Name: 阳离子纳米乳液包封的视黄酸作为佐剂，促进 OVA 特异性全身和粘膜反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 了解阳离子纳米乳液包封视黄酸作为疫苗佐剂的方法，用于增强OVA特异性全身和粘膜免疫反应。该技术可提升sIgA产生，为肠道疾病疫苗开发提供新策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由重庆市自然科学基金重点项目（编号：cstc2020jcyj-zdxmX0027）和国家自然科学基金项目（编号：32270988）资助。

动物实验遵循《实验动物使用与护理指南》进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。
1. 纳米乳液（NEs）的制备
<ol>
	<li>制备水相时，在40 °C下搅拌条件下将0.15 g聚山梨酯80溶解于28.2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>制备油相时，采用纳米乳液的油相配方（见表1）。在40 °C搅拌条件下，将司盘85三油酸酯、DOTAP和RA溶解于角鲨烯中。</li>
	<li>制备初乳（O/W型乳液）时，在磁力搅拌转速1400 rpm下，以1 mL/min的速度缓慢逐滴加入水相。使用高剪切乳化器在30,000 rpm下预乳化6分钟。</li>
	<li>进行高压均质（HPH）时，将上述制得的初乳通过高压均质机在900 bar压力下处理12个循环，获得粒径在160–190 nm范围内的均匀纳米乳液。</li>
	<li>过程结束后，将乳液收集至50 mL烧瓶中，并通过0.2 µm PES滤膜过滤除菌。</li>
	<li>将烧瓶通过导管连接至施伦克线（Schlenk Line），旋转三通活塞使系统与真空管路连通，开启真空泵对烧瓶抽真空。随后旋转三通活塞，使系统与氩气管路连通并充入氩气。重复此操作3次，确保烧瓶内充满氩气。</li>
	<li>更换瓶塞并用石蜡膜密封，用锡箔纸包裹烧瓶，于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 纳米乳液的表征
<ol>
	<li>粒径和泽塔电位检测
	<ol>
		<li>开启仪器，等待30分钟，使激光光源稳定。</li>
		<li>用超纯水将纳米乳（NE）稀释50倍，取1 mL样品加入相应的样品池中。</li>
		<li>测量粒径时，设定温度为25 °C，选择水作为分散介质，选择一次性塑料样品池作为测量池。加载样品后自动测量。每份样品重复测量三次，取平均值作为最终结果。</li>
		<li>测量泽塔电位时，设定温度为25 °C。由于选择水相作为分散介质，应选用Smoluchowski模型，并使用折叠毛细管样品池作为测量池。加载样品后自动测量。每份样品重复测量三次，取平均值作为最终结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包封率和载药率的测定
	<ol>
		<li>为测定纳米乳（NE）中负载的RA含量，使用无水乙醇破乳并提取NE中的RA。向5 µL样品中加入995 µL乙醇，然后在355 nm波长下使用分光光度计测定溶液中RA的含量，并与标准曲线进行比较。使用以下公式计算： 
		包封率 = 实际RA载量 / 投药量 
		载药率 = 实际RA载量 / 样品质量</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫程序与样本采集
<ol>
	<li>免疫程序与分组
	<ol>
		<li>将6-8周龄、体重约18-21 g的雌性Balb/C小鼠按每组5只进行分组，并于第0天、第14天和第28天按照以下实验分组进行免疫：(1) PBS组，(2) 卵清蛋白（OVA）组，(3) OVA+NE-RA（OVA/NE-RA）组，(4) OVA+CNE-RA（OVA/CNE-RA）组。</li>
		<li>通过股四头肌肌肉注射对所有小鼠进行免疫，每只注射200 µL不同疫苗制剂：其中100 µL乳剂和15 µg OVA吸附于100 µL PBS中，使用前混合均匀，每条后肢注射100 µL。对照组小鼠仅注射PBS。</li>
