液滴会扩散形成均匀油膜。形成的薄油膜作为活塞15，在形成脂单层时（步骤 3.10）维持恒定的表面压力。 
	注意：应确保加入足够量的蓖麻油而非过少，最好一次性加入单滴。在制备脂单层前，需等待蓖麻油完全扩散。</li>
	<li>在吸取脂质溶液前，先用溶解的脂质冲洗 5 µL 玻璃注射器一至两次。避免在填充注射器时产生气泡。 
	注意：使用溶解脂质冲洗玻璃注射器，是为了去除步骤 3.2 中可能残留的氯仿。残留氯仿可能影响最终单层的质量。</li>
	<li>从注射器中挤出尽可能小的体积（约 0.5 µL）脂质溶液，并轻轻将悬挂的液滴接触蓖麻油膜表面。注意脂质溶液会在接触点穿透蓖麻油膜，形成的脂单层在薄油膜中心呈圆形分布。
	<ol>
		<li>可依次加入多个脂质液滴，或在制备部分载网后补充脂质；但若加入过多，脂质将扩散超出蓖麻油边界，进入含有滑石粉及可能污染物的边缘区域。若发生此情况，需重新开始整个过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用抗毛细作用镊子夹取一个载网，使镊子的直臂与载网的碳支持膜面均朝向单层膜方向。</li>
	<li>将载网的碳支持膜面接触单层膜表面 1–2 秒，以将部分单层膜转移至载网的孔状碳膜上。 
	注意：成功转移的标志是载网表面变为亲水性，当载网从培养皿中取出后，缓冲液会在其表面形成一层薄而完整的球形液膜覆盖整个载网。</li>
	<li>将目前附着在载网上的球形液膜依次接触步骤 3.5 中在 Parafilm 上准备的三个 50 µL 结晶缓冲液液滴，每次接触 1 秒。 
	注意：此步骤旨在尽可能去除覆盖在球形液膜表面（而非原先疏水的碳膜）上的过量脂质，以避免在电镜观察时形成脂质囊泡。</li>
	<li>小心地向载网上残留的球形缓冲液液滴中加入 4 µL 的 0.5 mg/mL 链霉亲和素溶液。</li>
	<li>将载网放入湿度室中。对整批载网重复执行步骤 3.11–3.14。</li>
	<li>在室温（RT）下于湿度室中孵育载网 2 小时，以防止蒸发。 
	注意：在脂单层施加后，载网的金面在任何阶段均不得接触液体。</li>
	<li>2 小时孵育后，在 Parafilm 的干净一侧为每个载网准备一个 300 µL 的洗涤缓冲液液滴（10 mM HEPES，pH 7.5，50 mM KCl，5 mM EDTA，10% 海藻糖）。 
	注意：洗涤缓冲液中含 50 mM KCl，而非步骤 3.5–3.6 所用结晶缓冲液中的 150 mM KCl。</li>
	<li>通过将载网置于 300 µL 洗涤缓冲液液滴上，洗去未结合的过量链霉亲和素。每次仅对一个载网执行步骤 3.18–3.20。避免将载网长时间留在 300 µL 洗涤液滴上。 
	注意：仅进行一次洗涤，因为此时链霉亲和素晶体/单层结构较为脆弱。每次将载网从洗涤液滴表面提起时，载网与液滴之间的液体桥断裂，会在跨越碳膜孔洞的自支撑单层晶体上产生瞬时压力梯度（负压）。该负压可能导致单层晶体瞬时隆起，并伴随晶体覆盖面积的扩张。若面积扩张超过晶体的弹性极限，晶体可能发生断裂或无序化。</li>
	<li>立即用无尘布擦干抗毛细作用镊子，以便在下一步中顺利将载网释放到滤纸上。将镊子的弯曲端插入洗涤液滴中，夹取漂浮在液滴上的载网。</li>
	<li>用滤纸从侧面轻轻吸去多余缓冲液。将载网金面朝下放置于滤纸上，对每个载网重复步骤 3.18–3.20，并让载网干燥 15–20 分钟。</li>
	<li>载网干燥后，将其翻转，使金面朝上。在载网的金面蒸发一层薄碳膜（厚度约 0.5–2 nm）。 
	注意：将载网储存在恒定湿度环境中，具体湿度值影响不大，但需注意相对湿度的多次变化可能导致晶体反复膨胀与收缩。为获得最佳效果，建议在冷冻电镜使用前让载网老化 1 周，因为载网背面的疏水性可能对单层稳定性至关重要。载网可长期稳定保存，但超过 3 个月后，背面碳膜可能逐渐失去疏水性。</li>
</ol>
4. 通过负染法检测链霉亲和素亲和力载网批次质量
<ol>
	<li>在Parafilm的干净一侧，准备两滴50 µL和一滴100 µL的样品缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，50 mM KCl，0.5 mM TCEP）。</li>
	<li>去除海藻糖，并通过接触两滴50 µL缓冲液使链霉亲和素载网重新水化，然后让载网在100 µL样品缓冲液中漂浮10分钟。 
	注意：在重新水化及后续样品结合孵育过程中，最好避免使用去污剂。缓冲液会扩散至载网的金面，从而降低洗涤效率，难以有效去除过量样品。</li>
	<li>重新水化后，使用抗毛细管镊子夹起载网，使镊子的弯曲臂部分浸入液滴中。</li>
	<li>轻轻从侧面吸去多余的缓冲液，并迅速重新加入4 µL浓度为75–100 nM的样品（可选）。 
