Name: 用于定量小 RNA 的 AQRNA-seq (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 了解AQRNA-seq技术用于精确定量小RNA的方法，研究Mycobacterium bovis BCG在饥饿诱导休眠期间tRNA库的变化。该技术克服了传统RNA-Seq的定量偏差，为发现疾病生物标志物和探索蛋白质翻译机制提供了强大工具。

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本研究的作者们感谢此前描述 AQRNA-seq 技术的原始论文的作者7。本工作获得了美国国立卫生研究院（ES002109、AG063341、ES031576、ES031529、ES026856）以及通过新加坡-麻省理工学院科研与技术联盟抗菌素耐药性独立研究组资助的新加坡国家研究基金会拨款的支持。

Analyzing tRNA Dynamics Using AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. 是两项专利（PCT/US2019/013714，US 2019/0284624 A1）的发明人，这些专利与已发表的研究工作相关。

AQRNA-seq文库构建流程旨在最大限度地捕获样本中的RNA，并在逆转录过程中最小化聚合酶脱落7。通过两步连接接头的方法，将新型DNA寡核苷酸（接头1和接头2）过量连接至样本中的RNA，使其完全互补。过量的接头可通过RecJf（一种特异性作用于单链DNA的5'至3'外切核酸酶）高效去除，而连接产物则保持完整。此外，AlkB处理可减少RNA上的甲基化修饰18，这些修饰可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落，从而缓解人为截短cDNA产物的问题。AQRNA-seq是首个被报道的系统性优化连接和扩增效率的方法。该方法已验证具有定量准确性且无偏倚性假象，在miRNA表达谱研究中被证明是最准确的技术应用。
AQRNA-seq 流程较为复杂，在文库构建过程中，对于温度和/或时间敏感的步骤，建议谨慎操作。具体而言，在 cDNA 合成之前的步骤（图1；步骤 1-4），由于样品中含有本身不稳定的单链 RNA（ssRNA）或已连接 DNA 接头的单链 RNA（DNA-linker-ligated ssRNA），应避免不必要的中断，连续操作为宜。使用强碱在高温条件下进行 RNA 水解（图1；步骤 6）在逆转录后降解 RNA 模板方面效率很高19。然而，需特别注意避免样品长时间暴露于强碱环境中，以及未能及时用强酸中和，尤其是在处理大量样品时。通常建议将所有反应体系在冰上配制，并避免文库中间产物经历反复冻融循环，这是&#160;高度推荐的操作规范。
建议在实验流程的关键节点取样检测文库中间产物，以进行质量控制并及时排查问题。使用自动化电泳设备分析样品，可评估接头连接反应的成功率与效率（图1；步骤2和步骤7）。通过琼脂糖凝胶电泳观察在添加测序引物的PCR反应后索引化cDNA产物的定位情况（图1；步骤9），有助于评估PCR循环次数是否充分，并识别样品可能发生的降解和/或引物二聚体的存在。PCR引物和测序引物可重新设计，以适配操作者所使用的特定测序平台。
由于文库构建过程中涉及的独特设计，AQRNA-seq 数据分析流程主要由自定义脚本构成，仅少量采用了现有的生物信息学程序。然而，在将测序读段比对至参考序列文库时，采用了基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool, BLAST）20，因其具备多项优势，能够满足 AQRNA-seq 数据分析的特定需求。这些优势包括：(i) 能够比对短于 20 bp 的读段并执行子序列比对，(ii) 对模糊碱基（N）的合理处理能力，(iii) 略高的比对准确性，以及 (iv) 提供包含错配和空缺等丰富细节的 informative 输出结果，有利于多种下游分析。
值得注意的是，在AQRNA-seq的文库构建流程和数据分析流程中，仍存在若干设计挑战，需要进一步优化，这也是当前正在进行的工作重点。首先，AQRNA-seq相较于传统RNA-seq方法所实现的更优定量准确性，是在50–75 ng小RNA输入量下达成的；目前该流程正在使用更少的RNA输入量以提高其灵敏度，并尝试使用更长的RNA以拓展其应用范围。其次，尽管通过AlkB酶处理可去除转录后甲基化修饰，但仍存在其他可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落的RNA修饰10。这可能导致产生人工截短的cDNA产物，难以有效区分其是源于逆转录过程中的技术假象，还是全长tRNA真实的生物学5'端降解。因此，目前正评估多种可能进一步提升逆转录酶持续合成能力的方法，以确定其在AQRNA-seq中的有效性与兼容性。第三，通过凝胶电泳提取和纯化去除引物二聚体的效率较低，不可避免地造成目标片段的损失，并增加文库间的变异度。因此，如何在不损失目标片段的前提下有效减少引物二聚体的残留，是进一步提升AQRNA-seq灵敏度和定量准确性的关键方向。尤为重要的是，AlkB处理以及凝胶提取与纯化步骤均耗时耗力，不利于大规模样本的处理。随着上述各方面的改进，未来有望实现AQRNA-seq方法的自动化和高通量操作。当前对数据分析流程的持续优化，重点在于提升效率、定量准确性与灵活性。尽管现有流程能有效从测序读段中切除3'接头序列，但部分读段仍含有5'接头序列，可能源于连接过程中对衔接子3'末端阻断不充分。5'接头序列的存在可能干扰测序读段的比对，从而影响定量准确性。因此，将引入如Cutadapt等额外的接头切除工具，以确保对3'和5'接头序列的充分去除21。为提升分析效率，改进后的流程将整合合理策略以减少计算时间，包括通过识别显著重叠区域将成对末端读段进行拼接，并提取每个文库中唯一的序列及其出现频次。这些策略有望显著减少下游计算时间，避免对（i）来自正反方向的重复读段和（ii）可能在AQRNA-seq文库测序读段池中占主导地位的重复序列进行冗余分析。展望未来，AQRNA-seq文库构建流程与数据分析流程的协同优化，有望为各类RNA（如转录组、tRNA片段以及循环肿瘤RNA等稀有RNA种类）的严格定量研究、tRNA修饰图谱绘制，以及其他生物标志物发现和发现生物学关键领域开辟广泛的应用前景。

