Name: 从人类多能干细胞生成神经视网膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 了解从人类多能干细胞生成神经视网膜的优化诱导技术。该方法显著减少类器官融合与粘附，提高视网膜生产效率与重复性，为视网膜疾病研究和药物筛选提供可靠模型。

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本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并经中国人民解放军总医院机构伦理委员会批准。WA09（H9）胚胎干细胞系购自WiCell研究所。
1. 培养基与试剂的配制
<ol>
	<li>人ESC培养基与传代溶液
	<ol>
		<li>维持培养基（MM）：配制500 mL完全MM（基础培养基 + 5倍补充剂；参见 材料表无菌操作。在室温（RT）下解冻5倍浓缩补充剂，或在2-8 °C过夜解冻。使用前预温至室温，充分搅拌直至补充剂澄清无浑浊。</li>
		<li>1% 细胞外基质（ECM）：使用预冷的移液枪头和无菌离心管，分装 200 µL ECM（参见 材料表每管置于冰上。将各管储存于 -20 °C 冰箱中。在冰上融化 ECM，并用预冷的 DMEM/F12 以 1:100 的比例稀释。</li>
		<li>0.5 mM pH = 8.0 EDTA：配制500 mL的0.5 mM EDTA，将500 µL的0.5 M EDTA和0.9 g NaCl加入500 mL的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中（参见 材料表充分混匀，2-8 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜分化培养基
	<ol>
		<li>无生长因子化学成分明确培养基（gfCDM）：通过混合45% Iscove改良Dulbecco培养基-谷氨酰胺（IMDM-GlutaMAX）、45% Ham's F12-谷氨酰胺（F12-Glutamax）、10% 无血清替代物（KSR）、1% 胆固醇脂质浓缩液和450 µM 巯基甘油配制gfCDM（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小分子化合物
	<ol>
		<li>Y-27632 2HCl：将50 mg Y-27632粉末加入3.122 mL二甲基亚砜（DMSO）中。分装并储存Y-27632（见 材料表在-80 °C避光保存2年，浓度为50 mM。使用时将原液稀释2,500倍（20 µM），相当于每毫升gfCDM中加入0.4 µL的Y-27632。</li>
		<li>IWR1-endo：加入2.4424 mL DMSO溶解10 mg IWR1-endo（见 材料表) 配制成10 mM的储存液。分装后于-80 °C保存，可保存长达2年。为达到诱导所需的3 µM终浓度，每毫升gfCDM中加入0.3 µL的10 mM IWR1-endo。</li>
		<li>SB431542：配制50 mM SB431542，加入10 mg SB431542（参见 材料表) 加入0.5203 mL DMSO中，充分混匀。在-80 °C下溶于溶剂中保存，最长可保存2年。配制工作浓度为10 µM的SB431542时，取2 µL 50 mM储备液加入10 mL gfCDM中。</li>
		<li>LDN-193189 2HCl：将5 mg LDN-193189 2HCl溶解（参见 材料表) 溶于 10.4297 mL DMSO 中，配制成 1 mM 的母液。根据生产商建议，储存于 -20 °C 或 -80 °C。每 10 mL gfCDM 中加入 0.1 µL 母液，使 LDN-193189 的诱导浓度为 100 nM。</li>
		<li>重组人骨形态发生蛋白4（BMP4）：用4 mM HCl溶液以50–200 µg/mL浓度重悬（见 材料表). 重悬后储存于 2 °C 至 8 °C 可保存 1 个月，或储存于 -20 °C 可保存 1 年。使用 1.5 nM BMP4 诱导 NR。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>长期NR培养基
	<ol>
		<li>视黄酸（RA）：称取6 mg RA粉末（见 材料表) 并加入 3.9941 mL DMSO 中。分装保存于 −80 °C，浓度为 5 mM，三个月内使用。为获得 0.5 µM 的工作浓度，将 10 µL 原液加入 100 mL 神经视网膜分化培养基（NRDM）中，临用前添加。 
		注意：制备和保存过程中需避光。</li>
		<li>牛磺酸：加入牛磺酸粉末（参见 材料表称取200 mg样品溶于7.9904 mL DMSO中，配制200 mM储备液。分装后于2–8 °C保存。工作浓度的牛磺酸（0.1 mM）通过每100 mL NRDM中加入50 µL储备液获得。</li>
		<li>NRDM：用 DMEM/F12-GlutaMAX 培养基配制 NRDM，添加 1% N2 补充剂、10% 胎牛血清、0.5 mM RA 和 0.1 mM 牛磺酸（参见 材料表). 2-8 °C 下可保存长达 2 周，或 -20 °C 下保存 6 个月，以确保组分的活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭缓冲液：用DPBS按1:9稀释，配制10%的工作液使用（见 材料清单). -20 °C 保存，可保存长达 5 年。 
