Name: 通过一种新颖的注射部位修复技术促进小鼠模型中的重复颈内注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 了解一种用于小鼠模型的颈内动脉注射部位修复技术，该技术可实现脑肿瘤治疗药物的重复递送，同时预防脑缺血并确保药物在肿瘤内的有效分布。

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本研究获得了美国国家癌症研究所（R01CA115729、R01CA214749 和 1P50 CA127001）的资助，以及以下机构和个人对德克萨斯大学MD安德森癌症中心“登月计划”™的慷慨捐助：Broach脑癌研究基金会、Elias家族脑肿瘤研究基金、Priscilla Hiley癌症研究基金、Bauman家族Curefest脑癌研究基金、卢传伟基金、Sweet家族脑癌研究基金、Ira Schneider纪念癌症研究基金会、Jim &amp;#38; Pam Harris基金、Gene Pennebaker脑癌研究基金、Sorenson脑肿瘤研究基金、Brian McCulloch纪念基金、TLC基金会（源于爱心）以及Mary Harris Pappas胶质母细胞瘤研究捐赠基金，以上资助均授予F.F.L.。

以下所述所有步骤均符合我们的实验方案，该方案遵循并经德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准的指南。
1. 手术操作前的手术台和小鼠准备
<ol>
	<li>手术台的准备和&#160;用于手术操作的小鼠 (参考 图1A，B)
	<ol>
		<li>将解剖显微镜和光源放置在带有主动废气清除系统的异氟烷麻醉机前方，或置于下吸式工作台面上。将电热垫置于解剖显微镜底座上（若底座为实心且可传导热量，则优先放置于显微镜下方），并覆盖无菌手术单。 
		注意：所有手术器械和手术单应在使用前通过高压灭菌法进行灭菌，所有一次性用品应为无菌且单独包装。在整个准备和操作过程中应佩戴无菌手套，并在必要时及时更换以维持无菌状态。</li>
		<li>准备培养基（4-5&#34; 长 x 2&#34; 使用乙烯基实验室胶带在手术单上标记出宽）区域。剪取一块1.5英寸×1.5英寸的纱布，紧密卷起，并将卷好的纱布置于一段3英寸长的乙烯基胶带下方 &#34;头部&#34; 将床的一端抬高形成枕头（使用枕头抬高头部可使颈部腹侧区域更充分地伸展）。</li>
		<li>沿手术床两侧铺设4英寸长的外科胶带（置于乙烯基胶带上）。[若使用异氟烷，将连接有配重（或胶带）的麻醉鼻罩置于床头附近；待小鼠麻醉并固定后，再调整其位置。] 参见 图1A，B.</li>
		<li>使用持针器或粗齿镊子，从棉签上撕下小块棉花，并将其搓成直径为0.5至1毫米的棉球（每只小鼠准备8–10个棉球）。将棉球置于手术单上，靠近床头位置备用。</li>
		<li>使用无菌器械将6-0缝合线剪成1厘米长的片段（每只小鼠3-4段）。将准备好的缝线段置于无菌手术单上。准备1 mL注射器用于注射布托啡诺或其他合适的镇痛剂（需符合机构动物护理与使用委员会[IACUC]方案的批准）。在将手术器械放入无菌区域之前，须根据IACUC标准对所有手术工具进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作前小鼠的准备（参见 图1C- F)
	<ol>
		<li>麻醉一只小鼠，方法需符合IACUC对大型存活手术的批准要求（可使用1%-4%异氟烷，根据小鼠个体敏感性调整浓度；或使用氯胺酮10 mg/mL与赛拉嗪1 mg/mL的混合溶液，按100-200 mg/kg体重剂量给予）。必要时剪除或脱去局部毛发。于皮下注射0.5-1.0 mg/kg缓释型丁丙诺啡（buprenorphine ER），给药时间在手术前30分钟&#160;手术开始之前。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠置于颈下垫有软枕的位置（图1C）。使用麻醉面罩时，枕头有助于伸展和支撑颈部。若使用氯胺酮/赛拉嗪混合剂，需将一个带重物的牙撑或类似工具置于门齿后方的口腔内，以倾斜头部并伸展颈部。</li>
		<li>使用先前沿手术床两侧放置的手术胶带固定前肢（图1D）。调整显微镜下小鼠的位置，使其颈部腹面进入视野，并调节放大倍数以便清晰观察手术区域（图1E). 
		注意：解剖显微镜的放大倍数应由手术者根据每一步操作的舒适度进行调整。</li>
		<li>使用无菌棉签涂抹人工泪液。通过交替使用碘伏或氯己定以及酒精对手术部位进行消毒，每种消毒剂各以环形方式擦拭三次。图1F).</li>
