阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

我们正在研发一种黏膜疫苗，该疫苗可产生类似于感染状态的免疫应答，有望预防感染并阻断传播。我们已开发出一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸递送系统。通过肌肉注射卵清蛋白进行免疫，可同时激发全身性和黏膜免疫应答。

在今后的研究中，可使用肠道相关疾病的动物模型，进一步评估阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸在增强混合保护作用方面的效果及机制。通过在40摄氏度下搅拌，将0.15克吐温80溶解于28.2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，开始水相的制备。为制备油相配方，在40摄氏度下搅拌的同时，将司盘85、DOTAP和视黄酸溶解于角鲨烯中。

接下来，以每分钟1毫升的速度将水相逐滴加入油相中，在1400转/分钟下搅拌，以制备初乳型油水乳液。使用高剪切乳化器在30,000转/分钟下预乳化混合物6分钟。将初乳型油水乳液在900巴压力下用高压均质机处理12个循环，以获得均匀的纳米乳液。

将乳液收集到一个50毫升的烧瓶中，并使用带有0.2微米PES滤器的注射器进行过滤除菌。通过导管将烧瓶连接至施伦克线，旋转三通旋塞使系统与真空管相连。

打开真空泵，在烧瓶中创建真空。然后，旋转三通旋塞，将系统连接至氩气管并用氩气填充。更换烧瓶的瓶塞，并用石蜡膜密封。

用锡箔纸包裹烧瓶，并在 4 摄氏度下保存。打开动态光散射仪，等待 30 分钟，使激光光源稳定。用超纯水将纳米乳液稀释 50 倍，取 1 毫升样品加入相应的样品池中。

在仪器上将温度设置为 25 摄氏度。选择水作为分散介质，一次性塑料皿作为测量池。加载样品并测量粒径。

以每个样本三次重复测量的平均值作为结果。开始抗原包被时，用包被缓冲液将卵清蛋白稀释至每毫升5微克。在96孔ELISA板中，每孔加入100微升卵清蛋白溶液，于4摄氏度孵育过夜进行包被。

第二天，用 PBST 洗涤各孔 5 次。每孔加入 250 微升含 1% BSA 的 PBST，37 摄氏度封闭 2 小时。为制备 1000 倍稀释的血清，首先用 0.5% BSA 的 PBST 将 20 微升血清稀释至 1 毫升。

然后，取 25 微升血清等分试样，用 0.5%BSAPBST 稀释至 500 微升。将稀释 1000 倍的血清 200 微升加入包被板的第一排孔中。随后，除第一排孔外，向其余各孔加入 100 微升 0.5%BSAPBST。

从第一行转移100微升至第二行，并混合10次。为建立不同浓度的血清用于IgG检测，弃去最后一行的100微升液体。接下来，用0.5% BSA-PBST稀释小鼠阴道灌洗液、支气管肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液，用含20%胎牛血清的PBST稀释小肠灌洗液。

将酶标板在37摄氏度孵育1小时。用PBST洗涤5次。每孔加入100 µL HRP标记的山羊抗小鼠抗体，于37摄氏度孵育40分钟。

用 PBST 洗涤反应孔五次后，每孔加入 100 微升 TMB ELISA 底物，于避光环境中孵育五分钟。加入 100 微升 450 纳米终止液以终止反应。使用酶标仪在 450 纳米处测定吸光度。

将抗体滴度的阳性反应值定义为对照小鼠血清值的2.1倍进行计算。纳米乳剂佐剂疫苗显著提高了血清中卵清蛋白特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。当卵清蛋白与阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸联合使用时，阴道灌洗液和小肠灌洗液中的特异性IgA水平显著增强。