	&#8203;注意：除称重外，所有其他操作均须在II级生物安全柜中进行，以确保无菌；若在制备过程中需添加已称量的试剂，应使用0.22 µm滤器进行过滤。</li>
</ol>
2. H9 胚胎干细胞的培养
<ol>
	<li>解冻 H9-ESCs
	<ol>
		<li>向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 的 1% ECM。在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 1 小时。 
		注意：避免将 ECM 沿孔壁加入，因其可能粘附于表面。</li>
		<li>从液氮罐中取出一支 H9-ESC 冻存管，在 37 °C 水浴中快速振荡 30 秒。 
		注意：不要让冻存管完全解冻。</li>
		<li>取出冻存管，用 75% 消毒酒精喷雾仔细消毒。将解冻后的 H9-ESC 加入含有 9 mL 含 10 µM Y-27632 的 MM 的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>在室温下以 190 × g 离心 5 分钟。用 1 mL 移液器小心吸除大部分上清液，保留约 50 µL 上清液以避免细胞损失。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入 1 mL 含 10 µM Y-27632 的 MM，用 1 mL 移液器轻轻吹打 5–10 次，充分重悬细胞沉淀。</li>
		<li>孵育 1 小时后去除 ECM 包被。向每孔加入 2 mL 预热的含 10 µM Y-27632 的 MM。</li>
		<li>每孔接种 0.5 mL 细胞悬液。轻轻左右摇动培养板，确保细胞均匀分布。</li>
		<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下培养至少 24 小时，期间勿扰动。</li>
		<li>每日更换培养基。当克隆密度达到 70% 或以上时，需进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>H9-ESCs 的传代
	<ol>
		<li>按上述方法（步骤 2.1.1）准备 ECM 包被的培养板，每孔加入 2 mL MM。</li>
		<li>从 6 孔板中移除用过的培养基。每孔用 1 mL DPBS 洗涤两次。</li>
		<li>缓慢向每孔加入 1 mL EDTA，洗涤两次，并在室温下用 1 mL EDTA 孵育 4–7 分钟。 
		注意：孵育期间，每隔 3 分钟在显微镜下观察 6 孔板。若大多数细胞接近从培养皿脱离，应立即进入下一步。避免长时间孵育，以减少对细胞的不利影响。</li>
		<li>弃去 EDTA，加入 1 mL MM 终止消化。</li>
		<li>轻轻敲击培养板，直至大部分细胞脱落。</li>
		<li>用 5 mL 移液器小心将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。用巴斯德移液器轻轻吹打 H9-ESC 克隆 3–5 次以混匀，然后将 20–100 µL 细胞悬液接种至新的 ECM 包被的 6 孔培养皿中，并前后轻轻摇动。</li>
		<li>在显微镜下观察到细胞密度足够时，将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下培养至少 24 小时，期间勿扰动。</li>
		<li>每日更换培养基。当克隆密度达到 70% 或以上时，需进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人类核受体的生成
注意：当集落达到约70%融合度时，可按照图1中所述操作步骤诱导其分化为视网膜类器官（ROs）。
<ol>
	<li>第0天 - 胚状体（EB）形成
	<ol>
		<li>用2 mL DPBS洗涤细胞后，向孔中加入含有20 µM Y27632的0.5 mL CDS（参见材料表）。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育3分钟。 
		注意：在显微镜下观察。尽可能缩短孵育时间，以避免对细胞产生有害影响。</li>
		<li>加入3 mL含有20 µM Y27632的MM终止消化。以190 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL含有20 µM Y27632的gfCDM中，并进行细胞计数。将相当于1.2 × 106个细胞（每孔1.2 × 104个细胞）的体积加入到10 mL gfCDM中，该培养基已预先加入20 µM Y-27632、3 µM IWR1-endo、10 µM SB431542和100 nM LDN-193189（参见材料表）。</li>
		<li>将100 µL细胞悬液加入96孔V型底锥形板的每一孔中。将培养板置于含5% CO2的湿润培养箱中，培养至第6天。 
		注意：至少24小时内不要移动培养板，以促进胚状体的贴附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天 - 视网膜诱导
	<ol>