		<li>通过轻捏小鼠脚趾确认其无腿部回缩反应，以判断麻醉深度。监测呼吸频率，确保小鼠无喘息现象，因使用异氟烷时出现喘息提示麻醉过深。必要时调整氧气和异氟烷流速，以达到适宜的麻醉深度和均匀的呼吸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术步骤（图2、图3、图4、图5、图6 和 图7）
<ol>
	<li>初次切口与分离
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀片或类似器械，紧靠胸骨柄（胸骨前端突出的隆起）头侧开始，沿气管方向做一条长约1 cm 的纵向中线切口，操作需遵循用户批准的 IACUC 指南（图2A）。</li>
		<li>将闭合的剪刀尖端插入切口，轻轻张开以进行钝性分离皮下结缔组织，分开两侧唾液腺。用精细镊子将右侧唾液腺轻柔地拉出切口，使其置于无菌准备的皮肤表面，或使用钝性钩状牵开器将唾液腺向侧方牵拉（图2B、C）。若外露的腺体表面干燥或发黏，应用无菌生理盐水润湿。</li>
		<li>继续钝性分离结缔组织，直至暴露出胸锁乳突肌和二腹肌（图2D）。 
		注：由气管/胸骨舌骨肌（sh）、胸锁乳突肌（sm）和二腹肌（dg，尾侧腹）构成的肌性三角区域，将在本方案中用于定位右侧颈总动脉（CCA）及其分叉处。通常，较小的肩胛舌骨肌（oh）也可横跨于 CCA 上方（图2D）；然而，该肌肉大小存在个体差异，在幼龄或体型较小的小鼠中，肩胛舌骨肌可能完全缺失，此情况并不罕见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈总动脉（CCA）分离
	<ol>
		<li>使用弯头镊子，通过张开镊尖继续小心分离肌性三角尾端附近的结缔组织，以暴露颈总动脉、颈静脉和迷走神经。 
		注：颈总动脉是紧邻气管的最大血管，通常可在肌性三角基底部轻易识别（图2E，箭头所示）。操作精细镊子时需格外小心，避免损伤血管壁，因镊尖可能划破血管导致大量甚至致命性出血。</li>
		<li>继续仔细分离颈总动脉周围从肌性三角基底部至肩胛舌骨肌段的结缔组织。根据需要，使用小型无菌棉球控制轻微出血，并吸除唾液腺分泌的液体。</li>
		<li>小心分离结缔组织，将 CCA 与迷走神经分开。特别注意尽量减少对迷走神经的触碰和损伤，该神经为紧邻 CCA 的粗大白色神经束，易于辨认（图2F）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈总动脉（CCA）准备
	<ol>
		<li>当 CCA 从胸锁乳突肌完全游离后，并在可见情况下延伸至肩胛舌骨肌处，将一段长约 1 cm 的 6-0 缝线放置于小鼠胸骨无菌准备的皮肤上（便于取用），然后用弯头镊子从 CCA 下方穿过（注意将 CCA 与迷走神经和颈静脉分离）&#160;（图3A）。&#160;若肩胛舌骨肌不存在，则需充分清理 CCA 周围区域，以便在预定注射部位的头侧和尾侧放置缝线，并顺利插入针头。</li>
		<li>左手持精细镊子，将缝线传递至弯头镊子，夹住缝线末端附近，用弯头镊子轻柔地将约一半长度的缝线穿过 CCA 下方（图3B）。</li>
		<li>重复此过程，使用第二根缝线，与第一根平行放置（图3C）。</li>
		<li>将每根缝线在 CCA 周围 loosely 打结，但不要拉紧结扎或阻断血流（图3D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈外动脉（ECA）分离与准备
	<ol>
		<li>使用弯头镊子，小心清除肌性三角头端、肩胛舌骨肌头侧的结缔组织，以定位 CCA 及其分叉为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的位置（图4A）。 
		注：ECA 向中线方向斜行，位置略浅表，而 ICA 向外侧斜行并深入颈部。需特别注意保护在分叉上方跨越 ICA 的舌下神经（HN），避免损伤。</li>
		<li>仔细清除分叉处附近 ECA 四周的结缔组织。当 ECA 周围足够清晰后，将一段缝线置于小鼠胸骨无菌准备的皮肤上，用弯头镊子从 ECA 下方穿过。左手持精细镊子，将缝线送入弯头镊子，在 ICA 与 ECA 之间的间隙中穿过，并轻柔地将约一半长度的缝线拉出（图4B）。将缝线 loosely 缠绕于 ECA 周围，但不要打结拉紧。 
		注：必须清除足够多的 ECA 周围结缔组织，以确保使用弯头镊子夹取缝线时不会连带夹住动脉周围的结缔组织，否则在回收缝线时可能造成动脉损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>针头与注射器准备 
	注：此步骤中，注射可使用直针，使注射器可依靠并稳定于小鼠体表（图5A）；也可使用针尖附近弯曲的针头，使注射器可像铅笔一样握持，手部支撑于手术台面（图5B）。两种技术均有效，选择取决于个人偏好。
	<ol>
		<li>准备弯曲针头时，手持 33 G、½ 英寸针头，使斜面朝上，用无菌持针器夹住针尖（图5C），将针头向斜面方向弯曲约 30–40°（图5D）。</li>