	注意：重新水化后应避免载网干燥。</li>
	<li>将样品置于湿度 chamber 中孵育1–5分钟。 
	注意：样品浓度和孵育时间需根据具体样品优化。所提供的浓度和时间仅为建议的起始条件。</li>
	<li>在Parafilm的干净一侧，分别设置四滴30 µL的样品缓冲液和四滴30 µL的1%甲酸铀（UF）染液。 
	注意：在进行此步骤前，请仔细阅读并理解甲酸铀生产商提供的安全数据表及其关于操作与处置的推荐说明。甲酸铀为有毒且具有放射性的化合物。务必事先获得机构对放射性物质使用的批准。</li>
	<li>通过依次接触四滴样品缓冲液，洗去未结合的样品。</li>
	<li>使用标准负染方法，以UF对样品进行染色。轻轻从侧面吸去UF染液，使载网上保留一层较厚的染液。若需要，可在吸去后额外添加0.5 µL染液以增加染色厚度。让载网自然风干。 
	&#8203;注意：由于链霉亲和素载网具有极强的亲水性，负染液往往在整个载网上形成非常均匀的薄膜，这与通常使用辉光放电处理的连续碳支持膜载网时观察到的现象不同。因此，建议保留更厚的染液膜。</li>
</ol>
5. 使用生物素化样品冷冻链霉亲和素亲和载网
注意：以下步骤适用于配备内部 blotting 传感器的单侧自动加样装置（也可在其他自动加样设备中进行单侧手动 blotting）
<ol>
	<li>在石蜡膜的干净一侧准备两滴50 µL和一滴100 µL的样品缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5，50 mM KCl，0.5 mM TCEP）。</li>
	<li>通过接触两滴50 µL缓冲液使链霉亲和素载网重新水化，并让载网在100 µL样品缓冲液滴中漂浮10分钟。</li>
	<li>重新水化后，用抗毛细作用镊子夹起载网，使镊子的弯曲臂浸入液滴中。</li>
	<li>轻轻从侧面吸去多余的缓冲液，迅速加入4 µL浓度为75–100 nM的样品。</li>
	<li>将样品置于湿度 chamber 中孵育1–5分钟。 
	注意：样品的浓度和孵育时间需根据具体样品优化。所提供的浓度和孵育时间仅为建议的起始条件。对于低浓度样品，可延长孵育时间和/或多次将样品结合至载网。</li>
	<li>在石蜡膜的干净一侧准备两滴10 µL冷冻缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5，50 mM KCl，0.5 mM TCEP，3%海藻糖，0.01% NP40）。孵育后，将载网接触第一滴冷冻缓冲液以洗去未结合的样品，随后将载网放入第二滴冷冻缓冲液中。</li>
	<li>用连接单侧自动压入装置的镊子迅速夹住载网边缘。轻轻吸去多余的缓冲液，迅速向载网上加入4 µL冷冻缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，50 mM KCl，0.5 mM TCEP，3%海藻糖，0.01% NP40）。</li>
	<li>将镊子连接至单侧自动压入装置。使用可检测载网上液滴的 blot 传感器，blot 时间控制在4–6秒时通常可获得最佳结果。具体条件将因样品和所用缓冲液的不同而有所变化。</li>
</ol>
6. 来自链霉亲和素亲和载网的冷冻电镜电影数据处理
在链霉亲和素亲和载网上进行数据收集可与标准载网操作相同，无需特殊的显微镜调整。然而，此处详述的流程是在显微照片完成运动校正后才去除链霉亲和素信号。因此，依赖原始电影帧的数据处理步骤（如颗粒修整）无法可靠执行。此处的链霉亲和素信号扣除（除CTF估计外，所有标准下游处理均需此步骤）需要在Linux环境下运行Matlab R2014b或更高版本。信号扣除依赖于链霉亲和素层的晶体性质，该性质允许进行峰位屏蔽，从而从每张显微照片的傅里叶变换中去除信号。
<ol>
	<li>设置处理脚本
	<ol>
		<li>将补充文件中的所有文件复制到项目目录内的专用文件夹中</li>
		<li>准备一个名为 processing_scripts 的目录，其中包含以下文件： 
		lsub.m（补充代码文件 1；减法脚本） 
		process_subtration.sh（补充代码文件 2；循环遍历所有可用显微照片、启动并行任务并跟踪输入和输出的封装脚本） 
		process_subtraction.cfg （补充代码文件 3；包含减法任务参数的配置文件，参见 6.2）</li>
		<li>准备一个名为 support_scripts 的目录，其中包含以下文件： 
		bg_drill_hole.m（补充代码文件 4） 
		bg_FastSubtract_standard.m（补充代码文件 5） 
		bg_Pick_Amp_masked_standard.m（补充代码文件 6） 
