Name: 志贺氏菌上皮细胞感染分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 学习志贺氏菌上皮细胞感染检测方法，利用体外细胞系研究其黏附、入侵和胞内复制机制。该方案有助于深入理解感染过程，为开发有效疫苗和治疗策略提供重要依据。

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作者的研究得到了马萨诸塞州总医院儿科系、研究执行委员会临时支持基金（ISF）项目2022A009041、美国国家过敏与传染病研究所资助R21AI146405以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助哈佛营养与肥胖研究中心（NORCH）2P30DK040561-26的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

Protocols for Analyzing Shigella Infection in Colonic Epithelial Cells

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一组三种标准化的实验方法，用于研究Shigella对肠上皮细胞的黏附、侵袭以及胞内复制。尽管这些方法仅是对经典庆大霉素保护实验的改良版本，最初用于研究多种细菌病原体在宿主细胞内的侵袭和胞内复制过程49,50,51，但在研究Shigella时必须采用特殊的实验条件和考虑因素。
志贺氏菌 是兼性厌氧菌，在有氧条件下，于37 °C的丰富培养基中生长最佳43在进行这些检测以探究不同环境信号或代谢物对...的影响时 志贺氏菌 感染时，建议培养 志贺氏菌 在丰富培养基中过夜培养，然后转接至限定或补充培养基中，于感染前培养至对数生长中期。毒力基因的最大表达发生在对数生长期。52,53因此，过夜传代培养 志贺氏菌 培养并使细菌生长至指数期（OD600 ~ 0.7）是正确评估的必要步骤 志贺氏菌 毒力。此外，毒力基因的表达具有温度依赖性。为确保仅在宿主感染期间特异性表达，毒力基因在宿主生理温度（37 °C）下被诱导，而在较低温度（如 30 °C）下则受到严格抑制。54为确保毒力基因的表达，细菌传代培养和感染操作必须在37 °C下进行，并需妥善控制温度，防止低于37 °C。一个大小约为220 kb的毒力质粒是所有此类细菌所必需的关键毒力决定因子，该质粒编码了入侵和感染上皮细胞所需的分子机制。 志贺氏菌 种（spp）5反复传代和在37 °C下长期培养会促进毒力质粒的不稳定性，导致质粒丢失，从而使菌株失去毒力 志贺氏菌 无毒力细胞55为确保毒力质粒的稳定维持及关键毒力基因的表达，建议每隔两周将细菌直接从冻存菌种重新划线接种至新鲜的TSB + 刚果红指示剂平板。刚果红琼脂可用于区分野生型毒力菌株（红色，CR⁺）与非毒力或质粒丢失突变株（白色，CR⁻）。+）菌落和无毒型（白色，CR-丢失毒力质粒的菌落45若反复观察到毒力质粒不稳定，应进行过夜培养的 志贺氏菌 可在30 °C下孵育以防止毒力质粒丢失，随后在37 °C下传代培养以促进毒力基因表达43最后，如果使用含有抗生素标记的突变株和/或互补菌株进行分析，建议在细菌过夜培养及传代培养步骤中使用相应的抗生素筛选。
使用HT-29上皮单层细胞在研究分子机制方面具有多种优势 志贺氏菌 发病机制 体外。由于 志贺氏菌 是一种适应于人类的病原体，因此小型动物模型无法准确反映人类志贺菌病的特征性发病机制36因此，采用标准化的感染人源细胞系的实验方案，可对细菌致病过程中的各个步骤进行定量分析，以表征该病原体与其天然宿主之间的分子相互作用。历史上，HeLa细胞被广泛用于研究宿主与病原体之间的相互作用。 体外25,56,57然而，HeLa细胞是一种永生化的宫颈癌细胞系，对于肠道细菌病原体而言属于非天然宿主细胞。因此， 体外 对肠道致病机制的研究已转向使用结肠腺癌细胞系（如 HT-29、Caco-2 和 T84），这些细胞系能更真实地模拟肠上皮形态，并可在跨孔培养系统中生长为具有分化明显的顶膜和基底侧膜的上皮单层。58,59,60尽管每种细胞系都有其各自的优缺点，但HT-29细胞因其在表型上与肠道肠上皮细胞具有相似性，并能稳定表达细胞表面受体和促炎性细胞因子，故被用于本文所述的实验。58,59,61然而，上述讨论的每种模型均为癌症来源的细胞系，具有异常的代谢和生长表型，不能准确代表结肠上皮的自然生理状态 体内58近年来，人类组织培养技术的进步使得从组织活检中获取的人类肠道干细胞能够被培养成类器官或单一的二维细胞单层，这些模型可重现人体胃肠道（GI） tract 中存在的多种细胞类型62,63,64肠道类器官可分化为包含肠上皮细胞、分泌黏液的杯状细胞、M细胞及其他组织特异性细胞类型。近期研究已证实，这些类器官模型可用于研究肠道病原体，包括多种 志贺氏菌 sp. 鼠伤寒沙门氏菌，以及 大肠杆菌 致病变种62,63,64尽管类器官是更精确的人胃肠道上皮模型，甚至可在不同的营养条件下培养以代表全球人群65，其相对复杂的特性需要大量的培训和技术专长，导致与传统癌细胞系相比，培养成本更高且培养时间更长58.