		<li>用注射器吸取所需注射溶液的适当体积（若溶液未经针头抽吸装填注射器，则需考虑针头腔隙体积）。安装针头并排除所有气泡，确保溶液弯月面可见于针头斜面处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈动脉内注射
	<ol>
		<li>收紧围绕 ECA 的缝线结扎。接着，将 CCA 上的下位缝线尽可能向胸锁乳突肌方向滑动并拉紧打结。确保 CCA 上的上位缝线在注射完成前保持松弛。在术区边缘放置无菌棉球，以吸收注射过程中分泌的液体和血液。</li>
		<li>右手持注射器，左手持精细镊子，将针头移至 CCA 下位缝线上方的动脉处。用精细镊子轻柔地将下位缝线的游离端向尾侧牵拉，使 CCA 承受轻微张力（图6A）。</li>
		<li>将针头插入 CCA，略超过斜面后缓慢释放缝线张力（图6B）。 
		注：动脉血流丰富，插入针头时很可能有血液流入手术腔。但一旦针头穿过斜面，动脉会在针头周围形成密封，出血即停止。若针头在位时持续出血，提示针头未充分进入动脉（斜面间隙允许血液流出）或已穿透动脉后壁。此时必须保持针头极度稳定，以防撕裂动脉或针头滑脱。需持续监测发生出血事件的动物，若出血显著（如动物出现肤色改变、发绀、触感变冷，或动物使用方案中描述的其他人道终点），应立即实施人道终点处理。</li>
		<li>用左手推动注射器活塞，缓慢注射溶液（图5B，注射 100 µL 溶液不少于 15 秒）。注射完成后不要立即拔出针头。为防止反流，左手持精细镊子夹住 CCA 上位缝线的结（仍为松结），提起以使动脉扭曲闭合（图6C）。</li>
		<li>拔出针头，将注射器放置一旁，右手取弯头镊子。保持动脉扭曲状态，拉紧 CCA 上位缝线的结扎（图6D）。 
		注：至此，手术腔内应无进一步出血。完成此步骤后，可选择以下两种操作之一，详见步骤 2.7 和 2.8。若需结扎 CCA，请执行步骤 2.7；若需修复注射部位并恢复血流，请执行步骤 2.8 中的修改方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈总动脉（CCA）结扎
	<ol>
		<li>对于无需恢复 CCA 血流的情况，保持动脉结扎状态，将两根缝线均保留在 CCA 上并拉紧。剪除缝线末端，并确认缝线结已完全收紧。</li>
		<li>继续执行步骤 2.9 中描述的关闭切口与镇痛程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>替代 CCA 结扎方案——注射部位修复与血流恢复
	<ol>
		<li>使用无菌棉球吸除手术腔内残留血液。定位 CCA 上的注射部位（图7A），确定所需缝合针数。彻底冲洗注射部位及 CCA 隔离段的管腔，清除凝固血液。</li>
		<li>使用弯头镊子夹住 9-0 缝线针体靠近针尾部分。同时用精细镊子从对侧支撑动脉，将单针缝合穿过动脉壁，穿刺点位于注射部位外侧约 1–1.5 mm 处，垂直于动脉方向。用精细镊子固定动脉，张开注射部位，分别穿过右侧和左侧壁。或者，用精细镊子轻压动脉两侧使其贴合，单次进针穿过动脉双侧壁。 
		注：无论采用何种技术，均需注意针头和缝线不得穿透动脉内壁后侧，否则结扎时将闭塞管腔。</li>
		<li>使用精细镊子与弯头镊子打结，以器械打结法完成外科结，至少打四个结（图7B）。通常，使用单个单纯间断缝合即可闭合 33 G 针头造成的注射部位。</li>
		<li>为恢复血流，使用精细镊子先解开并移除 ECA 周围的缝线，再移除 CCA 上位缝线（图7C、D）。随后缓慢松开 CCA 下位缝线，但暂不完全解开。确认注射部位已充分闭合，能够在恢复血压和血流时防止严重出血（图7D）。 
		&#8203;注：若注射部位出现严重出血，可迅速重新拉紧 CCA 下位缝线，并根据需要调整或重新缝合注射部位。</li>
		<li>移除 CCA 上、下位缝线（图7E）。进入步骤 2.9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭切口与镇痛
	<ol>
		<li>将唾液腺复位至术腔内，使用无菌缝合包以三个单纯间断缝合关闭切口。移除手术胶带固定，将小鼠置于加热垫上恢复麻醉。 
		注：后续镇痛药物剂量应根据用户批准的 IACUC 协议中规定的频率和剂量给予。建议两次注射之间间隔一周愈合期。若需重复注射，首次注射后可采用注射部位修复方案，后续注射可沿用相同手术流程。后续注射应注入修复部位头侧的 CCA，因在同一部位反复缝合可能导致瘢痕形成和血栓。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Common Carotid Artery Repair After Injection in a Mouse Model 