下一代测序（NGS），也称为大规模并行测序，是一种DNA测序技术，包括DNA片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链式反应（PCR）的扩增、DNA测序以及将片段序列重新组装成完整基因组。将NGS技术应用于RNA测序（RNA-seq）是一种强大而有效的方法，可用于鉴定和定量RNA转录本及其变异体1。随着RNA文库构建流程和生物信息学分析流程的不断创新，以及实验室仪器设备的持续进步，RNA-seq的应用范围已显著拓展，不再局限于外显子测序，而是延伸至非编码RNA谱型分析2、单细胞分析3、空间转录组学4,5、可变剪接分析6等先进的功能组学领域。这些先进的RNA-seq方法通过在正常与病变细胞及组织中对转录组进行定量分析，揭示了RNA复杂多样的生物学功能。
尽管RNA测序技术取得了上述进展，但若干关键技术特征仍限制了该方法的定量能力。虽然大多数RNA-seq方法能够对不同实验变量（即生物样本和/或生理状态）之间RNA水平的变化进行精确且准确的定量，但它们无法提供样本内RNA分子水平的定量比较。例如，大多数RNA-seq方法无法准确量化细胞中表达的tRNA池内各个同工受体tRNA分子的相对拷贝数。正如配套出版物7所强调的，RNA-seq的这一局限性源于RNA结构本身以及文库构建过程中涉及的若干生化特性。例如，用于将3'端和5'端测序接头连接至RNA分子的连接酶活性，会受到RNA末端核苷酸以及测序接头序列的影响。这导致接头连接效率存在显著差异，并引发测序读长出现严重的假象性增加8,9,10。
第二类局限性源于RNA分子固有的结构特性。具体而言，RNA二级结构的形成以及表观转录组中数十种转录后RNA修饰的动态变化&#160;，可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落或产生突变。这些错误会造成cDNA合成不完整或截短，或导致RNA序列发生改变。尽管这两种现象可被用于绘制RNA二级结构或某些修饰位点，但如果后续文库构建步骤未能捕获截短的cDNA，或数据分析过程中丢弃了与参考数据集不匹配的突变序列，则会降低RNA-seq的定量准确性11,12。此外，RNA转录本在化学性质、长度和结构上的高度多样性，以及缺乏对长RNA进行均一片段化的工具，限制了大多数RNA-seq方法在所有RNA种类中的适用性13。
AQRNA-seq（绝对定量RNA测序）方法的开发旨在消除若干限制定量准确性的技术和生物学因素7。通过在RNA测序文库构建过程中最大限度地减少捕获、连接和扩增步骤中的序列依赖性偏差，AQRNA-seq相较于其他方法表现出更优的线性关系，能够以2倍以内的准确度对包含963种miRNA的参考文库中75%的miRNA进行精确量化。测序读段数量与RNA丰度之间的线性相关性也在对不同长度RNA寡核苷酸标准品混合物的分析以及与如Northern印迹等正交方法的比较中得到验证。测序读段数量与RNA丰度之间线性关系的确立，使AQRNA-seq能够实现对样本中所有RNA种类的准确绝对定量。
以下是AQRNA-seq文库构建流程及配套下游数据分析流程的方案描述。该方法已用于阐明在饥饿诱导的休眠及随后复苏过程中tRNA丰度的动态变化&#160;的 Mycobacterium bovis 卡介苗（bacilli de Calmette et Guérin, BCG）结核病模型。研究结果展示了测序数据的探索性可视化分析，并结合后续的聚类分析和差异表达分析，揭示了与不同表型相关的tRNA丰度的可辨识模式。