		<li>第6天，加入含有55 ng/mL BMP4的10 mL gfCDM，以完成对胚状体的完全换液。将培养板放回培养箱。 
		注意：移液时应沿96孔V型底锥形孔的孔壁进行，以避免产生气泡。换液时避免吸走任何类器官。</li>
		<li>在第9天、第12天和第15天进行半量换液。用新鲜的gfCDM替换一半培养基，以逐步稀释BMP4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第18天 - 视网膜神经上皮长期培养
	<ol>
		<li>第18天，使用5 mL巴斯德吸管小心地将形成的胚状体转移至15 mL离心管中，并用NRDM轻轻冲洗一次。将胚状体转移至低吸附性的6孔板或24孔板中（参见材料表）。将培养板放回培养箱。</li>
		<li>每3天更换一次新鲜的NRDM。 
		&#8203;注意：换液期间关闭光源，因为视黄酸（RA）对光敏感。去除分化不良的类器官，并在显微镜下分离贴壁的类器官。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 人类核受体的分析
<ol>
	<li>视网膜类器官的包埋
	<ol>
		<li>选择不同代次的H9-ESCs以诱导生成三批视网膜类器官。 
		注意：三种评估方法（Kuwahara 等）各自形成的 NRs 数量分别设三个培养皿12，Döpper 等27，以及本研究中的改良方法）的诱导成功率进行计算。若在第30天通过光学显微镜观察到神经上皮样结构的形成，则视为诱导成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜类器官的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将3-5个类器官转移至1.5 mL离心管中。用移液器吸除多余培养基，并在室温下用1 mL DPBS洗涤类器官一次。静置使类器官沉降，小心吸除DPBS。加入1 mL 4%多聚甲醛（见 材料清单每1.5 mL离心管加入并置于4 °C固定。 
		注意：第6天和第18天的类器官（ROs）固定2小时；第30天固定12小时，第60天固定14小时。</li>
		<li>固定后，使用梯度酒精脱水。将ROs分别在50%、60%和70%酒精中各放置15分钟，随后在80%、90%、95%、100%和100%酒精中各放置10分钟。然后加入1:1的100%酒精与二甲苯混合液处理10分钟，接着用二甲苯处理两次，每次10分钟。</li>
		<li>将视网膜类器官（ROs）置于装有熔融石蜡的金属模具中（参见 材料表) 40分钟，然后将模具置于冰上淬灭以固定类器官。将包埋盒放入模具中，于-20 °C过夜冷冻。随后，小心剥离包埋盒。最后，在室温下保存。</li>
		<li>使用石蜡切片机制作连续切片（5 µm 厚度）。将切片固定于防脱载玻片上，干燥后室温保存。</li>
		<li>抗原修复前进行脱蜡和复水12,27.</li>
		<li>加入10 mL 20倍浓度pH 6.0柠檬酸抗原修复液（参见 材料表) 加至 190 mL 去离子水（ddH₂O）中2O（双蒸馏 H2O）。在高火下微波加热4分钟，直至沸腾。加入石蜡切片后，转低火加热20分钟，以完成抗原修复。</li>
		<li>让石蜡切片在通风处自然冷却，然后放入湿盒中。</li>
		<li>使用记号笔（参见 材料表）以标记各步骤。室温下用 0.2% Triton X-100 孵育 30 分钟以破膜，随后用 TPBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在湿润孵育盒中，用 DPBS 稀释的 10% 驴血清封闭，每染色区域加 10 µL，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>加入用10%驴血清稀释的一抗，在湿盒中4 °C孵育过夜。用TPBS洗涤样本3次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。 
		注意：一抗如下：anti-PAX6（1:250）、anti-SOX2（1:200）、anti-KI67（1:200）、anti-CHX10（1:200）、anti-β tubulin III（1:250）和anti-NESTIN（1:200）（参见 材料表).</li>
		<li>在湿盒中，用 DPBS 稀释的二抗室温孵育 1 小时。用 TPBS 洗涤三次，每次 10 分钟。 
		注意：避光保存，以防荧光二抗淬灭。二抗为 Alexa Fluor 488 标记的驴抗小鼠 IgG 和 Alexa Fluor 568 标记的驴抗兔 IgG，稀释比例为 1:400（参见 材料表).</li>
		<li>用含 DAPI（1:500；参见 材料表在室温避光条件下孵育10分钟。用TPBS洗涤三次，每次10分钟。</li>
		<li>滴加适量抗荧光封片剂（参见 材料表) 滴加到载玻片上，并用盖玻片覆盖。</li>
		<li>使用流式组织细胞定量分析仪进行可视化（参见 材料表），或类似物。</li>
		<li>显微镜分析后，将载玻片于 -20 °C 避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhanced 3D Neural Retina Differentiation from Human Embryonic Stem Cells

