Name: 小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习双光子活体显微镜技术在小鼠胶质母细胞瘤模型中的应用，利用荧光标记的氧化铁纳米颗粒实时观察药物穿越血脑屏障的分布机制，为优化脑部肿瘤治疗策略提供重要的影像学方法。

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我们感谢斯坦福大学吴蔡神经科学显微技术服务中心、斯坦福体内成像创新中心（SCi3）——小型动物成像中心、美国国立卫生研究院S10共享仪器基金（S10RR026917-01，项目负责人：Michael Moseley博士）以及斯坦福Porter Drive前临床成像设施为本项目提供的设备与基础设施支持。本研究工作得到了美国国家儿童健康与人类发育研究所基金（项目编号：R01HD103638）的资助。我们感谢斯坦福大学Schnitzer研究组、加州大学圣克鲁兹分校Zuo实验室以及波士顿大学波士顿光子中心神经血管成像实验室在双光子成像和颅窗模型方面提供的富有启发性的学术讨论。

Real-Time Tracking of Nanoparticles in Brain Tumors Using 2P-IVM in Mice

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们提出了一种用于实时 体内 通过颅窗使用双光子体内显微成像（2P-IVM）追踪纳米颗粒，以评估荧光标记的氧化铁纳米颗粒向肿瘤的递送情况。该手术技术要求操作者具备稳定的手法和高级的实验外科技能。建议在开展活体动物实验前，先利用尸体标本或模拟模型进行练习。作为替代方案，Hoeferlin 等人采用机器人钻孔系统，以减少热损伤，降低手术技术的变异性，并实现手术操作的标准化22.
窗口的尺寸是另一个关键参数。较大的窗口能够实现对肿瘤更大区域的双光子体内显微成像（2P-IVM）。文献中报道的窗口尺寸范围为3–7 mm23。然而，较大的窗口无法适应脑组织的曲率，可能导致局部压力升高24。为克服这一限制，可采用所谓的&#34;玻璃颅骨&#34;替代方案25。与传统的平面玻璃窗口相比，该方法使用与脑曲率相匹配的曲面玻璃，从而在减少皮层局部压力的同时，实现更大尺寸的成像窗口。此类曲面玻璃目前尚无商业化产品，且在2P-IVM中的应用有限，因为其曲面结构会引起反射伪影，限制可成像的窗口区域。另一种替代方案是基于硅材料的窗口24。一方面，该方法在窗口的尺寸和形状设计上具有更高的灵活性；此外，其在窗口失效率和炎症发生率方面与传统玻璃窗口相当。另一方面，基于聚合物材料的窗口在双光子成像质量上的衰减速度较玻璃窗口更快，因此不适用于长期实验26。减薄颅骨窗口是另一种可选方案。尽管其侵入性低于传统的玻璃窗口，但无法采用本文所述的相同技术进行胶质母细胞瘤（GBM）细胞的植入。此外，难以实现颅骨厚度的一致性，从而可能在2P-IVM中引入显著的成像伪影27。