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</ol>

作者无相关披露/利益冲突。

近年来，颈内动脉注射被越来越多地用于向脑肿瘤递送治疗药物。因此，建立能够模拟人类颈内动脉注射的小鼠模型，对研究具有重要意义。以往的小鼠颈内动脉注射通常在注射后结扎动脉，这限制了对同一条动脉进行多次注射的可能11,12。此外，在某些缺乏完整大脑Willis环的小鼠品系中，颈动脉闭塞可能导致脑缺血13。我们开发了一种修复注射后颈动脉的方法，以克服既往技术的局限性。对注射部位进行修复可恢复动脉血流，降低脑缺血风险，并便于后续对同侧颈内动脉进行重复注射。
多个对成功至关重要的步骤需要谨慎操作手术器械或组织，包括：将针头正确插入动脉管腔，以避免颈动脉内注射时发生出血；在插入针头前仔细分离注射部位的结缔组织；注射前彻底清除注射器和针头内的所有团块及气泡；以及正确闭合注射部位，防止修复过程中动脉管腔闭合。为防止针头插入后出血，应确保针头插入动脉时超过斜面部分，使针杆周围形成密封。为避免刺破动脉后壁，应以较小的角度进针，并轻微向后 rocking（晃动）注射器和针头，使针尖远离动脉后壁。若注射过程中溶液外漏，提示针头仅插入了动脉周围结缔组织；在注射前仔细清除注射部位多余的结缔组织可避免此问题。
关于缝合线的选择和缝合技术，如果初始注射使用了33 G针头，并且针头干净地刺入动脉，则使用9-0缝合线进行一次简单的缝合即可修复动脉。如果注射时使用了较大的针头（如30 G等），或在插入针头时发生撕裂（例如针头偏离中心，或由于小鼠呼吸导致动脉移动），则会形成稍大的穿刺孔，需要进行修复。通常采用两次简单缝合或“8”字缝合即可修复此类较大的穿孔。在这两种技术之间进行选择，取决于外科医生在此情况下的个人偏好。需要注意的是，当注射部位的穿孔明显大于上述情况时，目前尚未评估此类修复技术的效果。如果注射部位的撕裂横向扩展（形成宽度超过动脉周径三分之一的较大孔洞），采用此种方法修复可能导致动脉收缩，并增加血栓形成的风险。
在拆除缝线时，如果修复后的注射部位出现出血，可能是由于正常血流恢复后修复部位被拉伸所致；此时可用无菌棉球轻轻覆盖修复后的注射部位，并施加轻压30秒以纠正。另一种情况是，修复后的注射部位出血但无可见血流，且近端动脉扩张，提示在修复过程中缝合针穿过了动脉后壁。此时应在修复过程中轻轻打开注射部位的边缘，以较小的角度将缝合针穿过动脉，并在打结前目视确认缝合线未穿过动脉后壁。
通过采取这些措施，注射部位修复方法在不同遗传背景或年龄的动物群体中均具有精确性和可重复性。根据我们的经验，三位不同的外科医生进行该操作的成功率均达到100%。只要具备足够的经验并严格遵循所提供的操作规程，我们预计其他外科医生实施该操作也不会遇到困难。经过练习，熟练的外科医生可在15至20分钟内完成整个操作。如果实验条件允许，也可保留头臂动脉上段和下段的缝线，不修复注射部位，从而进一步缩短每只动物的操作时间。然而，如上所述，不同小鼠品系在脑血管解剖结构上存在差异，因此在开始实验前，必须确认所用小鼠品系能够耐受这种不修复注射部位的操作。
由于这是一项外科手术，必须考虑小鼠的恢复情况。不同小鼠品系在应激耐受性和伤口愈合方面存在差异，这是需要重点考虑的因素。此外，手术部位的炎症反应和瘢痕组织形成可能会延长多次手术后的恢复时间。我们已成功实施间隔7天的多次注射，但如果需要更频繁的注射，则应在拟使用的特定小鼠品系中进行仔细评估。对颈总动脉（CCA）的粗暴操作和施加压力（如在分离、结扎与拆除缝线以及注射过程中）可能损伤并削弱动脉壁，导致重复注射时发生撕裂。因此，应尽量减少对CCA及其分叉周围支持性结缔组织的解剖操作，并避免对动脉施加过度张力。
我们的结果表明，在该特定模型中，CCA结扎或注射后通过修复恢复血流，在注入的BM-hMSCs向颅内肿瘤归巢的总体频率和分布方面并无差异。尽管这可能因小鼠品系不同而有所变化，但采用注射部位修复的优势在于可恢复注入动脉的血流，从而允许对同一条动脉进行后续注射，并且更重要的是，该方法更接近人类患者中的颈内动脉注射。选择结扎还是修复注入动脉，取决于实验类型和所使用的小鼠模型。如果需要进行第二次注射，或小鼠模型不具备完整的Willis环，则应采用注射部位修复。在小鼠模型中实现CCA重复注射的能力有助于开展更多的实验操作。例如，若需在不同时间点测试某种潜在治疗药物的多个剂量，修复注入动脉对于实施后续注射至关重要。该方法也适用于需要在不同时间点注射多种治疗药物组合的实验。通过修复注入动脉而提高颈内动脉注射的灵活性，可增强小鼠脑肿瘤模型的转化应用价值。