		<li>安乐死：在完成三次免疫后2周，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）对所有小鼠实施安乐死。</li>
		<li>样本采集与处理：安乐死后，用剪刀剪开小鼠胸腔，将注射器直接插入心脏吸取约0.5 mL全血。室温静置2小时后，在4 °C下以1800 x g离心5分钟。收集血清，分装后于-80 °C保存以备后续分析。</li>
		<li>采集全血、脾脏、阴道灌洗液（VLF）、支气管肺泡灌洗液（BALF）、鼻腔灌洗液（NLF）和小肠灌洗液（SILF）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脾淋巴细胞的分离
	<ol>
		<li>将小鼠浸入75%（v/v）乙醇中进行短暂消毒，转移至洁净台。用剪刀剪开左侧腹部皮肤，暴露并取出脾脏。</li>
		<li>将脾脏置于含有3 mL PBS的培养皿中，使用筛网（200目，70 µm）和研磨棒研磨后过滤至15 mL离心管中。</li>
		<li>在室温下以650 x g离心5分钟。弃去上清液，沉淀用3 mL红细胞裂解液重悬，室温孵育5分钟。</li>
		<li>向离心管中加入10 mL PBS，充分振荡终止反应，然后在室温下以650 x g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于10 mL PBS中，取20 µL细胞稀释液加入自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
		<li>在室温下以650 x g离心5分钟。弃去上清液，用1640完全培养基（含1%青霉素-链霉素，10%胎牛血清）将细胞稀释至1 x 106 个/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VLF采集：用75 µL的1% BSA/PBST对阴道冲洗4次，合并灌洗液并收集于1.5 mL离心管中，在4 °C下以5000 x g离心20分钟，用移液器收集上清液并于-80 °C保存。</li>
	<li>BALF与NLF采集
	<ol>
		<li>处死后用75%（v/v）乙醇对小鼠体表消毒。将小鼠仰卧固定并拉直颈部，用剪刀沿颈部皮肤做纵向切口，用镊子分离肌肉组织，充分暴露气管。</li>
		<li>在气管上做一小横切口，插入导管并朝向肺部，将注射器连接至导管，向肺内注入0.5 mL PBS后回抽，重复冲洗3次，于4 °C下以650 x g离心5分钟，收集上清液（BALF）并于-80 °C保存。</li>
		<li>将导管反向插入鼻腔，连接注射器并注入0.5 mL PBS，液体将流经鼻腔进入1.5 mL离心管。从离心管中吸出冲洗液，重复冲洗2次，然后于4 °C下以650 x g离心5分钟，收集上清液（NLF）并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SILF采集
	<ol>
		<li>配制含0.1 mg/mL胰蛋白酶抑制剂、50 mM/L EDTA-2Na、1 mM/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS溶液作为小肠灌洗液。室温搅拌溶解后于4 °C保存。</li>
		<li>沿肠管纵行剪开小肠，浸入3 mL小肠灌洗液中，在4 °C下以15 rpm垂直振荡30分钟。于4 °C下以1440 x g离心20分钟，用移液器收集上清液，再于4 °C下以5000 x g离心20分钟。收集上清液（SILF）并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肌肉注射后评估卵清蛋白特异性抗体反应
<ol>
	<li>采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中IgG、IgG1和IgG2a亚类的水平，以及VLF、BALF、NLF和SILF中特异性sIgA的水平。</li>