		bg_push_by_rot.m（补充代码文件 7） 
		ReadMRC.m（补充代码文件 8） 
		WriteMRC.m（补充代码文件 9） 
		WriteMRCHeader.m（补充代码文件 10）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要调整配置文件（process_subtraction.cfg，必要时参考 图 3）：
	<ol>
		<li>Input：包含经运动校正后的 mrc 格式显微照片的目录路径。可使用目录路径或包含通配符（?, *）的模式。 
		示例： 
		input=&#34;/path/to/project_directory/micrographs/&#34; 
		或 
		input=&#34;/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc&#34;</li>
		<li>output_dir：用于保存晶格减法处理后显微照片的目录路径。</li>
		<li>only_do_unfinished：指定是否覆盖或跳过已存在的减法处理结果（true|false）。该参数适用于在显微镜会话中途启动晶格减法脚本（默认值：true）。</li>
		<li>num_parallel_jobs：指定并行任务数量。该数值取决于处理所用硬件配置，不应超过可用核心数。在具有 32 个核心和网络文件系统的系统上，使用 14 个并行任务可达到最佳性能。为获得最佳性能，建议使用部分显微照片对该值进行优化。</li>
		<li>Pad_Origin_X：当使用纵向方向的 K3 探测器（图像宽度 &#60; 图像高度）或使用方形探测器（Falcon III、Falcon IV、K2）时设为 200；当使用横向方向的 K3 探测器（图像宽度 &#62; 图像高度）时设为 1000。快速傅里叶变换在方形区域内进行，若探测器非方形则需填充。</li>
		<li>Pad_Origin_Y：当使用纵向方向的 K3 探测器（图像宽度 &#60; 图像高度）时设为 1000；当使用方形探测器（Falcon III、Falcon IV、K2）或横向方向的 K3 探测器（图像宽度 &#62; 图像高度）时设为 200。</li>
		<li>请勿更改 Inside_Radius_Ang（90）和 Outside_Radius_Ang（3.0）。晶格减法在两个分辨率之间进行（单位为埃）。</li>
		<li>Pixel_Ang：以浮点数值形式提供像素尺寸。</li>
		<li>Threshold：在傅里叶空间中用于将晶格替换为背景的减法阈值截断值。已成功使用的数值范围为 1.4–1.6。建议以 1.42 作为起始值。</li>
		<li>请勿更改 expand_pixel（10）和 pad_out_opt（0）。expand_pixel 是用于在阈值截断值以上的像素周围进行掩膜处理的直径值。pad_out_opt 是决定输出中是否包含填充区域的选项。</li>
		<li>addpath_m：支持脚本的路径。</li>
		<li>path_to_matlab_bin：系统中 Matlab 安装目录 bin 的路径。</li>
		<li>path_matlab_script：上述步骤 6.1.2 中已复制的 Matlab 减法脚本（lsub.m）的路径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存修改后的脚本后，运行脚本（bash ./process_subtraction.sh），从输入显微照片中减去链霉亲和素信号。如果参数 only_do_unfinished 设置为 true（见步骤 6.2.3），脚本可被中断和/或重新启动。若出现错误，请检查 bash 脚本中指定的参数。确保参数变量与其赋值之间没有意外的空格，这是常见的错误来源。</li>
	<li>将晶格减法处理后的图像用于标准的冷冻电镜图像处理。</li>
</ol>

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

<ol><li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlaeser%2C+RM+%22Single-particle+Cryo-EM+of+Biological+Macromolecules.+IOP+Publishing%22">Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing</a>. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li>