在规划研究时间线时，细胞系及植入的胶质母细胞瘤（GBM）细胞数量是其他重要的考虑因素。C6 大鼠胶质瘤细胞系是 GBM 研究中最广泛使用的细胞系之一。在大鼠和小鼠中，颅内植入的细胞数量通常在 5 × 104 至 5 × 106 之间27,28,29,30,31。一般而言，植入的细胞数量越多，肿瘤生长速度越快。在本方案中，植入了 1 × 105 个细胞，并在植入后第 11 天和第 12 天进行成像。Xin 等人将 1 × 105 个 C6 细胞植入 BALB/c 裸鼠体内，报道在植入后第 7 天通过 MRI 检测到晚期 GBM，并在 15 天后出现死亡率升高30。相比之下，Jia 等人使用了更高数量的细胞（1 × 106），并在相同的小鼠品系中观察到，第 7 天 MRI 显示存在较小的肿瘤组织，且血脑屏障（BBB）出现轻微破坏，表现为 GBM 组织中伊文思蓝染色较浅32。到第 14 天，伊文思蓝染色比第 7 天更强，表明血脑屏障遭到严重破坏。相应地，肿瘤生长也影响实验动物能够维持的时间长度。这是纵向成像研究中动物福利方面的重要考量。已有报道显示，慢性颅窗在植入后最长可达 6 个月仍适用于成像26.
本方案中使用的纳米颗粒由氧化铁和荧光团组分构成。其可能的应用包括研究新型治疗药物、细胞治疗剂以及针对肿瘤血管系统和肿瘤微环境的干预措施在肿瘤中的递送情况。不同的药物候选物和联合疗法可在细胞和分子水平上进行评估。纳米颗粒中的氧化铁组分使得除了双光子活体显微镜（2P-IVM）外，还可通过磁共振成像（MRI）或磁性粒子成像实现多模态成像。尽管MRI是一种具有临床相关性的成像方式，但其解剖分辨率低于活体显微镜33。
该方法也存在一定的局限性。脑部坐标的确定依据小鼠脑图谱，其标准基于C57BL/6J小鼠，必须根据小鼠品系、性别和年龄进行相应调整。此外，双光子成像的成像深度有限，仅能到达约450 µm的深度9.。因此，利用2P-IVM只能对肿瘤进行部分表征，可能遗漏肿瘤特征的区域差异。另外，本研究仅包含了纳米颗粒（NP）给药后的两个时间点。未来的研究若能增加静脉给药后的时间点，将有助于更详细地分析纳米颗粒在肿瘤微环境中的时空行为。
总之，我们利用双光子体内显微成像技术（2P-IVM）在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中评估了荧光标记的氧化铁纳米颗粒的肿瘤递送效果。该方法可轻松调整以适用于多个研究领域，是一种重要的研究工具。 体内 神经科学领域的脑成像