本方案描述了中等通量的实验方法，即使用两块6孔板，共可提供12个单层细胞用于检测。然而，实验可轻松扩大规模，以增加接种的单层细胞数量，从而容纳更多的技术重复，或检测更多的Shigella突变株和环境信号。也可使用孔数更多的组织培养板（例如&#160;12孔板或24孔板），但需根据孔径较小的情况进行适当调整。根据步骤3.2中所述的HT-29培养条件，从一个T75培养瓶中培养出的HT-29细胞滴度足以接种约六个6孔板，同时还能保留足够数量的细胞以维持HT-29细胞系的培养。此外，细菌黏附、侵袭及胞内复制实验在HT-29单层细胞的接种和接种菌液的制备步骤上完全相同。因此，针对相同Shigella菌株或传代培养条件的实验可平行开展，从而同时考察各实验条件在Shigella感染不同阶段中的作用。
通过裂解感染的 HT-29 细胞后进行系列稀释并涂板，测定贴壁（步骤 4）、侵入（步骤 5）和细胞内细菌（步骤 6）的回收滴度，从而实现对每个阶段效率的定量评估 志贺氏菌 感染。基于经典实验方法的侵袭和细胞内复制实验中的离心步骤49,50,51，促进细菌与宿主细胞的接触以实现快速侵入，并提高侵入率。因此，离心处理 &#34;跳过&#34; 黏附步骤，后来被发现是其中一个重要方面 志贺氏菌 感染17,18,19,66需要注意的是，接种在Transwell小室上的极化上皮细胞不能进行离心步骤。然而，在黏附实验中，黏附过程不通过离心强制进行，且在裂解感染的HT-29细胞前不添加庆大霉素，从而允许对黏附的细菌细胞进行计数。为了使细菌与HT-29细胞更有效地接触，组织培养基的体积减少至1 mL（相对于侵袭和细胞内复制实验的2 mL）。此外，根据黏附速率的不同，在3小时孵育期间可能发生一定程度的侵袭和细胞内复制，但通常可忽略不计（例如，&#160;仅占宿主细胞裂解后回收细菌群体的0.05%。然而，为了准确区分在3小时孵育期间黏附于细胞表面与真正内化的细菌，建议进行平行实验：除标准操作步骤外，另设一组培养板，每孔加入2 mL含50 µg/mL庆大霉素的DMEM，总体孵育45分钟（先孵育15分钟，洗涤一次，再更换为新鲜DMEM加庆大霉素继续孵育30分钟），以彻底清除胞外细菌。随后按照方案所述裂解HT-29细胞，按前述方法计数胞内菌数量，该数值即代表成功入侵的细菌数。将未经庆大霉素处理组所计数的总细菌数减去此数值，即可准确区分黏附与入侵的细菌数量。此外，也可通过平行分析进一步探究细菌在细胞内的复制情况。 志贺氏菌 在侵袭HT-29细胞后，可通过多个时间点绘制细胞内细菌生长曲线，以评估其胞内增殖情况。最后，在经过18小时庆大霉素孵育后，除对细胞内细菌进行计数外，还可收集培养上清液，检测感染HT-29细胞的细胞因子分泌水平。例如，IL-8是一种由上皮细胞分泌的趋化因子，主要功能是募集中性粒细胞（PMNs）至感染部位。可通过IL-8 ELISA检测法测定感染HT-29细胞培养上清中IL-8的分泌量。67.