<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
</ol>

本方案描述了如何制备和使用链霉亲和素亲和载网，以及如何处理包含链霉亲和素衍射信号的数据。该方案中有多个关键步骤需要特别注意。
失败的载网批次可追溯至若干常见错误。最常见的错误来源是使用过期或质量不佳的试剂。尤其重要的是，必须严格按照方案所述制备生物素化脂质溶液。此外，任何杂质，例如实验器皿上的洗涤剂残留或皮肤上天然存在的油脂，都可能影响链霉亲和素晶体的质量，从而影响最终图像的质量。因此，建议在首次蒸发碳之前对载网进行三次清洗循环，以去除载网制造商可能残留的表面活性剂污染（步骤 2.1）。此外，已观察到蓖麻油的污染或不纯会阻碍载网上晶体的形成。
制备并拾取脂单层是一项需要反复练习的操作，以熟悉微量脂质的处理。在成功制备出合格的脂单层之前，该步骤前两三次失败是常见现象，最终可通过负染网格中观察到的链霉亲和素晶体质量来反映（图4C）。
在制备载网的过程中（步骤 3.12–3.20），必须始终避免载网背面（金面、脂质面）接触液体。若背面不慎沾湿，建议弃用该载网。这可能导致出现较大的脂质囊泡，从而影响图像质量（图 5D）（第 3 行，表 1）。此外，在脂质单层涂覆后清洗不充分时（步骤 3.13），也可能观察到脂质囊泡。因此，在添加链霉亲和素之前，接触脂质单层后，建议使用结晶缓冲液连续洗涤三次。
在将一层薄碳蒸发到海藻糖包埋的载网上后，可以润湿载网的背面而不会损坏晶格质量。例如，当样品缓冲液中含有极微量的去污剂时，经常会出现背面被润湿的情况。样品对载网背面的润湿可能导致样品非特异性地结合到背面的薄碳膜上，从而降低防止颗粒扩散至气-液界面的效果，或影响利用亲和结合进行载网内纯化策略的有效性。如果可能，应避免在含有去污剂的情况下将样品加至载网。去污剂和其他添加剂可在后续的载网洗涤步骤中加入，或在玻璃化前的最后一步添加。这是使用链霉亲和素亲和载网的一个局限性；然而，如果目标是改善优势取向，则已有成功使用含去污剂缓冲液进行样品制备的报道11。
一个常见的误差来源与载网在两次碳膜蒸发步骤（步骤 2.3 和步骤 3.21）之间的使用时间有关。在本实验方案中，建议在背侧碳膜蒸发后等待 5–7 天，再将链霉亲和素载网用于冷冻电镜实验。若载网在制备后过早使用，可观察到晶格和脂单层从载网孔洞中发生移动。同样地，若载网存放过久，超过六个月后使用，也会出现类似现象。&#160;(图 5A)&#160;（第1行， 表1）。我们推测，这一现象可归因于用于稳定脂质单层和链霉亲和素晶体的碳支持膜疏水性的改变。此外，链霉亲和素晶格可能呈现镶嵌状（图 5B）（第3行， 表1)&#160;如果在单层膜施加到第一层碳蒸发层（步骤2.3）尚未充分老化处理的载网上，则负染和冷冻电镜观察中均会出现破裂现象。
另一个常见的误差来源可归因于链霉亲和素晶体单层的脆弱性（脂质单层本身具有流动性，可逆地扩张或压缩）。在样品吸附、洗涤及冷冻电镜制样过程中，对载网背面进行碳镀膜（步骤 3.21）&#160;对于维持单层膜和链霉亲和素晶格的稳定性至关重要。若载网背面碳镀膜不足，则在制样和冷冻后，链霉亲和素晶格常出现断裂现象（图 5C）&#160;（第 2 行，表 1）。在本方案中，我们建议使用单侧自动冷冻投入仪进行单侧制样。该方法可提供高度可重复的制样条件，在冷冻过程中有效保护链霉亲和素晶格，并便于优化样品施加和制样参数。此外，也可采用其他类型的自动冷冻投入装置结合手动制样方式。具体操作为在设备设置中关闭实际的制样功能，然后通过侧面开口，用镊子夹取滤纸对载网进行手动制样。该方法适用于不具备单侧制样和冷冻投入设备的实验室，并可获得高质量结果；然而，其载网间的可重复性较难控制。
尽管使用链霉亲和素亲和载网具有诸多优势，但该方法的一些局限性也需要加以考虑。由于实验流程本身的特性，通常只有在完成全部流程后才能评估链霉亲和素晶格的质量。建议在冷冻样品前，先通过负染色法快速筛查每批载网的质量。由于链霉亲和素晶格会在原始图像中产生信号，在某些情况下，仅从图像本身难以判断是否存在足够数量的完整且分散的颗粒。出于同样原因，除非在数据预处理流程中包含链霉亲和素信号扣除步骤，否则在数据采集过程中无法实时处理冷冻电镜数据。由于链霉亲和素信号通常是从运动校正后的图像中扣除，而非直接从原始帧中扣除，因此在采用所述扣除方法时，主流软件套件中实现的贝叶斯抛光（Bayesian polishing）可能会失败。因此，建议在数据处理初期即采用多区域运动校正，以最大限度减少颗粒位移16。
尽管存在这些局限性，链霉亲和素亲和载网仍具有诸多优势。与标准的开放式孔洞冷冻电镜载网相比，链霉亲和素亲和载网的两个主要优势在于能够保护样品免受气液界面的影响，并可在载网上富集低丰度（10–100 nM）的样品。其他支撑层，如碳膜和氧化石墨烯，也可作为克服样品制备瓶颈的策略。例如，在某一案例中，链霉亲和素亲和载网是获得无法通过交联方法处理的蛋白质-核酸相互作用完整重构的唯一解决方案。12