由于血脑屏障（BBB）和血肿瘤屏障（BTB）的不可渗透性，将治疗药物递送至脑肿瘤具有挑战性。为绕过BBB，可通过使用Ommaya储液器-导管、低流速微灌注实现对流增强给药，或将药物直接注射至切除腔或邻近组织来实现瘤内给药1。然而，这些方法所能到达的肿瘤组织总体积有限2,3,4。既往已采用动脉内注射将治疗剂递送至脑肿瘤，以期覆盖更大范围的肿瘤组织5,6,7,8，近年来，随着动脉内递送技术的进步以及新型治疗药物的发展，该方法在脑肿瘤治疗中的优势已得到证实7,9。这些进展包括微导管的开发、结合先进影像技术的血管内选择性动脉内（ESIA）给药、利用渗透剂破坏BBB和BTB，以及靶向生物疗法的研发。因此，为开展通过动脉内注射给药的新型治疗药物的临床前测试，必须建立适当的转化研究模型9,10。
在脑肿瘤的小鼠模型中，通过腹腔或静脉（尾静脉）给药的治疗剂分别需经过肝脏或心脏和肺部，然后分布至全身，包括脑部。这些首过效应可能在药物到达脑部之前将其截留或清除，或使其稀释，并可能在脑内达到治疗剂量之前就已出现剂量限制性毒性。相比之下，颈内动脉注射可通过绕过首过代谢，限制脱靶递送，从而在全身循环前实现对脑部的靶向递送。尽管小鼠颈内动脉注射操作更为耗时费力，但该技术具有更高的特异性和可重复性，因而可减少完成实验所需的动物数量11,12。
通常，在先前描述的小鼠颈内动脉注射方法中，注射后需结扎颈总动脉，脑部血流则通过对侧颈动脉以及经由Willis环的后循环脑血管系统来维持11,12。该方法存在固有局限性，仅允许对颈内动脉或颈外动脉进行最多一次的注射。此外，实验中使用颈动脉结扎方法时，所用小鼠品系必须具备完整的Willis环，以防止因动脉结扎导致脑缺血13。研究还表明，颈动脉阻断会降低脑血流量，并限制注射颗粒物的分布范围14。另外，小鼠在注射后进行颈动脉阻断的操作，并不能模拟人类患者中的颈内动脉注射情况。
本课题组此前已采用颈内动脉注射法成功将间充质干细胞递送至大脑10,15,16,17,18,19。本文详细描述了该颈内动脉注射方法，并介绍了一种我们所改进的技术：在不闭塞动脉的前提下修复注射部位，从而避免了注射后颈动脉结扎所带来的局限性。在该方法中，通过在预定注射部位的两端各放置一根缝线来准备颈总动脉（CCA），并将下方的缝线（位于注射部位远端）收紧。随后使用另一根缝线封闭颈外动脉（ECA）。将针头插入颈总动脉，并将治疗物质注入颈内动脉（ICA）。之后收紧颈总动脉上方的缝线，以防止血液从颈内动脉反流。在此步骤之后，可选择对注射后的颈总动脉进行结扎或修复。若选择结扎颈总动脉，则收紧缝线并保留其位置；若选择修复注射部位，则在完成修复后移除缝线，恢复血流。以下将详细介绍这两种可选操作步骤。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器（低死腔）</td><td>Air-tite Products Co.</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>26 G；1/2&quot; 针头</td><td>Air-tite Products Co.</td><td>N2612</td><td></td></tr><tr><td>33 G；1/2&quot; 针头</td><td>JBP, Air-tite Products Co.</td><td>JBP3313B</td><td></td></tr><tr><td>3 cm 培养皿</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>3M durapore 外科胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-071-152</td><td></td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>9-0 带针显微外科缝合线&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12052-09</td><td></td></tr><tr><td>重大手术用镇痛剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工泪液/眼用软膏</td><td>Covetrus</td><td>8897</td><td></td></tr><tr><td>珠式灭菌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-341</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘/氯己定</td><td>McKesson, Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>钝头牵开钩</td><td>Fine Science