	<li>进行抗原包被时，用包被缓冲液将OVA稀释至5 µg/mL，并在4 °C下每孔加入100 µL OVA溶液，包被96孔ELISA板过夜。</li>
	<li>用PBST洗涤ELISA板5次，然后加入250 µL含1% BSA的PBST溶液，在37 °C孵育2小时以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>用PBST洗涤ELISA板5次，随后每孔加入100 µL按以下方法稀释的待测样品，在37 °C孵育1小时。血清、VLF、BALF和NLF使用含0.5% BSA的PBST稀释，SILF使用含20%胎牛血清（FCS）的PBST稀释。
	<ol>
		<li>血清样品采用两步稀释法进行1000倍稀释：先将20 µL血清稀释至1 mL，再取25 µL该稀释液进一步稀释至500 µL。此稀释液用于检测IgG1和IgG2a。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1000倍稀释的血清200 µL加入包被板的第一行各孔中，除第一行外其余各孔均加入100 µL含0.5% BSA的PBST。用移液器从第一行向第二行转移100 µL液体，并吹打混匀10次。重复此操作至第八行，最后一行多余100 µL液体弃去，从而获得不同浓度的血清用于IgG检测。</li>
	<li>为检测IgA，将BALF、NLF和SILF进行1:1稀释。VLF的稀释方法与血清相同。</li>
	<li>用PBST洗涤ELISA板5次，然后每孔加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG/IgG1/IgG2a/IgA抗体（用PBST按1:10000稀释），在37 °C孵育40分钟。</li>
	<li>用PBST洗涤ELISA板5次，每孔加入100 µL高敏TMB ELISA底物溶液，将板置于避光环境中反应5分钟。立即每孔加入100 µL针对TMB底物的450 nm终止液以终止反应。</li>
	<li>测定各孔在450 nm处的吸光度（OD值），以空白组小鼠血清值的2.1倍作为阳性反应阈值，计算抗体滴度。</li>
</ol>
5. ELISpot 检测
<ol>
	<li>按照ELISpot Plus试剂盒的说明书，使用试剂盒中的小鼠IFN-γ（ALP）进行检测。</li>
	<li>从密封包装中取出板条，用无菌PBS洗涤4次（200 µL/孔）。加入1640完全培养基（200 µL/孔）对板条进行预处理，并在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>吸去培养基，向孔中加入步骤3.2.2中配制的调整至适当浓度的淋巴细胞悬液（100 µL/孔），然后加入100 µL刺激物，即含20 µg/mL OVA257~264或OVA323~339的1640完全培养基，或仅1640完全培养基。将板条置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时，并用铝箔纸包裹以防止蒸发。</li>
	<li>弃去细胞悬液，用PBS洗涤板条5次（200 µL/孔）。将检测抗体（R4-6A2-生物素）用含0.5%胎牛血清的PBS（PBS-0.5% FCS）稀释至1 µg/mL，每孔加入100 µL，在室温下孵育2小时。</li>
	<li>按步骤5.2洗涤板条。将链霉亲和素-ALP（1:1000）用PBS-0.5% FCS稀释，每孔加入100 µL，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>按步骤5.2洗涤板条。将即用型底物溶液（BCIP/NBT-plus）经0.45 µm滤膜过滤后，每孔加入100 µL，孵育至清晰斑点出现。</li>
	<li>用大量自来水洗涤以终止显色反应，取下柔软塑料膜，将板条晾干。</li>
	<li>使用ELISpot读板仪观察并计数斑点。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对4组数据间的差异进行分析，随后进行Tukey多重比较事后检验。所有结果均以均值±标准差（mean ± SD）表示。P值小于0.05被认为具有统计学意义。</li>
</ol>