链霉亲和素亲和载网提供的另一个主要优势在于，能够解决样品吸附于其他支撑层（如碳膜或氧化石墨烯）时出现的优势取向问题，这种取向会阻碍获得目标样品的三维重构。利用市售试剂盒对样品进行随机生物素化，可使目标样品随机结合到链霉亲和素单分子层上，从而获得更多的潜在视角，克服这一难题。
此外，链霉亲和素亲和载网具有基于亲和力的载网所独有的优势。链霉亲和素与生物素之间具有高亲和力和特异性，使得链霉亲和素亲和载网可与其他涉及生物素的工作流程结合，用于纯化目标复合物。在已发表的一个实例中，作者将复合物固定在链霉亲和素亲和载网上，并以大量过量的方式孵育一个未知化学计量比的结合伴侣。在洗去未结合的蛋白质后，获得了正确组装的超复合物，并可立即用于冷冻电镜分析11。一个可能的未来应用是将链霉亲和素结合蛋白标签、Avi-tag系统或邻近标记技术与链霉亲和素亲和载网相结合，从而直接从重组或内源性来源中提取单一蛋白质和/或蛋白质复合物，而无需标准的复杂纯化流程。
通过提供本实验方案，各实验室应能轻松重现链霉亲和素亲和载网的制备过程，并将其确立为利用冷冻电镜对蛋白质复合物进行结构分析时更为常用的一种工具。

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）通过实现对以往难以利用X射线晶体学或核磁共振技术解析的大型、柔性及异质样品的大分子结构测定，彻底改变了结构生物学领域1。该方法通过将溶液中的大分子快速冷冻，形成一层薄的玻璃态冰，随后可在电子显微镜下进行成像。近年来，显微镜硬件和图像处理软件的显著进步进一步拓展了适用于高分辨率结构解析的样品类型。
然而，制备薄而玻璃化的样品仍然是通过冷冻电镜（cryo-EM）进行大分子结构解析中最关键的步骤之一。生物样品通常具有动态性、脆弱性，易于变性，有时可用于冷冻电镜研究的样品量还非常有限。在 blotting 过程中，这些颗粒会与疏水性的气液界面相互作用，可能导致颗粒取向偏好、脆弱复合物的解离、部分或完全的样品变性以及聚集2,3,4。使用去垢剂或其他表面活性剂、化学交联以及将样品吸附到支撑层上，是冷冻过程中保护生物样品的常用策略。氧化石墨烯5,6,7或无定形碳8等支撑层在样品量有限时，还可通过吸附作用将颗粒富集于载网上。然而，这些方法并不具有普适性或可靠性，且载网制备的优化可能极为耗时，甚至完全失败。
为克服上述不足，并提供一种温和且普遍适用的方法来捕获目标复合物并使其免受气液界面的损伤，研究人员开发了链霉亲和素亲和载网9,10。这类载网利用在载网上生物素化脂质单层上生长的二维（2D）链霉亲和素晶体晶格。当样品本身被生物素化后（通常为稀疏且随机标记，平均每个复合物带有一个生物素），即可将其施加于涂有链霉亲和素的载网上。由于样品吸附依赖于链霉亲和素与生物素之间极高的亲和力，因此使用此类载网时样品浓度可低至10 nM。目前已有 commercially available 的蛋白质生物素化试剂盒以及用于含DNA复合物的生物素化引物，使得将必要的生物素基团连接到大多数目标样品上变得相对简便。除了在 blotting 过程中浓缩样品并使其远离有害的气液界面外，对一个或少数几个赖氨酸残基进行随机生物素化还可显著改善目标分子在冷冻电镜载网上的取向分布，这一点已在多项研究中得到证实11。尽管底层链霉亲和素晶体的信号会出现在原始图像中，但通过数据处理流程中的傅里叶滤波方法，可轻松去除晶体产生的锐利布拉格衍射信号，从而最终实现对目标样品的高分辨率重构11,12,13。本文提供了一套经过优化的、逐步操作的实验方案，用于稳定制备链霉亲和素亲和载网，并将其应用于冷冻电镜实验。该方案预计耗时约两周时间（图1A）。方案的前半部分描述了试剂准备、载网预处理以及首次碳镀膜步骤；随后介绍了脂质单层的制备及在电镜载网上生长链霉亲和素晶体的操作方法；此外，还提供了链霉亲和素亲和载网在负染电镜和冷冻电镜实验中的使用说明；最后，给出了在获得冷冻电镜数据后从显微图像中去除链霉亲和素信号的处理流程。