双光子活体显微镜（2P-IVM）是一种荧光成像技术，可用于观察活体组织1。
20世纪90年代首次开发以来，双光子活体成像（2P-IVM）已被用于 体内 视网膜分析2，肾脏3小肠4耳蜗5心脏6气管7, 在多种临床前模型中的大脑8,9在神经科学领域，双光子体内显微成像技术（2P-IVM）作为一种能够在清醒动物体内对健康大脑进行实时成像的技术，日益受到重视10，以及研究阿尔茨海默病等神经系统疾病11帕金森病12 和胶质母细胞瘤（GBM）13,14,15,16.
双光子体内显微成像技术（2P-IVM）为研究胶质母细胞瘤（GBM）发展过程中肿瘤微环境提供了一种精巧的解决方案。尽管一些先前的研究集中于体外（in vitro）17和离体（ex vivo）模型18，其他研究则采用了原位19和异源性20&#160;体内（in vivo）模型来观察GBM。Madden等人在小鼠模型中对CNS-1大鼠胶质瘤细胞系进行了原位成像13。Ricard等人利用原位移植的GL261-DsRed小鼠模型，在2P-IVM中通过静脉注射荧光染料以增强肿瘤区域的血管信号14。
在此，我们采用双光子体内显微成像技术（2P-IVM）在GBM原位小鼠模型中追踪荧光标记的氧化铁纳米颗粒（NP）在肿瘤部位的递送过程。通过颅窗，该方法使我们能够详细研究纳米颗粒在脑内实时的时空分布。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠输注溶液</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; 改良杜尔贝科氏必需培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>Luer-Lok 注射器，货号 309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&amp;nbsp;FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>70% 酒精棉片</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>喷雾瓶装酒精</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap 不粘铝箔</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>麻醉监测仪&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. 啮齿类动物脉搏血氧仪</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液），液体</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉片</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>5 mm 皮肤活检打孔器&amp;nbsp;</td><td>Miltex</td><td>规格 5</td><td></td></tr><tr><td>缓释型布托啡诺</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1.0 mg/mL</td><td>可使用通用药物替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>C6 大鼠胶质瘤细胞系</td><td>ATCC（美国组织培养收藏中心）</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>套管</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2&amp;rdquo;, 30 G, 1&amp;rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Pfizer&amp;nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/mL</td><td>可使用通用药物替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>头孢唑啉</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/瓶</td><td>可使用通用药物替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>棉签，6&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>牙科水泥套件，透明，双组分</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>可使用通用药物替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>恢复用 DietGel, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>手术巾&amp;nbsp;</td><td>Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap</td><td></td></tr><tr><td>钻机</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>钻头&amp;nbsp;</td><td>Hager &amp; Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>规格 005, US 1/4</td></tr><tr><td>FIJI 图像分析软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fisher HealthCare</td><td>无菌棉质纱布垫，4 x 4&amp;rdquo;, 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&amp;nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&amp;nbsp;</td><td>Surgifoam 可吸收明胶海绵，货号 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&amp;nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&amp;nbsp;</td><td>Germinator 500, 编号 11688</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，直径 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel 盖玻片&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>非无菌手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>无粉腈类医用检查手套</td><td></td></tr><tr><td>无菌手套</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Church &amp; Dwight</td><td>Nair 脱毛乳液&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &amp;micro;L</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>头固定杆</td><td>Hongway</td><td>内径 5 mm 的 O 型圈</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Stoelting Co.&amp;nbsp;</td><td>Rodent warmer X2</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Exel International Medical Products&amp;nbsp;</td><td>29G x 1/2&amp;Prime;</td><td></td></tr><tr><td>氧化铁纳米颗粒</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme 费鲁莫特醇注射液，510 mg/17 mL，59338077501</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG，品系 005557</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（用于手术）</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>纳米颗粒</td><td>定制</td><td></td><td>用异硫氰酸荧光素标记的氧化铁纳米颗粒（费鲁莫特醇）</td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>Lubrifresh P.M. 夜间眼膏，203964</td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>Linde Gas &amp; Equipment Inc.&amp;nbsp;</td><td>高压钢制 K 型气瓶，249CF，2000PSIG，CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>塑料杯</td><td>Georgia-Pacific Consumer Products</td><td>Dixie 分装杯，2 盎司，塑料，透明，每包 2400 个</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex 不锈钢一次性手术刀</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>密封剂</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>一次性实验服</td><td>High Tech Conversions</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting Co.&amp;nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>无菌真空瓶顶过滤系统</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma 货号：S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>泡沫塑料箱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond 组织粘合剂，一次性使用</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>尾静脉导管</td><td>定制</td><td></td><td>由两根 30 G 套管通过硅胶管连接而成&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express（1倍浓度），无酚红</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>紫外手电筒</td><td>Spring Sunshine Technology</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