胆盐已被证实是Shigella在通过人体胃肠道过程中重要的毒力信号，可在本实验方案的细菌培养基中添加胆盐，以模拟典型的胃肠道环境。正常情况下，胆盐在十二指肠或小肠上段释放，以协助消化；&#160;而在回肠末端或小肠末端，约95%的胆盐被吸收并重新循环，最终储存于胆囊68。小肠内胆盐的浓度通常在0.2%–2.0%（w/v）之间，具有天然的杀菌作用。然而，Shigella与大多数肠道细菌一样，能够耐受胆盐，并利用这些信号增强感染能力47。已有多个研究记录了胆盐暴露（有时与其他小肠信号如葡萄糖共同作用）如何影响Shigella在感染前的存活及毒力调控。研究表明，在模拟小肠通过条件的环境中，Shigella能够抵抗胆盐、改变基因表达，并形成和分散生物膜17,69。这些变化可导致出现高毒力表型，即当Shigella随后感染结肠时，其黏附和侵袭能力被显著诱导17,18,19,48,66。因此，上述条件描述了如何在进行黏附、侵袭或细胞内复制实验前，使用胆盐对Shigella进行传代培养，以模拟其在小肠中的通过过程。所指定的TSB培养基配方相较于典型的Luria肉汤（LB）含有额外添加的葡萄糖17。因此，若使用LB培养基，则必须同时补充葡萄糖（0.5%–2.0% [w/v]），以充分考虑小肠中的葡萄糖信号影响17。此外，如上所述，所有Shigella的传代培养物均需经过洗涤以去除胆盐，从而模拟其向结肠转移的过程，用于后续感染分析。
传统上，以及如上文结果所示（图1 和 图2），感染实验对于确定特定基因在其中的作用具有重要价值 志贺氏菌 感染。然而，若不恰当地补充细菌培养基，各种突变体的表型可能无法被准确评估。正如先前研究所表明的，胆盐会显著改变 S. flexneri 基因表达，包括中心代谢基因、转录因子、糖转运蛋白、药物抗性基因以及位于染色体或毒力质粒上的毒力基因17这些基因有助于揭示 志贺氏菌 利用胆盐作为信号来改变基因表达，为最终感染结肠做准备，因此在进行黏附、侵袭和细胞内复制等毒力相关实验之前，必须在添加了适当成分的细菌培养基中完成后续的突变体分析。如上所述 图1 和 图2，ΔVF 突变不影响黏附能力，但影响侵袭和细胞内复制。由于该突变增强了侵袭和细胞内复制能力，目前正在进行实验以确定该基因产物如何调控感染过程。突变体分析为深入理解相关机制提供了范例 志贺氏菌 致病机制可被研究，尤其是在更接近人类胃肠道条件的情况下。建议进行适当的互补分析，以验证各类突变体的表型。
综合而言，这些实验步骤描述了定量实验，将为深入理解分子作用机制提供重要见解 志贺氏菌 黏附、侵袭以及在HT-29结肠上皮细胞内的复制，以最佳模拟人类胃肠道感染期间的自然环境。未来的研究可拓展突变株和实验条件，以更深入地理解其机制 志贺氏菌 为有效感染人类宿主做准备。尽管已有数十年的研究，关于这一领域仍有许多未知有待探索 志贺氏菌 感染.

由肠道致病菌引起的腹泻病是全球重大的公共卫生负担。2016年，腹泻病在全球造成130万人死亡，是五岁以下儿童死亡的第四大原因1,2。革兰氏阴性肠道致病菌Shigella是志贺菌病的致病因子，而志贺菌病是全球腹泻相关死亡的主要原因之一3。每年，中低收入国家的儿童中因志贺菌病导致大量发病和死亡4,5，而在高收入国家，感染通常与托儿所、食源性和水源性暴发有关6,7,8,9。疫苗研发效果不佳10以及抗菌药物耐药性（AMR）日益加剧11,12，使大规模Shigella疫情的防控更加复杂。美国疾病控制与预防中心近期数据显示，2020年美国近46%的Shigella感染病例表现出耐药性13,14，而世界卫生组织已将Shigella列为需要紧急开发新疗法的抗菌药物耐药优先病原体15。
志贺氏菌 感染极易传播 通过 通过摄入被污染的食物或水，或通过直接的人际接触，经粪-口途径传播。 志贺氏菌 已进化为一种高效的人类适应性病原体，仅需10-100个细菌即可引发疾病16小肠转运过程中， 志贺氏菌 暴露于环境信号，例如升高的温度和胆汁17检测到这些信号会诱导转录变化，从而表达毒力因子，增强细菌感染人结肠的能力17,18,19. 志贺氏菌 不会从肠上皮的顶膜表面侵入，而是被滤泡相关上皮内的特化抗原呈递微皱褶细胞（M细胞）摄取后，穿过上皮层进行转运20,21,22经转胞吞作用后， 志贺氏菌 细胞被常驻巨噬细胞吞噬。 志贺氏菌 迅速逃逸吞噬体并触发巨噬细胞死亡，导致促炎性细胞因子的释放5,23,24. 志贺氏菌 然后从基底侧侵入结肠上皮细胞，裂解巨胞饮泡，并在细胞质中建立复制微环境5,25促炎性细胞因子，尤其是白细胞介素-8（IL-8），可招募多形核中性粒细胞（PMNs）至感染部位，从而削弱上皮紧密连接，促进细菌侵入上皮层，加剧基底外侧感染。5中性粒细胞通过破坏受感染的上皮层以控制感染，从而导致杆菌性（血性）痢疾的典型症状。5尽管入侵和细胞内复制机制已被深入表征，但新近研究正在揭示该领域一些重要的新概念 志贺氏菌 感染，包括胃肠道（GI）通过期间的毒力调控17，黏附19，通过屏障通透性改善基底外侧通路26以及营养不良儿童中的无症状携带27.