<table><tbody><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素)钠盐&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>以粉末形式提供。用氯仿/甲醇/水溶剂（体积比65:35:8）溶解至浓度为1&amp;ndash;10 mg/mL&amp;nbsp;，分装成单次使用量，于-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>200 proof 纯乙醇</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;mu;L 汉密尔顿注射器&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>5 &amp;micro;L 微量注射器，型号75 RN，带可拆卸小针头，26 G，2 英寸，尖端类型2</td></tr><tr><td>蓖麻油</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma Aldrich）</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>未处理细胞培养皿（35 mm）</td><td>Bio Basic</td><td>SP22146</td><td></td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma Aldrich）</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-海藻糖二水合物，来源于淀粉，&amp;ge;99%</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma Aldrich）</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT 抗毛细管反向（自闭合）镊子，生物学级</td><td>Ted Pella</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级甲醇</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 高真空溅射镀膜仪</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM GP2 自动冷冻投入仪</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 2/1 Au300&amp;nbsp;</td><td>Quantifoil</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>新英格兰生物实验室（New England Bioscience）</td><td>N7021S</td><td>以1 mg/mL溶液形式提供。用结晶缓冲液稀释至终浓度为0.5 mg/mL，并使海藻糖终浓度为10%。可分装为25&amp;ndash;50 &amp;mu;L小份，快速冷冻保存</td></tr><tr><td>滑石粉&amp;nbsp;</td><td>Carolina</td><td>896060</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 1号滤纸</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

用于冷冻电镜样品制备的链霉亲和素亲和力载网制备

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

链霉亲和素亲和载网提供了一种克服冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品制备中常见挑战的策略，包括由气液界面引起的样品变性及优势取向问题。然而，目前仅有少数 cryo-EM 实验室使用链霉亲和素亲和载网，因其尚未商业化供应，且需要精细的制备流程。二维链霉亲和素晶体生长在直接涂覆于标准有孔碳膜 cryo-EM 载网上的生物素化脂质单层上。链霉亲和素与生物素之间的高亲和力相互作用，可使生物素化的样品随后结合至载网，并在 cryo-EM 样品制备过程中避免暴露于气液界面。此外，这些载网还提供了一种富集微量样品的策略，并可在载网上直接纯化目标蛋白复合物。本文提供了一个逐步优化的实验方案，用于稳定制备适用于 cryo-EM 和负染实验的链霉亲和素亲和载网。同时，还附有针对常见问题的故障排查指南，以促进更广泛的 cryo-EM 研究群体便捷地使用链霉亲和素亲和载网。

在步骤3.21碳镀膜完成后（通常为一周后），链霉亲和素亲和载网可用于后续步骤4和5所述的冷冻电镜或负染样品制备。下图显示的是使用Titan Krios透射电镜在81,000倍放大倍数下，以K3探测器采集的生物素化样品的代表性显微照片，其像素尺寸为1.05 Å，样品采用链霉亲和素亲和载网进行冷冻。 图 4A通过图像背景中出现的连续网格图案可观察到晶格的成功形成。这一现象也可通过快速傅里叶变换（FFT）中出现的衍射图案更清晰地观察到。 图4A （右侧）。在按照本实验方案第6步所述程序完成数据采集后，可通过计算方法屏蔽链霉亲和素晶格对图像的信号贡献，从而获得一幅经减除处理的显微照片（图 4B）可用于后续的数据处理步骤。FFT 在 图 4B （右）显示所观察到的衍射图样 图 4A （右侧）已从原始图像中成功移除。