<table><tbody><tr><td>2-酮戊二酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>配制工作液（1 M），并于 -20 ℃ 保存&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>安捷伦</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M（组分编号：N0437AVIAL）</td><td>NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/&amp;mu;L）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>琼脂糖 GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>六水合硫酸亚铁铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>配制工作液（0.25 M），并于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>小RNA分析生物分析仪</td><td>安捷伦</td><td>5067-1548&amp;nbsp;</td><td>小RNA分析用于检测输入RNA的质量以及酶促反应的效率（例如接头1连接反应）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA；10 mg/mL）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>该产品已于2022年12月15日停产，由重组白蛋白（分子生物学级，NEB B9200）替代。</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>去甲基化酶&amp;nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>去甲基化酶随 rtStar tRNA 预处理提供 &amp;amp; 第一链 cDNA 合成试剂盒 (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L（组分编号：N0447LVIAL）</td><td>该dNTP溶液混合物含有等摩尔浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP（每种10 mM）</td></tr><tr><td>数字双加热模块</td><td>VWR 科学产品</td><td>13259-052</td><td>加热块与QIAquick配合使用&amp;nbsp;凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DyeEx&amp;nbsp;2.0 离心柱纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&amp;nbsp;</td><td>可有效去除短片段残留物（例如，长度小于10 bp的寡核苷酸）</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>伯乐实验室</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR管（0.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管（0.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管（2 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（纯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&amp;nbsp;</td><td>使用Zymo Research公司的Oligo Clean and Concentrator试剂盒时，需采用纯乙醇</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液，紫色（6×），不含SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S（组分编号：B7025SVIAL）</td><td>NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和上样染料，紫色（6×），不含 SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 紫外-可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>840-309000</td><td>分光光度计用于根据比尔定律测定寡核苷酸浓度</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>配制工作液（1 M；用 NaOH 调节 pH 至 8），并于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）&amp;nbsp;</td><td>VWR 科学产品</td><td>BDH3028&amp;nbsp;</td><td>配制工作液（5 M），并于室温下保存</td></tr><tr><td>异丙醇（异丙醇），纯品</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>异丙醇与QIAquick一起使用&amp;nbsp;凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>配制工作液（0.5 M），并于 -20 ℃ 保存&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L（组分编号：B7002SVIAL）</td><td>NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）&amp;mu;L）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean &amp;amp; 浓缩试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061&amp;nbsp;</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>PEG 8000（50% 溶液）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M（组分编号：B1004SVIAL）</td><td>NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/&amp;mu;L）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>珀尔帖热循环仪</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>苯酚：氯仿：异戊醇&amp;nbsp;乙醇 25:24:1 pH = 5.2&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J62336&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript缓冲液（5X）</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 逆转录酶</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&amp;nbsp;凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>该试剂盒需要使用加热块和异丙醇</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S（组分编号：N0551SVIAL）</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S（组分编号：N0556SVIAL）</td><td>NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和 Gel Loading Dye, Purple (6X)，不含 SDS</td></tr><tr><td>RecJf&amp;nbsp;(30 U/&amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0264L（组分编号：M0264LVIAL）</td><td>NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）&amp;mu;L）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNase抑制剂（小鼠来源；40 U/μL）&amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L&amp;nbsp;（组分编号：M0314LVIAL）</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SeqAMP&amp;nbsp;DNA聚合酶&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 含有 SeqAMP&amp;nbsp;DNA聚合酶&amp;nbsp;和 SeqAMP&amp;nbsp;PCR缓冲液（2X）</td></tr><tr><td>SeqAMP&amp;nbsp;PCR缓冲液（2X）&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 含有 SeqAMP&amp;nbsp;DNA聚合酶&amp;nbsp;和 SeqAMP&amp;nbsp;PCR缓冲液（2X）</td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶（1 U/&amp;mu;L)&amp;nbsp;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0371L&amp;nbsp;（组分编号：M0371LVIAL）</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S5881</td><td>配制工作液（5 M），并在室温下保存</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶（400 U/&amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202L&amp;nbsp;（组分编号：M0202LVIAL）</td><td>NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/&amp;mu;L）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶反应缓冲液（10X）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&amp;nbsp;（组分编号：B0202SVIAL）</td><td>NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/&amp;mu;L）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）</td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶1（30 U/&amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M（组分编号：M0437MVIAL）</td><td>NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/&amp;mu;L）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）</td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M（组分编号：B0216SVIAL）</td><td>NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/&amp;mu;L）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10×）、PEG 8000（1×）和ATP（100 mM）</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq用于小rna定量