其能力 志贺氏菌 引起腹泻性疾病的 spp. 仅限于人类和非人灵长类动物（NHP）28. 志贺氏菌 斑马鱼已开发出肠道感染模型29，小鼠30，豚鼠31，兔子21,32,33和猪34,35然而，这些模型系统均无法准确再现人类感染过程中观察到的疾病特征36. 尽管已建立志贺菌病的非人灵长类动物模型用于研究 志贺氏菌 发病机制，这些模型系统实施成本高昂，且需要人为较高的感染剂量，最高可达人类感染剂量的九个数量级37,38,39,40,41,42因此，这种显著的适应性 志贺氏菌 为感染人类宿主的研究需要使用人源性细胞培养物，以构建符合生理相关性的模型，从而对感染过程进行准确解析 志贺氏菌 发病机制
此处详细描述了测量速率的方法 志贺氏菌 HT-29 结肠上皮细胞的黏附、侵袭及胞内复制。利用这些标准化方案，可研究细菌毒力基因和环境信号影响上述每个步骤的分子机制 志贺氏菌 感染可用于深入探究宿主与病原体之间动态相互作用的关系。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES 滤膜</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>无菌聚醚砜滤膜，用于过滤灭菌最多 50 mL 培养基</td></tr><tr><td>14 mL 培养管</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>17 mm × 100 mm 聚丙烯带盖试管</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL 透明聚丙烯圆锥底离心管，带防漏盖</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>经表面处理，利于细胞最佳贴附</td></tr><tr><td>胆盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>胆酸与脱氧胆酸按 1:1 比例混合</td></tr><tr><td>刚果红染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>一种基于联苯胺的阴离子偶氮染料，&gt;85% 纯度</td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>与 Countess 自动细胞计数仪配合使用</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>一种高度极性的有机试剂</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM 添加了高浓度葡萄糖、丙酮酸钠、GlutaMAX 和酚红</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>经热灭活处理，无菌</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>储存液浓度为 50 mg/mL</td></tr><tr><td>HT-29 细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>腺癌细胞系，来源于结直肠</td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>实验室封口膜</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm × 15 mm 培养皿，用于固体培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1× 浓度；pH 7.4</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>从红藻细胞壁提取的多糖混合物，用于制备细菌培养平板</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>组织培养瓶</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>一种常用的非离子型表面活性剂和乳化剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>用于检测死亡的组织培养细胞；只有活细胞能够排斥该染料</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>用于细胞解离，适用于细胞系的维持与传代</td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>细菌生长培养基</td></tr></tbody></table>