图4C 显示了一个生物素化样品的显微照片示例，该样品结合于链霉亲和素亲和载网，并使用甲酸铀酰负染色。图像在Tecnai 12显微镜下以49,000倍放大倍数拍摄，像素尺寸为1.6 Å。载网制备按照本实验方案第4步所述程序进行，保留较厚的染色膜。
当链霉亲和素网格制备过程不成功时，存在若干常见现象，这些现象将在讨论部分进一步描述。 表1. 图5 展示了这些观察结果的多个示例。 图 5A 显示一张使用超过六个月批次的负染链霉亲和素亲和载网的显微照片。单层颗粒已从Quantifoil载网碳膜上的孔洞中移动，并呈现出与网格孔洞相似的尺寸。 图5B 显示了一个链霉亲和素晶体的示例，该晶体具有较高的镶嵌度，在样品制备过程中容易受到扰动。 图 5C 显示了链霉亲和素亲和载网上一个具有代表性的显微照片，其中步骤3.21中的碳蒸发过薄或被省略。在冷冻电镜样品制备过程中，链霉亲和素晶格已发生断裂。 图 5D 显示一张经负染色的链霉亲和素亲和载网，可见脂质囊泡污染，可能源于步骤3.13中洗涤不充分，或在步骤3.13–3.20期间载网的金面受潮。请参阅讨论部分 表1 用于解决这些常见问题的策略。
<img alt="脂质单层生物素化、链霉亲和素晶体生长示意图、冷冻电镜样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：链霉亲和素亲和载网制备流程示意图。 （A）链霉亲和素亲和载网制备流程的总体时间线。整个流程可在两周内完成，需进行两次碳蒸发步骤，每次蒸发后需静置一周，以使碳膜充分老化。（B）链霉亲和素亲和载网的一个网格区域的放大视图，展示制备完成后载网所包含的各层结构，包括标准的冷冻电镜载网（含金条和多孔碳膜）、第一层蒸发碳膜、脂质单层、二维链霉亲和素晶体以及背面蒸发的碳支撑层。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂单层与链霉亲和素结晶过程；逐步实验装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：脂单层与链霉亲和素结晶。（A）图像展示如何在小型培养皿中成功形成脂单层，利用滑石粉形成边界以固定蓖麻油，从而在形成脂单层过程中保持恒定的表面压力。（B）图像展示如何在冷冻电镜载网表面生长链霉亲和素晶体。首先将载网的碳面接触脂单层，随后在结晶缓冲液中连续洗涤三次。加入链霉亲和素后，将载网置于湿度培养室中孵育2小时。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="傅里叶空间显微图像处理步骤与参数；MATLAB 脚本设置及晶格扣除" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：进行链霉亲和素晶格从显微图像中扣除（步骤 6）时，process_subtraction.cfg 文件的示例参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子显微镜，未减除晶格的显微照片与快速傅里叶变换对比；晶格减除与负染分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：成功制备链霉亲和素亲和载网的代表性结果。（A）使用自制链霉亲和素亲和载网制备的生物素化蛋白/核小体复合物的冷冻电镜显微照片。右侧显示其快速傅里叶变换（FFT），可见链霉亲和素晶体的衍射图样。（B）与A图相同的显微照片经晶格减除处理后的结果，用于从原始图像中去除二维链霉亲和素晶体的信号。（C）生物素化样品结合至链霉亲和素亲和载网后进行负染所得显微照片的示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质自组装结构的冷冻电镜图像；包含比例尺细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：链霉亲和素亲和载网制备失败的代表性结果。 （A）显微图像显示，当载网使用时间超过六个月时，链霉亲和素单层膜从载网孔洞处发生移动。（B）显微图像显示链霉亲和素晶格具有较高的镶嵌性，在冷冻电镜和负染样品制备过程中均易受损。（C）在冷冻电镜样品制备过程中，若步骤 3.21 中的碳蒸发层过薄或被省略，则会导致链霉亲和素晶格发生断裂，如图所示。（D）代表性显微图像显示样品被脂质囊泡污染，可能由于步骤 3.13 中洗涤不充分，或在步骤 3.13 至 3.20 期间载网的金面被润湿所致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：解决在链霉亲和素亲和载网制备不成功时常见问题的故障排除指南。