脑类器官中单细胞与单细胞核转录组的生成及下游分析

我们正在开发和优化类器官模型，以将其应用于疾病建模。我们的目标是理解疾病发生与进展背后的分子机制。我们与Nikolaus Rajewsky实验室密切合作，该实验室致力于开发和应用单细胞及空间技术，以揭示RNA在健康与疾病状态下如何调控基因表达。

近年来，脑类器官已成为研究患者特异性疾病的实验与转化平台。因此，最近的大多数进展都致力于提高脑类器官模型的复杂性，也就不足为奇了。例如，我们现在能够生成特定脑区的类器官，并将脑类器官用于多类器官组装。

此外，已有多种方法被用于将血管化结构和免疫细胞引入脑类器官中。目前，本实验室正在使用的一项最能推动研究进展的技术是空间转录组学，该技术能够对完整组织内的基因表达进行评估。这对于理解不同细胞类型的基因表达谱在组织内不同区域中的差异至关重要。

近年来另一项重要进展是单细胞多组学技术，该技术能够对单个细胞的多个模块进行分析，从而为细胞研究提供更为全面的视角。我们采用脑类器官以及单细胞和空间转录组学方法，研究Leigh综合征和单纯疱疹病毒性脑炎等人类疾病的潜在机制。此外，我们开发了一种高分辨率且成本较低的空间转录组学方法，称为Open-ST。

我们比较并优化了单细胞和单细胞核RNA测序方法，以评估它们在脑类器官组织中细胞类型鉴定方面的表现。首先，在6孔板的一个孔中收集最多五个由诱导多能干细胞生成的人脑类器官。吸除多余的培养基，并用PBS清洗类器官一次。

使用手术刀将类器官充分切碎。向切碎的类器官中加入酶混合液1，在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳条件下，以90 rpm振荡孵育10至15分钟。用1,000微升移液枪头混匀类器官悬液。

然后加入酶混合液2，在37摄氏度孵育10至15分钟。加入10毫升终止液以终止消化。将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤。

将过滤后的细胞悬液在 4 摄氏度下以 300g 离心 10 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 4 毫升冷的 0.04% BSA 中。接着将细胞悬液通过 40 微米细胞筛过滤，并使用细胞计数仪对细胞进行计数。

离心所需的细胞悬液量。吸除上清液，并根据基于微流控技术的单细胞RNA测序试剂盒说明书，将沉淀重悬于NSB Plus培养基中。首先，将四个由诱导多能干细胞生成的人脑类器官转移至含有预冷PBS的6孔板中。

将每个类器官切成四块。用剪刀剪去1,000微升移液器吸头的尖端，用其将类器官块转移至2毫升Dounce匀浆器中。彻底吸去PBS，并加入1毫升NP40裂解缓冲液。

用Dounce匀浆器的A杵轻轻研磨类器官3次，随后用B杵研磨3次。将悬液转移至15毫升离心管中。用1毫升裂解缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液转移至同一离心管中。室温孵育5分钟后，在500×g条件下离心5分钟。

吸出上清液，管中保留50微升。向管中加入1毫升NSB Plus培养基，5分钟后混匀以重悬沉淀。在管中制备Percoll梯度后，将类器官悬液铺在梯度上方。

接下来，在 4 摄氏度下以 500g 离心分层的类器官悬液 5 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 NSB Plus 培养基中。使用 40 微米细胞滤网过滤核悬液。

然后使用 DAPI 对细胞核进行染色，并在 Neubauer 计数板中计数。离心所需量的细胞核溶液，并根据基于微流控技术的单核 RNA 测序（snRNA-Seq）试剂盒说明书，将沉淀重悬于 NSB Plus 培养基中。