Tools</td><td>17022-13</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss Microscopy, LLC</td><td>491903-0010-000</td><td></td></tr><tr><td>电热垫</td><td>Insource, Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>超细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子 — Dumont #5 镊子，微钝尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子 — Dumont #5/45 角度尖端镊子，微钝尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器（或氯胺酮/赛拉嗪混合物）</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1231</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Laxco, Fisher Scientific</td><td>AMPSILED21</td><td></td></tr><tr><td>小鼠麻醉鼻罩</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>XENO- M</td><td></td></tr><tr><td>持针器&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Texwipe, Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>18-366-472</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布垫</td><td>Covidien, Fisher Scientific</td><td>22-037-907</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水（0.9%）</td><td>KD Medical, Fisher Scientific</td><td>50-103-1363</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6666</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术台/下送风工作台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌缝合包（适用于小鼠伤口闭合的任意合适直径）&amp;nbsp;</td><td>Ethicon, Fisher Scientific</td><td>50-209-2811</td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙烯基实验室胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901</td><td></td></tr></tbody></table>

通过一种新型注射位点修复技术实现小鼠模型颈动脉重复注射

Facilitating Repeat Intracarotid Injections in Mouse Models by a Novel Injection Site Repair Technique

鉴于近年来在神经肿瘤学领域利用血管内选择性动脉内给药方法递送新型抗肿瘤治疗药物方面取得的进展，迫切需要建立可在小鼠模型中进行颈内动脉注射的方法，包括注射后修复小鼠颈动脉以实现后续多次注射的技术。我们建立了一种在小鼠模型中向颈内动脉（ICA）递送治疗药物的颈内动脉注射方法，并提供了两种可选的操作流程。
注射时，在结扎颈外动脉（ECA）后，将针头插入颈总动脉（CCA），并将治疗物质注入颈内动脉（ICA）。注射完成后，可结扎颈总动脉（CCA），但该操作将颈动脉内注射的次数限制为一次。本文所述的替代方法包含一项改进：在颈动脉内注射后，对颈总动脉（CCA）的注射部位进行修复，从而恢复颈总动脉内的血流，避免在某些小鼠模型中出现脑缺血的并发症。
我们还比较了经颈内动脉注射骨髓来源的人间充质干细胞（BM-hMSCs）至颅内肿瘤时，在注射后是否进行注射部位修复的递送效果。两种方法在BM-hMSCs的递送效率上无显著差异。我们的结果表明，颈总动脉（CCA）注射部位的修复允许通过同一条动脉进行重复注射，且不影响注射物质的递送与分布，从而建立了一个更具灵活性、更接近人类颈内动脉注射情况的实验模型。

