用于慢性肺移植排斥小鼠模型中胶原沉积半定量组织病理学评估的苦味酸-天狼星红染色

我们的研究重点是分析慢性肺移植排斥反应中纤维化的发展过程。因此，我们关注能够表征纤维化组织区室的方法。为了模拟移植相关疾病，我们采用了数年前建立的小鼠单肺移植模型。

在此模型中，同种异体小鼠品系间的肺移植已被证明会导致不同程度的移植物纤维化。关于纤维化组织重塑的组织学数据通常以定性方式呈现。我们采用的苦味酸天狼星红染色方法具有半定量评估的优势，并可区分粗胶原纤维与细胶原纤维。

首先，将石蜡包埋的小鼠肺组织样本依次浸入浓度递减的乙醇中，每步两分钟。将切片置于梅耶氏苏木精溶液中染色8分钟。用流动的自来水冲洗切片10分钟，然后将切片置于苦味酸-天狼星红溶液中孵育1小时。

将载玻片在0.5%乙酸溶液中浸洗5至10次。轻轻摇动载玻片以去除溶液。随后将载玻片依次置于浓度递增的乙醇中以及100%二甲苯中各脱水5分钟。

加入一滴封片剂至样本上以进行封固，并盖上盖玻片。将载玻片置于通风橱中干燥。在光学显微镜下，使用适当的成像软件对样本进行聚焦，直至获得清晰锐利的图像。

调整偏振滤光片的角度，直至背景完全变暗或呈黑色。在20倍放大倍数下扫描样品，并以TIFF格式导出图像。将图像传输至Fiji软件。

单击“编辑”并选择“清除外部”。然后单击“分析”，再单击“测量”，以测量总表面积。为测量每个样本的总胶原蛋白含量，单击“图像”，然后依次单击“调整”和“颜色阈值”。

将色相设置在 2 到 130 之间，亮度设置在 35 到 255 之间。然后点击“Analyze”，在“Analyze Particles”窗口中将大小设置为 1 至无穷大，并勾选“Clear”和“Summarize”选项。将色相调整为红色以分析粗胶原纤维，调整为黄绿色以分析细胶原纤维，并测量总胶原纤维数量。

最后，点击 Plugins（插件）、Macros（宏）和 Record（记录）以配置宏，实现自动化处理。Masson 三色染色、Herovici 染色及 Picrosirius Red 染色结果显示，在主要组织相容性复合体不匹配模型中，支气管周和血管周存在广泛的胶原沉积；而在次要不匹配模型中，主要表现为密集的淋巴细胞浸润，胶原沉积程度较轻。

使用偏振滤光镜进行苦味酸-天狼星红染色显示，两种模型中沉积的纤维均呈现绿色。同基因移植对照组显示胶原仅局限于支气管周和血管周边界，与未处理的小鼠肺组织相似。数字图像分析表明，主要组织相容性复合物不匹配的肺移植物中的总胶原含量较次要不匹配移植物、右侧未处理肺组织或未处理的BALB/c小鼠左侧肺组织有所增加。

未观察到粗胶原纤维存在差异。细胶原纤维分析显示，与轻度错配模型、未经处理的右侧肺组织或未经处理的BALB/c小鼠左侧肺组织相比，重度错配模型中细胶原纤维增多。