静脉注射的抗癌治疗药物向脑肿瘤的递送受到血脑屏障的限制。一种能够直接在活体（in vivo）中成像大分子在脑肿瘤内蓄积和分布的方法，将极大提升我们理解并优化临床前模型中药物递送的能力。本方案描述了一种在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中，利用双光子活体显微镜（2P-IVM）实时追踪静脉注射的荧光标记纳米颗粒在活体（in vivo）中动态分布的方法。
本方案包含实验动物麻醉与镇痛、颅窗制备、胶质母细胞瘤细胞植入、头固定杆安装、双光子活体成像（2P-IVM）研究以及术后长期随访护理等多步骤操作的详细描述。我们展示了典型的2P-IVM成像过程及图像分析方法，探讨该技术的优缺点，并讨论其潜在应用。
该方法可轻松修改并适用于体内临床前脑成像领域的不同研究问题。

在此，我们对NSG小鼠胶质母细胞瘤（GBM）模型（n = 5）进行了颅窗手术并移植了C6细胞。颅窗构建所涉及的所有组件之间均实现了适当的密封图1A）将确保窗口在长期成像中的耐久性，并进一步降低动物的发病率。使用适配的载物台 体内 双光子体内成像（2P-IVM）图2），我们能够在麻醉状态下对动物进行长达2小时的成像，且无明显运动伪影。在荷有胶质母细胞瘤（GBM）的小鼠静脉注射纳米颗粒后约10分钟，双光子活体显微成像（2P-IVM）显示肿瘤区域血管呈现绿色荧光信号，符合FITC标记的纳米颗粒定位于血管内的特征。仅有少量绿色荧光信号出现在血管外，提示纳米颗粒开始发生外渗（extravasation）图3A）。可见来自血管外空间的FITC信号增强，这与明显的血管外渗相符。图3B).
<img alt="开颅手术设置示意图；显示细胞植入过程的双光子脑成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1．颅窗放置、开颅、植入与成像。（A）颅窗解剖位置的横截面示意图。由于头部固定杆不含金属，因此除了双光子活体显微镜外，还可进行磁共振成像或磁性粒子成像。（B）开颅（左）、细胞植入（中）和双光子活体显微镜（右）的概览图（上排）和详细视图（下排）。打开颅骨后，会出现表层出血（左），随后迅速被吸收（中）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="机械臂静态平衡；CAD 图纸；螺栓张力分析；工程研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 载物台的计算机辅助设计（CAD）。 用于该实验阶段的 CAD 设计 体内 双光子活体显微成像，包括咬杆、头固定杆以及用于高度和角度调节的螺丝。3D CAD 文件可在以下位置找到 补充编码文件 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="注射FITC纳米颗粒后10小时和24小时的双光子活体显微镜成像，脑肿瘤成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3．体内双光子活体显微镜图像。 在静脉注射纳米颗粒后（A）10分钟和（B）24小时获取的图像。胶质母细胞瘤（GBM）细胞在红色光谱中发出荧光信号（左图），而脑组织中的纳米颗粒在绿色光谱中可见（右图）。# 表示已外渗的纳米颗粒，* 表示血管。在注射纳米颗粒10分钟后，仅有少量颗粒发生外渗，并在肿瘤细胞附近可见。注射纳米颗粒24小时后，在GBM细胞区域可见大量颗粒，提示此时已发生显著的外渗现象。这些纳米颗粒由异硫氰酸荧光素（FITC）和氧化铁纳米颗粒（Ferumoxytol）组成。比例尺为100 µm。缩写：2P-IVM：双光子活体显微镜，RFP：红色荧光蛋白，GBM：胶质母细胞瘤，FITC：异硫氰酸荧光素，NP：纳米颗粒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充编码文件1：载物台的3D CAD文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。