既往研究报道，通过颈内动脉注射递送的骨髓来源人源间充质干细胞（BM-hMSCs）可成功归巢至小鼠颅内胶质瘤19。我们采用该模型，在携带胶质瘤的小鼠中，比较经颈内动脉注射BM-hMSCs后，行颈总动脉结扎与颈总动脉修复并恢复血流的两种处理方式的效果。将U87胶质瘤细胞植入无胸腺裸鼠体内，随后注射表达GFP标记的BM-hMSCs，并分别进行颈总动脉结扎或颈总动脉修复以恢复血流。3天后处死小鼠，取脑组织，固定后进行免疫组织化学染色以检测GFP，计数GFP阳性细胞（图8A-D）。
通过同一标本中两张不同切片（切片间距 >75 µm）内肿瘤边界内的GFP阳性细胞总数，评估GFP标记的骨髓来源人源间充质干细胞（GFP-BM-hMSCs）向颅内胶质瘤的整体归巢情况。采用非配对t检验对均值进行比较，结果提示两种手术方法间的平均归巢细胞数无显著差异（P = 0.6858）（图8E）。通过计数肿瘤内10个高倍视野中的GFP阳性细胞，评估GFP-BM-hMSCs在肿瘤内的分布情况。高倍视野中细胞数量的增加可能提示由于手术方法的差异导致细胞在肿瘤内分布发生变化。采用Wilcoxon符号秩检验对中位数进行比较，结果显示颈总动脉结扎组与颈总动脉修复组之间，高倍视野中GFP阳性细胞的中位数计数无显著差异（图8F）。
<img alt="在显微镜下对啮齿类动物进行显微外科手术设置；详细的外科手术过程；实验研究步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：手术台及小鼠术前准备。（A,B）手术床（标签：A. 乙烯基胶带构成的床面，B. 用于前肢固定的手术胶带，C. 枕垫，D. 配重，E. 麻醉鼻罩，F. 钝头牵开钩，G. 浸泡于70%乙醇中的1 cm缝线，H. 精细镊子，I. 角度尖端镊子，J. 窄剪刀，K. 无菌棉球）。（C,D）小鼠体位摆放。（E,F）手术区域及手术部位的消毒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显示在啮齿动物解剖中迷走神经分离与识别的手术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：注射部位结构的切开与暴露。（A）正中切口。（B,C）右侧腮腺的牵拉。（D）由气管/胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和二腹肌构成的肌性三角，可见肩胛舌骨肌。（E）颈总动脉，箭头所示。（F）迷走神经与颈总动脉，箭头所示。缩写：sh = 气管/胸骨舌骨肌；sm = 胸锁乳突肌；dg = 二腹肌；oh = 肩胛舌骨肌；CCA = 颈总动脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用棉球、缝合步骤、啮齿类动物模型、实验方法的手术流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颈总动脉注射前准备。（A）斜尖镊子从颈总动脉下方穿过。（B）使用斜尖镊子将缝线半程穿过颈总动脉下方。（C）第二根缝线同样半程穿过颈总动脉下方。（D）在颈总动脉周围打松结固定。缩写：CCA = Common carotid artery（颈总动脉）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示颈动脉分支的外科解剖示意图，已标注；医学操作插图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：颈外动脉的分离与准备。（A）颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。（B）缝合线从颈外动脉下方穿入一半。缩写：CCA 颈总动脉；ECA = 颈外动脉；ICA = 颈内动脉。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用精密工具在大鼠模型上进行神经外科手术；科学研究的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：针头和注射器的准备。 （A）使用直针注射，注射器靠在小鼠体壁上。（B）使用弯针注射，操作者的手放置在手术台上。（C,D）弯针的制备过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术缝合技术与结扎过程；医疗程序，高细节照片序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：颈内动脉注射。（A）上方缝线松弛，下方缝线在颈总动脉（CCA）上收紧，针头置于下方缝线上方。（B）针头插入至刚好超过斜面，动脉在针头周围封闭。（C）提起上方缝线使动脉向上扭曲，防止反流。（D）在颈总动脉（CCA）上收紧上方缝线。缩写：CCA = 颈总动脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="缝合神经修复，显微图像 A-E，展示手术技术与组织相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：注射部位修复及血流恢复。（A）箭头所示为注射部位。（B）使用外科结关闭注射部位，至少打四个结扣。（C,D）在完成注射部位修复后，颈总动脉（CCA）上下缝线松弛；缝线松弛后未见出血。（E）确认注射部位已充分修复后，移除缝线。缩写：CCA = Common carotid artery。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CCA 修复与结扎：GFP-hMSC 归巢、荧光显微镜、定量分析、柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66303/66303fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：经颈总动脉注射 GFP-BM-hMSCs 后，比较在 CCA 结扎或 CCA 修复并恢复血流后向颅内胶质瘤的归巢情况。携带肿瘤的小鼠脑组织切片使用抗 GFP 一抗和 Alexa Fluor 488 二抗染色以标记 GFP-BM-hMSCs（绿色）。细胞核用 Hoechst 33342 染色（蓝色）。代表性低倍视野显示肿瘤整体归巢情况，高倍视野显示经（A,C）CCA 修复或（B,D）CCA 结扎后 GFP 阳性细胞的分布。（E）通过在两张不同切片中计数肿瘤边界内 GFP 阳性细胞的总数，评估 GFP-BM-hMSCs 向肿瘤的整体归巢情况，并采用 t 检验比较均值。两种手术方式之间在整体归巢方面未观察到显著差异（P = 0.6858）。（F）通过计数肿瘤内 10 个高倍视野中 GFP 阳性细胞的数量，评估 GFP-BM-hMSCs 在肿瘤内的分布情况。采用 Wilcoxon 符号秩检验比较中位数，结果显示无论采用何种手术方式，个体间均无显著差异（P = 0.1914, 0.5000, 0.1641, 0.9512, 0.8828, 0.2207）。缩写：GFP = green fluorescent protein；GFP-BM-hMSCs = GFP 标记的骨髓来源人源间充质干细胞；CCA = 颈总动脉。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66303/66303fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