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq 在测序读段数与生物样本中小RNA拷贝数之间提供了直接的线性关系，从而实现了对小RNA群体的精确定量。本文所述的 AQRNA-seq 文库构建流程包括使用定制设计的测序接头，以及一步去除阻碍逆转录过程持续性的甲基化RNA修饰的步骤，从而提高了全长cDNA的产量。此外，还详细介绍了配套的生物信息学分析流程。本研究通过对营养剥夺20天及复苏6天过程中5个选定时间点采集的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）中45种tRNA进行定量分析，展示了 AQRNA-seq 的应用。本文还将讨论进一步提高 AQRNA-seq 效率与严谨性的持续努力，包括探索在PCR扩增后避免凝胶纯化以缓解引物二聚体问题的方法，以及提高全长读段比例以实现更精确的读段比对。未来对 AQRNA-seq 的改进将聚焦于推动该技术的自动化和高通量实施，以实现对来自不同生物体的细胞和组织样本中所有小RNA种类的定量分析。

处于指数生长期的Mycobacterium bovis BCG（卡介苗）1173P2菌株经历了时间序列（0、4、10 和 20 天）的营养饥饿处理，随后在营养丰富的培养基中复苏6天，实验方案如Hu等7先前所述。在五个指定的时间点，从细菌培养物中分离小RNA，并设置三个生物学重复。使用上述AQRNA-seq文库构建流程（图1）构建Illumina文库，随后在麻省理工学院生物微中心的测序仪上进行测序。测序数据随后通过定制的AQRNA-seq数据分析流程（图2）进行处理，用于tRNA丰度的定量分析。
使用测序引物对cDNA文库进行PCR扩增后，所有样品中均观察到大小为175个碱基对（bp）的PCR产物（图3A），提示形成了引物二聚体。为减少引物二聚体的残留，从凝胶中切下大于195 bp的PCR产物并进行纯化（图3B）。
经过质量过滤和修剪的测序读段被比对至一个自定义的参考序列文库，该文库包含45种tRNA同工受体、内参标准以及对照序列（即23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、rnpB和ssr）。在特定样本的总比对读段中，tRNA同工受体占比为10.5%至40.2%，其丰度显著高于对照序列（图4）。值得注意的是，tRNA同工受体相对较低的读段比例可归因于内参标准物的相对丰度较高。因此，操作者可通过精确调节加入反应体系的内参标准物的量，来控制tRNA同工受体相对于内参标准物的读段比例（图4，粉色与绿色色块对比）。
原始tRNA丰度数据使用DESeq2软件包版本（下文简称v）1.36.0中的比率中位数法进行标准化。16 在 R 统计编程环境（以下简称 R）v 4.2.1 中17标准化后，tRNA同工受体的定量图谱 Mycobacterium bovis 在营养饥饿及复苏的时间过程中实现 BCG 的研究（图5).
为了揭示基于tRNA同工受体丰度模式的不同表型样本的显著聚类，使用R语言中的stats包v 4.2.117对标准化的tRNA丰度数据进行了主成分分析（PCA）（图6）。该分析将饥饿第0天和复苏第6天的样本与饥饿第4、10和20天的样本区分开来，表明在营养缺乏培养基和营养丰富培养基中培养的Mycobacterium bovis BCG在tRNA图谱上存在显著差异。
为了分析每种tRNA同工受体在五个指定时间点的丰度动态变化，使用R语言中的DESeq2软件包（v 1.36.0）对标准化后的tRNA丰度数据进行了差异表达分析（图7）。分析结果显示，在20个同工受体家族中，有17个家族包含至少在一个时间点显著上调或下调的同工受体，表明tRNA库的调控可能在结核分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）的持续感染状态中发挥潜在作用。
<img alt="RNA测序工作流程图；步骤：去磷酸化、连接、甲基化、逆转录、PCR。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：AQRNA-seq文库构建工作流程示意图。 工作流程中的关键步骤列于示意图中央，并通过虚线与各自对应的图示相连。每个步骤的详细说明见“实验方案”部分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="测序工作流程图：质量评估、剪切、过滤、比对、配对、解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：AQRNA-seq 数据分析流程示意图。 流程中列出的关键步骤位于示意图中央，并通过虚线与各自对应的图形说明相连。