静脉注射的癌症治疗药物向脑肿瘤的递送受到血脑屏障的限制。一种用于直接成像……

胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑癌之一，具有生长迅速和预期寿命短的特点。由于血脑屏障限制了治疗药物的递送，开发针对胶质母细胞瘤的有效疗法仍是一项重大挑战。一种能够直接成像大分子在脑内蓄积与分布的方法，将极大增强我们理解并优化药物递送的能力。双光子显微镜为研究胶质母细胞瘤临床前模型中纳米颗粒的实时分布提供了一种精巧的解决方案。通过修饰本研究中使用的纳米颗粒，可以在细胞和分子水平上探究不同药物候选物及联合疗法的递送效果。除了双光子三重染色显微镜技术外，这些纳米颗粒中的氧化铁成分还可实现与磁共振成像（MRI）或磁粒子成像（MPI）相结合的多模态成像。未来，成像设施可有助于实现癌症的早期检测，从而为恶性肿瘤提供更有效的治疗方案。实现这一目标的途径之一，是将双光子活体显微镜与其他成像技术相结合，例如正电子发射断层扫描和光声超声成像。首先，准备小鼠手术，并将其固定在立体定位仪上。然后抬起颅骨上的皮肤，将剪刀置于右眼与耳之间，进行切口。沿切口标记向颅骨左侧剪开，并移除由此产生的圆形皮瓣。使用手术刀片或微型刮匙，轻轻刮擦颅骨表面以去除骨膜。使用生理盐水和负压清除手术区域的碎屑，以保持术区清洁。刮擦骨膜以确保氰基丙烯酸酯胶水和牙科水泥更好地粘附。然后使用高压灭菌笔标记颅窗的位置。用优势手握住钻头，非优势手握住注射器或镊子。将冷生理盐水滴加到颅骨上，以防止过热并保持手术视野清晰。钻孔过程中，将玻璃盖玻片置于颅骨上方，确认其恰好完全贴合于颅窗内。当能够下压颅骨瓣时，使用镊子小心地将骨片从手术区域移除。若出现少量出血，可使用止血海绵蘸取冰冻生理盐水进行局部轻压，以帮助减少出血。取培养的C6胶质瘤细胞用于植入。用气密微量注射器吸取一微升细胞悬液。然后将注射器置于立体定位仪内。为进行双光子成像的细胞移植，向浅层脑区深度0.8毫米处注射0.5微升细胞悬液。注射后，回撤针头并退出脑组织。现在将头杆和玻璃盖玻片从酒精转移至生理盐水中，并使用真空吸头或镊子将这些组件移至手术部位。将玻璃盖玻片置于颅窗内，并涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水。使用棉签或手术刀轻轻刮除玻璃盖玻片上的任何溢出胶水。将玻璃盖玻片固定在颅窗上，并安装头固定杆。混合牙科水泥，放置头固定杆，并将水泥涂抹于周围区域。用注射器针头、手术刀或钻头清除多余的水泥。封闭颅窗后，检查是否有暴露的颅骨区域。通过将C6胶质瘤细胞注射到小鼠大脑浅层区域，建立胶质母细胞瘤小鼠模型。然后在颅窗处固定头杆，让小鼠恢复。随后，将荧光标记的纳米颗粒通过静脉注射到小鼠体内，以进行脑部的双光子成像。立即打开钛宝石激光器和主系统开关。然后启动 Prairie View 软件。现在将小鼠固定在定制载物台上，置于双光子显微镜下。将动物俯卧于加热垫上，并用胶带固定，注意不要束缚胸腔。向颅窗滴加一滴水，并调节焦距。将传感器置于后肢足垫以监测动物的心率和血氧饱和度。调整头部位置。使用RFP滤光片定位所需的成像区域。确定样品方向和观察视野后，将显微镜从宽场模式切换至光扫描显微模式。确保钛蓝宝石激光器在920纳米处处于锁模状态，并打开所有快门。将GaASP PMT电压调节至500至600伏。在软件中按下“实时成像”以开始成像。获得清晰图像后，使用软件和电动载物台在软件中设置图像堆栈的顶部和底部位置。逐渐增加 pocles 或 PMT 增益，以补偿随深度增加而变暗的情况。设置保存路径并开始 Z 序列扫描。当图像序列采集完成后，使用回放功能检查图像序列的质量。成像完成后，将动物转移至恢复笼中。退出 Prairie View 软件，确保所有数据均已保存并转移，然后关闭计算机及所有硬件设备。在给予纳米颗粒 10 分钟后，仅有少量颗粒发生外渗，并在肿瘤细胞周围可见。然而，在给予纳米颗粒24小时后，胶质母细胞瘤中可见大量颗粒，提示发生渗出。

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癌症研究

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微镜

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一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内...

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荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

要理解癌症的恶性行为，需要建立准确的模型来研究肿瘤细胞与肿瘤微环境组分（如巨噬细胞）之间的相互作用。本文介绍了两种研究胶质母细胞瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞及小胶质细胞相互作用的方法，通过这些方法可评估其对胶质母细胞瘤侵袭能力的影响。...

共培养实验研究巨噬细胞和小胶质细胞对胶质母细胞瘤侵袭的促进作用

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利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

学习双光子活体显微镜技术在小鼠胶质母细胞瘤模型中的应用，利用荧光标记的氧化铁纳米颗粒实时观察药物穿越血脑屏障的分布机制，为优化脑部肿瘤治疗策略提供重要的影像学方法。

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

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