Evaluating Immunogenicity of Nanoemulsion&#45;Encapsulated Retinoic Acid in Mice

<ol><li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li>
<li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoemulsion%3A+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li>
<li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disintegration+and+cancer+immunotherapy+efficacy+of+a+squalane-in-water+delivery+system+emulsified+by+bioresorbable+poly%28ethylene+glycol%29-block-polylactide%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide.</a> Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).</li>
<li>Iwasaki, A., Omer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+vaccines+work%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Why and how vaccines work.</a> Cell. 183 (2), 290-295 (2020).</li>
<li>Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+protection+mediated+by+cooperation+between+vascular+and+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers.</a> Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).</li>
<li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoemulsion%3A+Concepts%2C+development+and+applications+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> J Cont Release. 252, 28-49 (2017).</li>
<li>Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+adjuvant+activity+of+cationic+liposome%3A+Phosphorylation+of+a+MAP+kinase%2C+ERK+and+induction+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines.</a> Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).</li>
<li>Korsholm, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+mechanism+of+cationic+dimethyldioctadecylammonium+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes.</a> Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).</li>
<li>Agger, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+formulated+with+synthetic+mycobacterial+cordfactor+%28CAF01%29%3A+A+versatile+ddjuvant+for+vaccines+with+different+immunological+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements.</a> Plos One. 3 (9), e3116(2008).</li>
<li>Slutter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+vaccination+with+N-trimethyl+chitosan+and+PLGA+based+nanoparticles%3A+Nanoparticle+characteristics+determine+quality+and+strength+of+the+antibody+response+in+mice+against+the+encapsulated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen.</a> Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).</li>
<li>Nochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogel+antigenic+protein-delivery+system+for+adjuvant-free+intranasal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines.</a> Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).</li>
<li>Henriksen-Lacey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+cationic+charge+and+antigen+adsorption+are+important+properties+for+the+efficient+deposition+of+antigen+at+the+injection+site+and+ability+of+the+vaccine+to+induce+a+CMI+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.</a> J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).</li>
<li>Zhong, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovaccines+mediated+subcutis-to-intestine+cascade+for+improved+protection+against+intestinal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections.</a> Small. 18 (1), e2105530(2022).</li>
<li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gut-homing+IgA-secreting+B+cells+by+intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells.</a> Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+homing+of+protective+T+and+B+cells+to+the+gut+after+subcutaneous+immunization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).</li>
<li>Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traversing+the+skin+barrier+with+nano-emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Traversing the skin barrier with nano-emulsions.</a> Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).</li>
<li>Lodaya, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+design%2C+optimization+and+evaluations+of+an+%CE%B1-tocopherol-containing+self-emulsified+adjuvant+system+using+inactivated+influenza+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine.</a> J Cont Release. 316, 12-21 (2019).</li>
<li>Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+nanostructures+for+vaccines+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biomimetics%22%5BJournal%5D)">Cationic nanostructures for vaccines design.</a> Biomimetics. 5 (3), 32(2020).</li>
<li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), e2209624(2023).</li>
<li>Nie, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+coating+approach+to+overcome+mucosal+entrapment+of+DNA+nanoparticles+for+oral+gene+delivery+of+glucagon-like+peptide+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1.</a> Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).</li>
<li>Lou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+self-amplifying+mRNA+vaccines+by+cationic+lipid+nanoparticles%3A+The+impact+of+cationic+lipid+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cont+Release%22%5BJournal%5D)">Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection.</a> J Cont Release. 325, 370-379 (2020).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳液包裹的视黄酸（retinoic acid, RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身性和黏膜免疫应答。与传统的纳米乳液（NE）佐剂相比，其具有以下两个优势。首先，通常情况下，水包油型（O/W）纳米乳液表面带有较强的负电荷，难以直接负载抗原；而阳离子型纳米乳液可有效吸附肽类或蛋白质抗原，从而增强特异性免疫原性。其次，传统疫苗研究经验表明，皮下或肌内注射难以有效激发黏膜免疫应答5。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的RA添加至纳米乳液中14,15,16，肌内注射即可促进阴道和小肠中OVA特异性分泌型IgA（sIgA）的产生。该方案目前仅在卵清蛋白（OVA）抗原中进行了验证，尚未在其他抗原中验证。在后续研究中，可利用肠道相关疾病的动物模型，进一步评估CNE-RA在增强疫苗保护效果及其作用机制方面的潜力。
高压均质、剪切混合和超声处理是制备纳米乳剂（NEs）最常用的高能乳化方法，其中高压均质可获得最佳的均一性17。然而，高压均质方法通常需要昂贵的专用设备，制备成本较高，且存在不可忽视的冷却问题18。在我们之前的实验中发现，均质压力和循环次数对纳米乳剂的粒径有影响，在一定范围内，均质压力越高、循环次数越多，粒径 tends 越小。通过制备水包油型乳液初乳，可有效将油相和水相转化为较大的液滴，从而减少均质循环次数。如果省略此步骤，增加均质循环次数最终仍可得到粒径和分散性相同的纳米乳剂。在水相中用0.9%生理盐水或柠檬酸钠缓冲液替代PBS，对纳米乳剂的粒径和分散性无显著影响。
多种阳离子脂质广泛应用于疫苗设计19，其中DOTAP因其已获准用于临床、具有良好的安全性和耐受性而被选用。纳米乳液（NE）表面过量的正电荷可能导致细胞毒性。出于安全性考虑，在制备阳离子纳米乳液时需慎重选择阳离子脂质的种类及其用量。其他常用于疫苗研究的阳离子脂质包括DLin-MC3-DMA（(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate）20、DMG-PEG2000（1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000）、DOTMA（N,N,N-三甲基-2,3-双(十八-9-烯-1-基氧基)丙烷-1-氯化铵）21、DC-Chol（3β-[N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐）22，这些脂质是否可用于制备阳离子纳米乳液仍有待进一步研究。
近年来，视黄酸（RA）因其可通过多种途径诱导免疫细胞归巢至肠黏膜而受到关注。然而，视黄酸不仅水溶性差，而且对光和氧不稳定。在纳米乳液（NEs）的制备和储存过程中，应始终注意对视黄酸进行避光和隔氧保护。视黄酸在光照和氧气暴露下会迅速发生氧化分解，最终丧失其佐剂效应。