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充代码文件 1：lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 2：process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 3：process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 4：bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 5：bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 6：bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 7：bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 8：ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 9：WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 10：WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文提供了一步一步制备链霉亲和素亲和载网的方案，用于通过冷冻电子显微镜对难以处理的大分子样品进行结构研究。

链霉亲和素亲和载网为克服许多常见的冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品制备难题提供了有效策略，……

近年来，冷冻电镜（cryo-EM）技术取得了诸多进展，包括显微镜硬件本身的改进，从而提高了图像的整体质量；同时，图像处理软件也不断发展，能够逐步应对许多样品中存在的大量异质性。然而，样品制备仍然是冷冻电镜中最大的瓶颈之一。样品用量可能受限，且在玻璃化过程中，蛋白质容易吸附到疏水性的气液界面。这可能导致样品变性、较大蛋白复合物解离，以及在冷冻电镜图像中出现优势取向。这些载网利用链霉亲和素与生物素之间的高亲和力相互作用，将生物素标记的样品固定，从而保护其免受疏水性气液界面的影响。我们可使用极少量的样品，且样品的随机生物素标记提供了一种策略，用以克服使用其他支撑层时可能出现的优势取向问题。首先，用70%乙醇清洁实验台区域，然后用氯仿反复冲洗5微升玻璃注射器数次。使用前，用100%乙醇清洗碳镀膜载网，并将载网置于干净的滤纸上干燥。同时，用100%氯仿清洗每支抗毛细管镊子，随后用100%乙醇清洗。为每张待制备的载网，在Parafilm的洁净面准备好三滴50微升的结晶缓冲液。用结晶缓冲液填充培养皿盖，并用镜头纸擦拭35毫米未涂层培养皿的表面。在培养皿边缘均匀撒上适量分析纯滑石粉。将200微升移液器吸头浸入蓖麻油中，吸取一滴中等大小的油滴。将油滴滴至培养皿缓冲液表面。在吸取等分试样之前，先用溶解的脂质冲洗五微升玻璃注射器两次。然后，轻轻将悬挂的0.5微升脂质液滴接触蓖麻油表面，在中心位置形成脂质单层。准备一个载片，上面依次放置数滴液体。使用防毛细管镊子夹取载网，使镊子的直臂和镀碳面朝向单层膜。转移单层膜时，将载网的镀碳面接触单层膜持续一到两秒。随后，依次将缓冲液的球形盖接触置于Parafilm上的三滴50微升结晶缓冲液。向网格上缓冲液剩余的球形液滴中加入4 µL链霉亲和素。将网格置于湿盒中，室温孵育两小时。在Parafilm的洁净面准备一滴300 µL的洗涤缓冲液。将载网置于300微升冲洗缓冲液液滴中，以洗涤未结合的链霉亲和素。使用干燥的防毛细管镊子的弯曲端插入液滴中拾取载网。用滤纸吸去载网上的液体，将其金面朝下放置，并干燥15至20分钟。干燥后，将载网翻转，使金面朝上。将载网放入碳镀膜仪中，以便在载网的金面镀上一层薄碳。使用链霉亲和素亲和载网冷冻的生物素化样品的显微照片显示，背景中呈现出连续的载网图案。快速傅里叶变换中的衍射图样进一步证实了晶格的成功形成。在完成冷冻电镜数据采集后，可通过计算方法对链霉亲和素晶格产生的信号进行掩膜处理，从而获得一幅经减除的显微图像。快速傅里叶变换结果显示，链霉亲和素的衍射图样已成功被去除。

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科研

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生物化学

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