<ol><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: development and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Steinmetz, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).</li>
<li>Slijkerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+vertebrate+animal+models+for+functional+and+therapeutic+research+on+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).</li>
<li>Peng, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+classification+and+comparative+taxonomics+of+foveal+and+peripheral+cells+in+primate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina.</a> Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).</li>
<li>Ribeiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+visual+function+in+advanced+disease+after+transplantation+of+purified+human+pluripotent+stem+cell-derived+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors.</a> Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).</li>
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<li>Sanjurjo-Soriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RA+delays+initial+photoreceptor+differentiation+and+results+in+a+highly+structured+mature+Retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).</li>
<li>Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+cultivation%2C+differentiation%2C+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation.</a> Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+Chk1+inhibitor+and+BMP4+cooperatively+promotes+retinal+tissue+formation+in+self-organizing+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture.</a> Regen Ther. 19, 24-34 (2022).</li>
<li>Döpper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+protocol+for+3D+Retinal+organoids%2C+immunostaining+and+signal+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

人类类器官在空间和时间上均可重现胎儿视网膜的发育过程，早期类器官在发育的相应阶段表现出与胎儿视网膜高度相似的特征15在组织形态和分子表达方面，人类视网膜类器官（RO） closely mirror 视网膜组织的实际生长状态，在疾病建模、药物筛选和再生医学领域提供了巨大且前所未有的机遇。目前，已有多种不同的方法被建立用于从人类多能干细胞（PSCs）生成视网膜类器官（ROs） 体外，并且正在进行持续的改进和优化以进一步提高效率9Sasai 实验室首次报道了利用人胚胎干细胞（ESCs）生成多能干细胞（PSC）来源的视杯状结构（ROs）11人类ESC首先被制备成单细胞悬液，随后将等量细胞接种于96孔V型底锥形板中，细胞快速聚集形成类圆形的胚体（EB）。通过外源添加关键细胞信号通路因子，促进EB中视泡结构的形成，随后在悬浮培养中进一步成熟为具有层状结构的视杯样类器官（RO）。神经视网膜（NR）包含一种胶质细胞和六种不同类型的神经元， recapitulates视网膜发育的多个方面，如细胞...