佐剂常用于通过刺激免疫系统对疫苗产生更强的反应，从而增强疫苗的效力，提高机体对特定病原体的免疫力1。纳米乳液（NE）佐剂是指将一定比例的油相与水相乳化后形成的热力学稳定的胶体分散体系，可呈现为水包油（O/W）或油包水（W/O）形式的乳液2。O/W型纳米乳液佐剂可在注射部位诱导细胞因子和趋化因子的产生，促进单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等重要免疫细胞的快速聚集与增殖，增强免疫应答，并提高抗原的免疫原性3。目前已有三种纳米乳液佐剂（MF59、AS03和AF03）获准用于疫苗，且表现出良好的安全性和有效性4。
然而，目前获批的佐剂配方在传统非肠道疫苗接种中对黏膜免疫的作用关注不足5。视黄酸（RA）已被报道可诱导免疫细胞向肠道归巢，但其低极性、水溶性差以及光和热稳定性差限制了其在高效肠道疫苗接种中的应用。纳米乳剂可提高高脂溶性药物的生物利用度，且水包油（O/W）乳剂佐剂的油相核心适合溶解RA等非极性物质6。因此，纳米乳剂可作为RA的载体，以实现系统性免疫与黏膜免疫的双重应答效果。
与中性或阴离子递送系统相比，阳离子递送系统具有相对高效的抗原包封和递送能力，可增强抗原的免疫原性7,8,9。多种佐剂系统的阳离子表面电荷对其佐剂效应具有重要意义10,11,12。阳离子电荷是延长疫苗在注射部位滞留时间、增强抗原呈递以及延长对机体细胞免疫刺激的重要因素12。
基于上述考虑，我们开发了一种阳离子型纳米乳剂，用于有效共递送视黄酸（RA）和抗原。采用动态光散射法（DLS）测定纳米乳剂的粒径和zeta电位，并通过肌内注射方式评估该纳米乳剂与卵清蛋白（OVA）联合使用后诱导的全身及黏膜免疫应答13。

<table><tbody><tr><td>1640 培养基</td><td>GIBCO，美国</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>TMB底物的450 nm终止液</td><td>Abcam</td><td>ab171529-1000 mL</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Countstar，中国</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>德国艾本多夫</td><td>5811000398</td><td></td></tr><tr><td>动态光散射</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>CordenPharma，瑞士</td><td>O02002</td><td></td></tr><tr><td>ELISpot Plus：小鼠干扰素-γ（ALP）</td><td>mabtech</td><td>ab205719</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，美国</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>全功能酶标仪</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国</td><td>VL0000D2</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG1（HRP）</td><td>Abcam</td><td>ab97240-1mg</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgA α链（HRP）</td><td>Abcam</td><td>ab97235-1mg</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG H&amp;amp;L（HRP）</td><td>Abcam</td><td>Ab205720-500ug</td><td></td></tr><tr><td>山羊&amp;nbsp;抗小鼠 IgG2a 重链（HRP）</td><td>Abcam</td><td>ab97245-1mg</td><td></td></tr><tr><td>高压均质机</td><td>美国胸科学会</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MONTANE 85 PPI</td><td>SEPPIC，法国</td><td>L12910</td><td></td></tr><tr><td>MONTANOX 80 PPI</td><td>SEPPIC，法国</td><td>36372K</td><td></td></tr><tr><td>OVA257&amp;ndash;264</td><td>上海博泰生物科技有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OVA323-339</td><td>上海博泰生物科技有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Solarbio，中国</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>日本 TCI</td><td>TCI-R0064-5G</td><td></td></tr><tr><td>角鲨烯</td><td>Sigma，美国</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>T10 基础型 Ultra-Turrax</td><td>IKA，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA底物</td><td>Abcam</td><td>ab171523-1000ml</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>金刚石</td><td>A003570-0100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin，中国</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>日立</td><td>U-3900</td><td></td></tr></tbody></table>

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进ova特异性全身及黏膜免疫应答

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

阳离子纳米结构作为一种佐剂和抗原递送系统，可增强树突状细胞成熟、活性氧（ROS）生成以及抗原摄取，进而促进抗原特异性免疫应答。近年来，视黄酸（RA）因其在激活黏膜免疫应答中的作用而受到越来越多关注；然而，若要将RA用作黏膜佐剂，必须解决其溶解性、载药量和递送问题。本文介绍一种由阳离子脂质1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOTAP）、视黄酸、角鲨烯（油相）、聚山梨酯80（表面活性剂）和司盘85（共表面活性剂）组成的阳离子纳米乳包裹视黄酸（CNE-RA）递送系统。采用动态光散射和分光光度法对其理化性质进行表征。与单独使用抗原（卵清蛋白，OVA）相比，使用OVA与CNE-RA混合物免疫小鼠后，小鼠阴道灌洗液和小肠灌洗液中抗OVA分泌型免疫球蛋白A（sIgA）水平显著升高。本方案详细描述了CNE-RA的制备、表征及其佐剂效应评价方法。