在小鼠模型中，颈内动脉注射后对其进行修复可恢复动脉血流，且不会对注射物质的分布产生负面影响。注射部位的修复有利于通过同一条动脉进行后续注射，并可防止在缺乏完整威尔氏环的小鼠品系中发生脑缺血。

鉴于神经肿瘤学领域在利用血管内选择性动脉内给药方法递送新型抗肿瘤治疗药物方面取得的最新进展，该……

我们的研究致力于开发针对胶质母细胞瘤的新型生物疗法，包括溶瘤病毒和微小RNA等制剂。脑肿瘤治疗失败的一个主要原因是药物无法有效递送至脑内肿瘤部位。因此，我们专注于开发新的递送方法，包括间充质干细胞和外泌体，这些载体可通过动脉内注射方式进行递送。溶瘤病毒以及免疫细胞疗法（如CAR-T细胞和NK细胞）在体外实验中已展现出巨大潜力，但在体内将这些疗法有效递送至肿瘤仍面临挑战。我们已建立了一个临床血管内神经外科肿瘤学项目，并结合基础与转化研究方法，专注于脑肿瘤治疗药物的动脉内递送。其中最大的挑战之一是如何将治疗手段有效地递送至脑部肿瘤。某些药物已采用瘤内递送方式，但由于无法重复注射且药物可能无法到达肿瘤的所有区域，其应用效果有限。我们正通过动脉内给药的方式来解决这一问题。既往通过颈动脉注射的方法常需结扎注射侧动脉，这在一些缺乏完整威尔利斯环的小鼠模型中会导致缺血性脑卒中。我们开发了一种修复注射部位的方法，可防止此问题的发生，并能够在同一动脉内进行后续的重复注射。对于脑肿瘤，我们将继续开发间充质干细胞作为溶瘤病毒和外泌体的递送载体，以递送包括微小RNA在内的治疗性 cargo。需要注意的是，对于这两种制剂，动脉内注射是实现高效递送和治疗获益的关键。

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科研

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