眼睛是人类感觉器官中主要的信息来源，视网膜是哺乳动物眼睛中的主要视觉感觉组织1。视网膜病变是全球范围内导致眼病和失明的主要原因之一2。全球约有285万人因视网膜病变而遭受不同程度的视力障碍3。因此，研究其发病机制对于早期诊断和及时治疗至关重要。目前大多数关于人类视网膜病变的研究主要依赖于动物模型4,5,6。然而，人类视网膜是一种复杂的多层组织，包含多种细胞类型。传统的二维（2D）细胞培养和动物模型系统通常难以真实再现人类视网膜正常的时空发育过程及药物代谢特征7,8。
近年来，三维培养技术已发展到能够利用多能干细胞（PSCs）生成类器官组织9,10由人多能干细胞（PSCs）在三维悬浮培养系统中生成的视网膜类器官（ROs）不仅包含七种视网膜细胞类型，还呈现出与人类视网膜相似的明显分层结构 体内11,12,13人类多能干细胞来源的视网膜类器官已获得广泛应用并易于获取，目前是最理想的 体外 研究人类视网膜发育与疾病的模型14,15在过去几十年中，众多研究人员已证实，人类多能干细胞（PSCs），包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs），可通过多种诱导方案分化为视网膜类器官（ROs）。这些进展在视网膜病变的疾病建模、药物筛选以及基于干细胞的治疗方面具有巨大潜力16,17,18.
然而，从人类多能干细胞（PSCs）生成神经视网膜（NR）是一个复杂、繁琐且耗时的过程。此外，组织类器官在批次间的差异可能导致实验结果的可重复性降低19,20。多种内在和外在因素均可影响视网膜类器官（ROs）的产量，例如起始细胞的数量或物种、转录因子以及小分子化合物的使用21,22,23。自Sasai实验室首次生成人类RO以来11，多年来已提出多种改进方法，以提高诱导过程的简便性和效率13,21,24,25。遗憾的是，迄今为止，尚未在所有实验室中建立生成RO的金标准方案。事实上，不同诱导方法所产生的RO之间存在一定程度的差异，视网膜标志物的表达水平及其结构的稳定性也存在较大变异22,26。这些问题可能严重增加样本收集和研究结果解读的难度。因此，亟需一种更为统一且稳健的分化方案，以在最小化RO异质性的前提下最大化生成效率。
本研究描述了一种基于Kuwahara等人12和Döpper等人27方法的优化诱导方案，并提供了详细的实验步骤。该新方法显著降低了类器官发生空泡化和融合的概率，提高了生成视网膜神经层（NR）的成功率。这一进展在视网膜疾病建模、药物筛选以及细胞治疗应用方面具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>0.01 M TPBS</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>洗涤切片</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Servicebio</td><td>G1101-500ML</td><td>固定视网膜类器官</td></tr><tr><td>5 mL 巴斯德吸管</td><td>NEST Biotechnology</td><td>318516</td><td>移取视网膜类器官</td></tr><tr><td>96 孔 V 型底锥形板</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-9096VZ</td><td></td></tr><tr><td>粘附载玻片</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td>固定切片</td></tr><tr><td>AggreWell 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5893</td><td>培养基</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>SINOPHARM</td><td>10009218</td><td>脱水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CHX10</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365519</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片液</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Anti-NESTIN</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Anti-Neuronal Class III &amp;beta;-Tubulin(TUJ1)</td><td>Beyotime</td><td>AT809</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Anti-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>一抗</td></tr><tr><td>细胞解离液（CDS）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>细胞解离</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td>GSK-3&amp;alpha;/&amp;beta; 抑制剂</td></tr><tr><td>胆固醇脂质浓缩液</td><td>Gibco</td><td>12531018</td><td>250&amp;times;</td></tr><tr><td>柠檬酸抗原修复液</td><td>Servicebio</td><td>G1202-250ML</td><td>20&amp;times;，pH 6.0</td></tr><tr><td>CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001061</td><td>细胞冻存液</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>细胞核复染剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>培养基</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32766</td><td>二抗</td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>二抗</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Biosharp</td><td>BL518A</td><td>0.5 M，pH 8.0，用于细胞解离</td></tr><tr><td>细胞外基质（ECM）</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>包被培养板</td></tr><tr><td>F12-Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>流式组织细胞定量分析仪</td><td>TissueGnostics</td><td>TissueFAXS Plus</td><td>扫描切片</td></tr><tr><td>IMDM-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980030</td><td>培养基</td></tr><tr><td>IWR1-endo</td><td>Selleckchem</td><td>S7086</td><td>Wnt 抑制剂</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 2HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S7507</td><td>BMP 抑制剂</td></tr><tr><td>低吸附 24 孔板</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>低吸附 6 孔板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>维持培养基（MM）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>培养基</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>封闭缓冲液</td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>组织包埋</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 基础液（1x）</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>不含 Ca⁺、Mg⁺</td></tr><tr><td>重组人骨形态发生蛋白-4（rhBMP4）</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP</td><td>关键蛋白因子</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>粉末，避光保存</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td>ALK5 抑制剂</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Selleckchem</td><td>S7667</td><td>酪氨酸激酶抑制剂</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T0625-10G</td><td></td></tr><tr><td>硫代甘油</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>通透处理</td></tr><tr><td>WA09 胚胎干细胞系</td><td>WiCell Research Institute</td><td></td><td>细胞系</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>SINOPHARM</td><td>10023418</td><td>脱蜡</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCL</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>ROCK 抑制剂</td></tr></tbody></table>