总共制备了四种纳米乳剂配方，并通过粒径（图1）、ζ电位和包封效率进行表征，结果如表2所示。粒径集中在160–190 nm范围内，添加DOTAP后使纳米乳剂的ζ电位发生反转。在第三次免疫后2周检测血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平。纳米乳剂佐剂疫苗显著提高了血清中OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度（图2）。更重要的是，当OVA与CNE-RA联合使用作为佐剂时，阴道灌洗液和小肠灌洗液中特异性sIgA的水平显著升高（图3）。在ELISpot实验中，未发现显著的斑点信号。
<img alt="强度分布图；粒径分析；双峰；比较；纳米尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：粒径与分布。（A）NE-RA 的粒径与分布。（B）CNE-RA 的粒径与分布。d.nm 表示粒子的平均直径（单位：nm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血清中OVA特异性IgG水平；柱状图显示不同处理组的IgG滴度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平。 三次免疫完成后2周检测血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平。(A) IgG滴度的Log2值。(B) 450 nm处IgG1的光密度值。(C) 450 nm处IgG2a的光密度值。数据以均值±标准差表示（n=5），***：P&lt;0.001。图中柱状图上方直接标注各组与PBS组之间的比较结果，标注方式如下：ns：无显著性差异，#p&lt;0.05，###p&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同体液中sIgA水平比较；PBS、OVA、OVARA-NE、OVARA-CNE的图表；统计学数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66270/66270fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：OVA特异性sIgA。 阴道灌洗液、支气管肺泡灌洗液、鼻腔灌洗液和小肠灌洗液中的OVA特异性sIgA水平。(A) 阴道灌洗液，(B) 支气管肺泡灌洗液，(C) 鼻腔灌洗液，以及(D) 小肠灌洗液。数据以均值±标准差表示（n=5），ns：无显著性差异，*p&lt;0.05；***p&lt;0.001。各组与PBS组之间的差异比较直接显示在柱状图上方，并按以下方式标注：ns：无显著性差异，###p&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66270/66270fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td>角鲨烯</td>
			<td>司盘三油酸酯 85</td>
			<td>DOTAP</td>
			<td>RA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-RA</td>
			<td>1.5g</td>
			<td>0.15g</td>
			<td>0</td>
			<td>60mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNE-RA</td>
			<td>1.5g</td>
			<td>0.15g</td>
			<td>45mg</td>
			<td>60mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：纳米乳液油相的配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td>粒径平均值 (nm)</td>
			<td>多分散指数</td>
			<td>泽塔电位 (mV)</td>
			<td>包封率 (%)</td>
			<td>载药量 (mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-RA</td>
			<td>182.9±3.4</td>
			<td>0.18±0.02</td>
			<td>-23.0±0.2</td>
			<td>40</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNE-RA</td>
			<td>162.7±4.2</td>
			<td>0.16±0.01</td>
			<td>42.2±0.5</td>
			<td>40</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：纳米乳的理化特性。