使用志贺氏菌进行上皮细胞感染分析

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

人类适应的肠道致病菌 志贺氏菌 每年导致数百万例感染，对儿科患者的长期生长发育造成影响，并且是全球腹泻相关死亡的主要原因之一。感染后，病原体穿过胃肠道并侵染结肠上皮细胞，从而引发水样或血性腹泻。由于抗生素耐药性急剧上升，且目前尚无获批疫苗，因此建立标准化的研究方案对于深入研究这一严重病原体至关重要。本文介绍了一系列用于研究其分子致病机制的方法。 志贺氏菌 使用 体外 结肠上皮细胞中细菌黏附、侵袭及胞内复制的分析。在进行感染分析之前，毒力表型的 志贺氏菌 菌落通过在琼脂平板上吸收刚果红染料来验证。在细菌培养过程中，也可考虑使用添加了补充成分的实验室培养基以模拟 体内 条件下，采用标准化实验流程，将细菌细胞以既定的感染复数接种于培养板中的结肠上皮细胞，以感染结肠上皮细胞，并根据需要进行调整，以分析感染的各个阶段。对于黏附实验， 志贺氏菌 细胞在低培养基水平下孵育，以促进细菌与上皮细胞的接触。在侵袭和胞内复制实验中，均采用庆大霉素处理不同时间，以清除胞外细菌，从而评估细菌侵袭情况和/或定量胞内复制速率。所有感染实验均通过梯度稀释感染后的上皮细胞裂解液，将细菌菌落形成单位在刚果红琼脂平板上进行计数，并相对于接种滴度进行归一化，以分别定量黏附、侵袭和/或胞内细菌数量。上述方法可实现对感染各阶段的独立表征与比较 志贺氏菌 感染上皮细胞以成功研究该病原体。

通过黏附、侵袭和细胞内复制实验，比较了S. flexneri 2457T野生型（WT）与S. flexneri ΔVF（ΔVF）突变株的特性，后者被认为对Shigella的毒力具有负调控作用。由于Shigella利用胆盐作为调控毒力的信号分子17,18,47，实验在细菌于TSB培养基中继代培养后进行，同时设置了添加0.4%（w/v）胆盐的TSB培养基组18。继代培养过程中暴露于胆盐被视为一种预处理，用以模拟细菌在进入结肠感染前穿越小肠的生理过程17,18,47。图1分析了ΔVF突变对S. flexneri黏附HT-29结肠上皮细胞能力的影响。纵轴表示黏附率，即HT-29细胞裂解后回收的细菌数量与接种细菌数量的比值。如预期所示，无论与未添加胆盐的TSB相比，S. flexneri WT株和ΔVF突变株在添加胆盐的TSB中继代培养后，其黏附能力均显著增强18。然而，在相同继代培养条件下，WT株与ΔVF突变株在HT-29细胞上的黏附能力之间无显著差异。这些数据表明，ΔVF突变对S. flexneri在有或无胆盐预处理条件下黏附HT-29上皮细胞的能力均无影响。
在图2中，分析了ΔVF突变对S. flexneri侵袭（图2A）和在HT-29结肠上皮细胞内复制（图2B）能力的影响，实验包括经或未经胆盐预处理的条件。纵轴表示回收率百分比，其数值为HT-29细胞裂解后回收的细菌数量与接种细菌数量的标准化比值。在图2A中，野生型S. flexneri 2457T在经胆盐预暴露后侵袭HT-29细胞的能力出现预期的显著增强48，而S. flexneri ΔVF突变株在胆盐预暴露后的侵袭能力提升幅度较野生型菌株更小。与在TSB培养基中继代培养的野生型相比，ΔVF突变株对HT-29细胞的侵袭率更高；但在添加胆盐的TSB培养基中继代培养时，其侵袭率与野生型相似（图2A）。这些结果表明，ΔVF突变增强了S. flexneri侵袭HT-29细胞的能力，从而削弱了胆盐预处理的作用效果，尽管在胆盐培养后，ΔVF突变株的侵袭能力仍进一步提高。
总体而言，经过过夜培养后回收的细菌数量比培养90分钟时高出10倍（图2B vs 图2A），这分别体现了监测细胞内增殖与入侵能力之间的差异。当感染HT-29细胞后孵育18小时以允许细菌在细胞内复制（图2B）时，胆盐预处理对野生型（WT）和ΔVF菌株的影响均有所减弱。然而，ΔVF突变株在细胞内复制过程中对胆盐预处理的响应减弱更为显著。由于两种菌株在胆盐预处理后细胞内复制的增幅小于相同条件下入侵率的增幅，我们推测胆盐对S. flexneri致病过程的早期阶段影响更大。ΔVF突变株在两种继代培养条件下，从HT-29细胞中过夜复制后的回收率百分比均高于野生型（图2B）。然而，ΔVF突变株的回收率百分比在是否经过胆盐预处理的情况下基本相似。这些数据趋势表明，与野生型相比，ΔVF突变株在HT-29细胞内的复制效率更高，且胆盐预处理不影响ΔVF突变株的细胞内复制能力，而野生型则表现出受影响的现象（图2B）。由于在90分钟入侵实验中未观察到突变株与野生型菌株在胆盐预处理条件下的差异，我们推测被删除的VF基因所编码的产物可能也参与调控S. flexneri在HT-29细胞内的复制。综合两项分析结果表明，相对于野生型，ΔVF突变株具有更高的毒力，提示VF基因产物是S. flexneri毒力的负调控因子。