各步骤的详细描述可在 GitHub 获取（https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="饥饿和复苏阶段DNA模式的凝胶电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用测序引物进行PCR扩增后cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。（A）凝胶提取和纯化前的凝胶图像。从左侧起第7和第14泳道含有5 µL的50 bp DNA标记物，其余泳道各含有20 µL的15个样品。PCR产物的大小定位显示其浓度最高的片段范围在175 bp（引物二聚体）至300 bp（两个引物+120 bp 5S rRNA）之间。（B）凝胶提取和纯化后的凝胶图像。对每个样品，切取200 bp至400 bp之间的凝胶区域，以尽量减少测序文库中引物二聚体的污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="饥饿和复苏不同天数下各样本累积读长数分析的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：成功比对到参考序列文库的测序读长数量。 横轴显示按时间点（例如，饥饿第0天）分组的样本名称（例如，D18-69XX）。对于每个样本，与不同目标类别相关的读长数以堆叠的彩色块表示。位于彩色块中心的数字表示在给定样本中对应目标类别的读长所占比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="tRNA 丰度分析，柱状图；饥饿，复苏；教育研究工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：Mycobacterium bovis BCG 在饥饿与复苏时间进程中的 tRNA 同工受体在不同时间点的定量图谱。原始 tRNA 丰度数据采用比值中位数法进行标准化。图中每一行表示在每个时间点三个生物学重复样本的标准化 tRNA 丰度（y 轴），以均值 ± 标准误差表示。x 轴上，来自同一家族的同工受体被归为一组，并以相应的氨基酸标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细菌饥饿-复苏阶段的多维尺度分析图；数据聚类分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：基于主成分分析（PCA）得到的样本的平方余弦图。 PCA 分析基于标准化的 tRNA 丰度进行。平方余弦值表示主成分对样本的重要性，样本按前两个主成分的平方余弦值进行绘制。样本使用样本编号标记，并按时间点进行颜色编码。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氨基酸丰度比较；多条件图表；标准化读数计数；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66335/66335fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：不同时间点tRNA同工受体的差异表达。 标准化的tRNA丰度以3次生物学重复的均值（线条结点）±标准误（误差线）表示。由于空间限制，实验条件缩写如下：S0-S20 = 饥饿第0-20天；R6 = 复苏第6天。对每个tRNA同工受体进行差异表达分析，使用似然比检验和Wald检验对不同时间点进行两两比较。采用紧凑字母法表示统计学显著性，即在同一tRNA同工受体中，若不同时间点共享至少一个相同字母，则它们之间的丰度差异不显著。例如，tRNA-Lys-CTT-1-1（赖氨酸面板中）的丰度从S0到S4以及从S4到S10均显著下调，但从S10到S20无显著变化；随后从S20到R6显著上调。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/66335fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：AQRNA-seq文库构建流程中所用的寡核苷酸。 内参标准品为RNA，其余所有寡核苷酸均为DNA。所列的PCR引物和定制测序引物针对特定测序平台设计。可根据新的索引序列设计额外的PCR引物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66335/Chen%20et%20al%20Table%201%202023%2010-7_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis BCG中转运RNA（tRNA）群体的变化。