由人多能干细胞生成神经视网膜

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一。研究其发病机制对于视网膜病变的早期诊断和及时治疗至关重要。然而，伦理限制阻碍了从人体获取直接证据。近年来，大量研究表明，通过不同的诱导方案，人类多能干细胞（PSCs）可被分化为视网膜类器官（ROs），在疾病建模、药物筛选以及基于干细胞的治疗方面具有巨大潜力。本研究描述了一种优化的诱导方案，可高效生成神经视网膜（NR），显著降低囊泡化和融合的发生概率，从而提高第60天前的制备成功率。该方法基于PSCs在解离后自我重排的能力，并结合特定的辅助因子，能够特异性地驱动NR的分化。此外，该技术操作简便、成本低廉，具有显著的可重复性和高效性，为视网膜疾病的个体化模型研究提供了广阔前景，同时也为细胞治疗、药物筛选和基因治疗测试等应用提供了充足的细胞资源。

修改后方案的图示概览见图1。当H9-ESCs生长至70%-80%密度时，用于生成视网膜类器官（ROs）。H9-ESCs的单细胞悬液在96孔V型底培养板中于第1天开始聚集，并在第6天形成边界清晰的圆形胚状体（EBs）。随着培养时间的延长，EBs的体积逐渐增大。在第30天，神经上皮样结构在长期神经视网膜（NR）分化过程中明显形成并增厚。
此外，将改进后的方法与另外两种方法（Kuwahara 等）进行了比较12 和 Döpper 等人27）以评估其重复性和效率（补充图1）。本研究还观察到，采用改良方法在第1天形成的拟胚体形态略差于另外两种方法。然而，使用改良方法在第18天形成的神经上皮结构更为连续（图2）。第30天时，采用改良方法获得的早期神经球在形态和大小上相似，呈规则的圆形（图3...

