在体外使用 邻 苯二甲醛在培养的哺乳动物细胞中快速定量氧化和还原形式的谷胱甘肽
2024年6月28日
通过使用 邻苯二甲醛 （OPA） 实现了氧化型和还原型谷胱甘肽（分别为 GSSG 和 GSH）的定量。OPA一旦与GSH偶联，就会变得高度荧光，但在还原之前无法与GSSG偶联。在这里，我们描述了一种多参数测定法，以使用蛋白质定量进行归一化来量化两者。
我们的目标是提供一种新的方法来量化硫醇浓度，特别关注可以原位进行的各种细胞系的 GSH 和 GSSG 浓度。我们认为这对科学界来说是一个有用的协议。已经做出了许多努力来检测活性氧感兴趣的利基和特定生物标志物，并且一些人对检测短寿命活性氧（如自由基检测）和小分子（如羟基和单线态氧）产生了极大的兴趣。
对于一些机构来说，一个关键挑战是能够在不需要昂贵的设备或费力的过程的情况下准确和特异性地检测感兴趣的生物标志物。该协议允许进行多参数分析，允许在不需要单独协议的情况下对数据进行归一化，并删除了在其他分析中发现的几个阶段，这些分析非常耗时，存在不相容的试剂或使用对健康有害的试剂。纳米材料安全小组将继续评估各种纳米材料和聚合物可能对人类健康产生的影响。
我们认为该协议是我们实现这一目标的工具包的重要组成部分，因为该协议可能会被多路复用以检测其他生物标志物。
概述
本研究提出了一种定量测定多种细胞系中还原型（GSH）和氧化型（GSSG）谷胱甘肽浓度的新方案。该方法利用邻苯二甲醛（OPA）进行荧光检测，可在无需复杂操作步骤的情况下实现数据的高效归一化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 活性氧是多种生物过程中的重要生物标志物。
- 准确检测谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）对于理解氧化应激至关重要。
- 现有方法可能成本较高且耗时较长。
- 本实验方案旨在简化定量检测流程。
研究目的
- 提供一种可靠的谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度定量方法。
- 促进在不同细胞系中的原位分析。
- 降低现有检测方法的复杂性和所需时间。
使用的方法
- 制备谷胱甘肽标准品及校准范围。
- 用特定试剂洗涤并孵育细胞沉淀。
- 使用邻苯二甲醛（OPA）进行谷胱甘肽的荧光检测。
- 在指定的激发和发射波长下读取荧光值。
主要结果
- 经不同纳米材料处理后，A-549 细胞表现出不同的 GSH/GSSG 比值。
- 经 125 µg/mL 银处理后，GSSG 水平最高。
- 该检测方法在蛋白质定量方面表现出有效的归一化效果。
- 结果表明，该方法具有多重检测其他生物标志物的潜力。
结论
- 本方案为谷胱甘肽的定量分析提供了一种简化的流程。
- 该方法可整合到更广泛的氧化应激与生物标志物研究中。
- 该方法操作简便，无需昂贵的仪器设备。
常见问题
行业重要性概述
在培养的哺乳动物细胞中对还原型和氧化型谷胱甘肽进行定量评估，对于早期药物发现中细胞氧化还原状态和氧化应激反应的评价至关重要。该基于邻苯二甲醛（OPA）的检测方法可实现谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的快速、多重定量，支持无需专用仪器的可靠生物标志物分析。本方案可与归一化和细胞毒性检测兼容，有助于在药物发现和临床前研究流程中实现数据整合的标准化。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接测量细胞抗氧化能力，有助于揭示作用机制并降低研发风险。
- 支持在与疾病相关的模型中对氧化应激通路进行功能验证。
- 有助于快速验证靶点参与及通路调控的假设。
筛选与检测方法开发
- 为高通量化合物筛选提供标准化的定量读数。
- 可在多种细胞系中实现氧化还原调控的可重复性评估。
- 整合蛋白质归一化与细胞毒性评估，实现多参数输出。
转化与临床前研究
- 将氧化应激生物标志物的定量与转化终点相整合。
- 实现从体外发现到临床前模型验证的连续性。
- 基于细胞氧化还原状态支持经风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
这种基于OPA的谷胱甘肽定量方法适用于从早期发现到临床前研究的连续过程，能够将氧化还原生物标志物分析无缝整合到先导化合物筛选和机制研究中。
- 发现生物学：支持对氧化应激通路进行假设驱动的探究及靶点验证。
- 筛选：提供适用于化合物初筛和检测方法标准化的定量、可重复的输出结果。
- 分析：基于荧光检测提供可靠的测量手段，用于细胞氧化还原状态的比较分析。
- 转化研究：在氧化应激作为相关终点时，连接体外研究结果与临床前生物标志物策略。
- 企业级复用：提供可扩展且适应性强的平台，用于跨多个项目进行氧化还原生物标志物的定量分析。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对氧化应激通路调控及靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：降低检测复杂性、缩短实验时间、减少有害试剂使用，同时实现多重检测输出。
- 战略价值：通过整合氧化还原生物标志物与细胞毒性及蛋白质归一化数据，提升“推进/终止”决策的准确性。
- 项目组合影响：基于机制性研究和生物标志物驱动的洞察，支持对资产进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备基于荧光的实验建立与数据分析的专业知识。
- 需要配备荧光酶标仪及标准的细胞培养基础设施。
- 要求跨团队在标准化、归一化及细胞毒性评估整合方面保持一致。
- 可根据需要优化实验方案，适用于多种哺乳动物细胞系。
- 多重检测其他生物标志物的潜力取决于试剂的兼容性及验证结果。
