用于冷冻电镜样品制备的链霉亲和素亲和力载网制备

近年来，冷冻电镜（cryo-EM）技术取得了诸多进展，包括显微镜硬件本身的改进，从而提高了图像的整体质量；同时，图像处理软件也不断发展，能够逐步应对许多样品中存在的大量异质性。然而，样品制备仍然是冷冻电镜中最大的瓶颈之一。样品用量可能受限，且在玻璃化过程中，蛋白质容易吸附到疏水性的气液界面。

这可能导致样品变性、较大蛋白复合物解离，以及在冷冻电镜图像中出现优势取向。这些载网利用链霉亲和素与生物素之间的高亲和力相互作用，将生物素标记的样品固定，从而保护其免受疏水性气液界面的影响。我们可使用极少量的样品，且样品的随机生物素标记提供了一种策略，用以克服使用其他支撑层时可能出现的优势取向问题。

首先，用70%乙醇清洁实验台区域，然后用氯仿反复冲洗5微升玻璃注射器数次。使用前，用100%乙醇清洗碳镀膜载网，并将载网置于干净的滤纸上干燥。

同时，用100%氯仿清洗每支抗毛细管镊子，随后用100%乙醇清洗。为每张待制备的载网，在Parafilm的洁净面准备好三滴50微升的结晶缓冲液。用结晶缓冲液填充培养皿盖，并用镜头纸擦拭35毫米未涂层培养皿的表面。

在培养皿边缘均匀撒上适量分析纯滑石粉。将200微升移液器吸头浸入蓖麻油中，吸取一滴中等大小的油滴。将油滴滴至培养皿缓冲液表面。

在吸取等分试样之前，先用溶解的脂质冲洗五微升玻璃注射器两次。然后，轻轻将悬挂的0.5微升脂质液滴接触蓖麻油表面，在中心位置形成脂质单层。准备一个载片，上面依次放置数滴液体。

使用防毛细管镊子夹取载网，使镊子的直臂和镀碳面朝向单层膜。转移单层膜时，将载网的镀碳面接触单层膜持续一到两秒。随后，依次将缓冲液的球形盖接触置于Parafilm上的三滴50微升结晶缓冲液。

向网格上缓冲液剩余的球形液滴中加入4 µL链霉亲和素。将网格置于湿盒中，室温孵育两小时。在Parafilm的洁净面准备一滴300 µL的洗涤缓冲液。

将载网置于300微升冲洗缓冲液液滴中，以洗涤未结合的链霉亲和素。使用干燥的防毛细管镊子的弯曲端插入液滴中拾取载网。用滤纸吸去载网上的液体，将其金面朝下放置，并干燥15至20分钟。

干燥后，将载网翻转，使金面朝上。将载网放入碳镀膜仪中，以便在载网的金面镀上一层薄碳。使用链霉亲和素亲和载网冷冻的生物素化样品的显微照片显示，背景中呈现出连续的载网图案。

快速傅里叶变换中的衍射图样进一步证实了晶格的成功形成。在完成冷冻电镜数据采集后，可通过计算方法对链霉亲和素晶格产生的信号进行掩膜处理，从而获得一幅经减除的显微图像。快速傅里叶变换结果显示，链霉亲和素的衍射图样已成功被去除。