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。

视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一。研究其发病机制对于疾病的早期诊断和及时治疗至关重要……

我们的研究团队致力于探索人类视网膜疾病的发病机制及治疗方法。本方案描述了一种经过优化的诱导技术，可生成神经视网膜，显著降低囊状结构扩大和融合的概率，从而将视网膜生成的成功率提高至60%。该改良方法在生成神经视网膜方面更为简便高效，有望成为更理想的药物筛选和细胞治疗疾病模型。未来，我们将利用视网膜类器官模型研究理化因素对视网膜发育及其潜在机制的影响。首先，向6孔板的每孔中加入1毫升1%细胞外基质。将该培养板置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育。一小时后，向每个孔中加入两毫升预热的维持培养基，其中含有 0.4 微摩尔的 Y-27632。解冻 H9 胚胎干细胞时，将冻存管置于 37 摄氏度水浴中轻轻摇晃 30 秒。用 75% 的消毒酒精喷雾仔细对冻存管进行表面消毒。然后，将解冻的细胞转移至含有维持培养基和 Y-27632 的 15 毫升离心管中。在室温下以 190 ×g 离心 5 分钟。随后，小心吸除大部分上清液，并将细胞重悬于 1 毫升含有 Y-27632 的维持培养基中。将0.5毫升细胞悬液分别加入含有维持培养基的细胞外基质包被板的每个孔中。水平轻轻摇动培养板，并在37°C、5%二氧化碳条件下孵育至少24小时。每天更换培养基。当克隆密度达到70%时，移除用过的培养基。用DPBS洗涤两次后，在室温下用一毫升EDTA孵育细胞4至7分钟，并彻底弃去EDTA。向细胞中加入一毫升维持培养基，并轻轻敲击培养板。然后将脱落的细胞转移至15毫升离心管中，轻轻吹打混匀3到5次。取20至100微升细胞悬液加入预先包被ECM的培养板各孔中，并充分混匀。在显微镜下确认细胞密度，将细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养。首先，将 H9 胚胎干细胞在含有 Y-27632 的维持培养基中解冻并进行培养。在第 0 天，当细胞集落达到 70% 汇合度时，用 2 毫升 DPBS 洗涤细胞。随后，将细胞与 0.5 毫升细胞解离溶液（含 20 微摩尔/升 Y-27632）共同孵育。为终止消化，加入含有 20 微摩尔/升 Y-27632 的 3 毫升维持培养基。为培养细胞，将离心管在 190 ×g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 1 毫升含 Y-27632 的无生长因子化学成分明确培养基重悬沉淀。计数细胞后，将120万个细胞加入10毫升无生长因子的化学成分明确培养基中，充分混匀。随后将100微升细胞悬液分装至96孔圆底培养板的每孔中。在含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。为了在第6天诱导视网膜形成，向96孔V型底板的每孔中加入含有BMP4的培养基，并在第9、12和15天再次孵育。将用过的培养基更换一半为不含BMP4的新鲜培养基。在第18天，小心地将形成的类胚体转移至15毫升离心管中。在类胚体自然沉降后，轻轻移除上清液，并用神经视网膜分化培养基冲洗类胚体。随后将类胚体转移至低吸附6孔板中，再次进行培养。第21天时，明场图像显示通过该方法生成的神经视网膜中存在连续的神经上皮结构。与其它方法相比，采用本方案诱导视网膜的成功率显著更高，且生成的视网膜类器官在大小和形态上均相似。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人类多能干细胞生成神经视网膜

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。...

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。...

无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。...

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。...

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

了解从人类多能干细胞生成神经视网膜的优化诱导技术。该方法显著减少类器官融合与粘附，提高视网膜生产效率与重复性，为视网膜疾病研究和药物筛选提供可靠模型。

由人多能干细胞生成神经视网膜

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