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

阳离子纳米结构作为一种佐剂和抗原递送系统，可促进树突状细胞成熟、活性氧生成及抗原……

我们正在研发一种黏膜疫苗，该疫苗可产生类似于感染状态的免疫应答，有望预防感染并阻断传播。我们已开发出一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸递送系统。通过肌肉注射卵清蛋白进行免疫，可同时激发全身性和黏膜免疫应答。在今后的研究中，可使用肠道相关疾病的动物模型，进一步评估阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸在增强混合保护作用方面的效果及机制。通过在40摄氏度下搅拌，将0.15克吐温80溶解于28.2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，开始水相的制备。为制备油相配方，在40摄氏度下搅拌的同时，将司盘85、DOTAP和视黄酸溶解于角鲨烯中。接下来，以每分钟1毫升的速度将水相逐滴加入油相中，在1400转/分钟下搅拌，以制备初乳型油水乳液。使用高剪切乳化器在30,000转/分钟下预乳化混合物6分钟。将初乳型油水乳液在900巴压力下用高压均质机处理12个循环，以获得均匀的纳米乳液。将乳液收集到一个50毫升的烧瓶中，并使用带有0.2微米PES滤器的注射器进行过滤除菌。通过导管将烧瓶连接至施伦克线，旋转三通旋塞使系统与真空管相连。打开真空泵，在烧瓶中创建真空。然后，旋转三通旋塞，将系统连接至氩气管并用氩气填充。更换烧瓶的瓶塞，并用石蜡膜密封。用锡箔纸包裹烧瓶，并在 4 摄氏度下保存。打开动态光散射仪，等待 30 分钟，使激光光源稳定。用超纯水将纳米乳液稀释 50 倍，取 1 毫升样品加入相应的样品池中。在仪器上将温度设置为 25 摄氏度。选择水作为分散介质，一次性塑料皿作为测量池。加载样品并测量粒径。以每个样本三次重复测量的平均值作为结果。开始抗原包被时，用包被缓冲液将卵清蛋白稀释至每毫升5微克。在96孔ELISA板中，每孔加入100微升卵清蛋白溶液，于4摄氏度孵育过夜进行包被。第二天，用 PBST 洗涤各孔 5 次。每孔加入 250 微升含 1% BSA 的 PBST，37 摄氏度封闭 2 小时。为制备 1000 倍稀释的血清，首先用 0.5% BSA 的 PBST 将 20 微升血清稀释至 1 毫升。然后，取 25 微升血清等分试样，用 0.5%BSAPBST 稀释至 500 微升。将稀释 1000 倍的血清 200 微升加入包被板的第一排孔中。随后，除第一排孔外，向其余各孔加入 100 微升 0.5%BSAPBST。从第一行转移100微升至第二行，并混合10次。为建立不同浓度的血清用于IgG检测，弃去最后一行的100微升液体。接下来，用0.5% BSA-PBST稀释小鼠阴道灌洗液、支气管肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液，用含20%胎牛血清的PBST稀释小肠灌洗液。将酶标板在37摄氏度孵育1小时。用PBST洗涤5次。每孔加入100 µL HRP标记的山羊抗小鼠抗体，于37摄氏度孵育40分钟。用 PBST 洗涤反应孔五次后，每孔加入 100 微升 TMB ELISA 底物，于避光环境中孵育五分钟。加入 100 微升 450 纳米终止液以终止反应。使用酶标仪在 450 纳米处测定吸光度。将抗体滴度的阳性反应值定义为对照小鼠血清值的2.1倍进行计算。纳米乳剂佐剂疫苗显著提高了血清中卵清蛋白特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。当卵清蛋白与阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸联合使用时，阴道灌洗液和小肠灌洗液中的特异性IgA水平显著增强。

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

阳离子纳米乳液包封的视黄酸作为佐剂，促进 OVA 特异性全身和粘膜反应

在本视频中，我们演示了一种促进叶酸修饰的硫化铜纳米颗粒（CuS NPs）内化的技术。经叶酸功能化的CuS...

功能化纳米颗粒靶向卵巢癌：一种促进叶酸偶联纳米颗粒造影剂被卵巢癌细胞摄取的技术

本视频展示了纳米乳剂肿瘤疫苗的制备过程。通过低能量纳米乳化法，可制备出含有合成肽和佐剂的稳定油相储库，该方法在肿瘤免疫治疗中具有重要应用前景。...

纳米乳佐剂疫苗的制备

本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in...

快速 体内 评估佐剂在疫苗开发中诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力

我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联至内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该方案包括抗体的纯化、抗原的化学偶联、偶联物的纯化以及偶联效率的验证。...

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和...

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。该PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现强烈的细胞接触，同时提供高含量的抗原负载，从而增强递送系统对抗原呈递细胞的亲和力，并促进抗原的有效内化。...

提高抗原内化的颗粒稳定乳液对细胞亲和性

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

本研究介绍了一种将治疗剂递送至成年大鼠视网膜和视神经的方法。此外，还提出了一种独特的组织获取方法，可自上而下整体切取成年大鼠的视神经和视网膜。...

成人鼠眼部药物递送与先进组织获取

在感染过程中，一个关键步骤是病原体与宿主细胞之间的黏附。大多数情况下，这种黏附过程发生在流动液体所产生的机械应力环境中。本文介绍一种将剪切应力作为重要参数用于研究细菌黏附的技术。...

在细菌黏附研究中引入剪切应力

了解阳离子纳米乳液包封视黄酸作为疫苗佐剂的方法，用于增强OVA特异性全身和粘膜免疫反应。该技术可提升sIgA产生，为肠道疾病疫苗开发提供新策略。

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

探索更多视频