AQRNA-seq用于小RNA定量

AQRNA-seq 在生物样本的测序读数与小RNA拷贝数之间提供了直接的线性关系，从而实现了准确的定量分析。

AQRA测序可对几乎所有细胞或组织样本中的小RNA（如microRNA、tRNA及tRNA片段）进行定量作图。该技术可用于绘制170种已知tRNA修饰中的部分修饰图谱，但针对修饰作图，尚有其他更为特异的方法。您可利用AQRNA-Seq在中国台湾地区发现疾病生物标志物，并在系统水平上探究蛋白质翻译机制。大多数RNA-Seq方法无法准确量化样本中单个RNA分子的丰度。这主要是由于RNA自身的结构特性（如二级结构、转录后修饰）以及文库构建过程中的生物化学因素（例如RNA末端核苷酸引起的连接偏倚可达上千倍）所致。AQRNA-Seq的开发旨在克服若干限制RNA丰度精确定量的技术和生物学挑战。与其他方法相比，a在RNA分子的测序读数与拷贝数之间实现了线性关系，能够以两倍的准确性精确量化包含963种microRNA的参考文库中75%的成分。AQRNA-Seq的独特之处在于可对小RNA进行绝对定量，从而将测序读数直接关联至样本中RNA分子的实际拷贝数。这种精度对于在样本中比较数十至数百种tRNA至关重要，而常规的小RNA测序仅能实现不同条件和样本间的相对定量。我们设计AQRNA-Seq旨在满足尚未解决的需求，并深入理解蛋白质翻译过程。我们发现，细胞会重编程数十种tRNA修饰以及这些修饰tRNA的拷贝数，从而选择性地翻译那些富含与这些tRNA相匹配密码子的信使RNA。AQRNA-Seq 使我们能够量化作为该机制一部分的 tRNA 池的变化。我们已广泛使用该技术来验证这一新的蛋白质翻译模型。首先，准备 10 毫升 2X AlkB 反应缓冲液，并通过 0.2 微米注射器滤器灭菌。在无菌的PCR管中加入20微升连接接头一的RNA，50微升2X AlkB反应缓冲液，2微升AlkB去甲基化酶，1微升RNase抑制剂以及27微升无RNase的水，以制备AlkB消化反应体系。将AlkB消化反应混合物在室温下孵育2小时，以去除RNase上的转录后甲基化修饰。为实现清晰的相分离，向AlkB反应体系中加入50微升无RNase的水，然后加入100微升苯酚、氯仿和异戊醇的混合液。将离心管振荡10秒。将AlkB反应混合物在16,000 G条件下离心10分钟。转移约140微升含有RNA的上层水相至无菌的1.5毫升离心管中。为了去除残留的苯酚，向提取的RNase中加入100微升氯仿并振荡试管。将混合物在16,000 G离心10分钟，然后将约120微升上层水相转移至无菌的1.5毫升离心管中。逆转录反应后，向RNA-cDNA杂合物中加入1微升5摩尔的氢氧化钠。在93摄氏度下孵育三分钟，以水解RNA-cDNA杂合链中的RNA链。然后加入0.77 µL的5 M盐酸以中和反应。用TAE缓冲液配制3%琼脂糖凝胶。将1微升6X上样缓冲液与5微升PCR产物混合，并将该混合物上样至凝胶中。在第一个样品前和最后一个样品后的加样孔中，各加入5微升50或100碱基对DNA分子量标记。以120伏、400毫安的电流电泳75分钟，以定位PCR产物。电泳结束后，将凝胶放入一个容器中，并加入去离子水至完全浸没凝胶。向水中加入10微升溴化乙锭，用铝箔包裹容器，在摇床上染色30分钟。将含有溴化乙锭的水倒入通风橱内的废液瓶中丢弃。用去离子水冲洗凝胶一次，并将水倒入废液瓶中。用去离子水洗涤凝胶10分钟后，使用凝胶成像仪观察条带，并获取凝胶的高分辨率图像。

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科研

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遗传学

用于定量小 RNA 的 AQRNA-seq

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