<img alt="细菌菌株黏附柱状图；TSB 与 TSB+BS；星号表示显著性差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：胆盐预处理促进 S. flexneri 对 HT-29 细胞的黏附。S. flexneri 2457T 野生型（WT）和 ΔVF 突变株在 TSB 培养基或添加 0.4% (w/v) 胆盐的 TSB 培养基（TSB+BS）中进行传代培养。随后以感染复数（MOI）为 100 的比例将细菌接种至 HT-29 细胞，孵育 3 小时以检测其黏附能力。孵育结束后，洗涤并裂解感染的 HT-29 细胞，对回收的细菌进行系列稀释后涂板，以计数每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。黏附细菌数量相对于接种细菌滴度进行归一化处理，以计算黏附百分率。数据代表一次生物学重复实验，包含三次技术重复（单个圆点）。误差线表示均值的标准误（SEM）。统计学显著性通过 Student's t 检验确定（*p &lt; 0.05；***p &lt; 0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图；比较不同培养条件下（TSB 与 TSB+BS）菌株的回收率百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：胆盐预暴露增强了野生型 S. flexneri 的侵袭能力及胞内复制能力。S. flexneri 2457T 野生型和 ΔVF 突变株分别在 TSB 或添加胆盐的 TSB 培养基（TSB+BS）中进行传代培养。随后将细菌以 MOI 为 100 接种至 HT-29 细胞，经离心沉降后，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，向 DMEM 中加入庆大霉素以裂解胞外细菌，从而特异性回收胞内细菌。在孵育 90 分钟（A，细菌侵袭）或 18 小时（B，胞内复制）后，收集感染的 HT-29 细胞并进行裂解，对回收的细菌进行系列稀释后涂板，以测定每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。将胞内细菌数量相对于接种菌量进行归一化处理，计算回收率百分比。数据代表一次生物学重复实验，每次包含三个技术重复（单个圆点）。误差线表示标准误（SEM）。统计学显著性通过 Student t 检验确定（*p &lt; 0.05）。请注意图中（A）与（B）两部分 y 轴刻度的不同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案描述了用于探究的感染实验方法 志贺氏菌 黏附、侵袭和细胞内复制 体外 上皮细胞系

人类适应的肠道致病菌志贺氏菌每年导致数百万例感染，在儿科患者中引发长期生长影响，……

志贺氏菌是一种重要的全球性病原体，每年导致严重的感染率。志贺氏菌感染胃肠道，引起腹泻或痢疾。我们的研究旨在增进对感染机制的理解，以帮助开发更有效的治疗手段，例如疫苗和其他抗菌产品。首先，动物模型和新兴的组织培养技术使我们能够更深入地了解志贺氏菌感染的生理过程，并真实再现人类胃肠道的复杂性。其次，对临床分离的志贺氏菌进行表征，有助于揭示该属细菌的多样性，鉴定重要的毒力基因，并加深我们对感染机制的理解。我们利用胆盐和葡萄糖等胃肠道信号分子，研究志贺氏菌如何在小肠中存活并完成迁移，以及如何调控其在大肠中感染时的毒力基因表达。我们已经阐明了志贺氏菌如何抵抗胆盐，并证明志贺氏菌可产生黏附蛋白，以帮助其与上皮细胞建立初始接触，从而启动感染。这些实验方案旨在研究志贺氏菌感染上皮细胞的关键环节，包括黏附、侵袭以及细胞内存活。我们使用标准的上皮细胞系进行这些实验，同时也已将这些方法优化并应用于目前可获得的复杂人源胃肠道模型。这些方案分别考虑感染的各个阶段，这对于理解志贺氏菌感染的关键步骤至关重要。同时，这些方案也强调了联合分析有助于从整体水平上更深入地理解志贺氏菌感染。将志贺氏菌菌株在含有刚果红染料的琼脂平板上重新划线培养，以确保菌落具有毒力，并防止在感染实验中使用无毒力的菌落。首先，取过夜培养的志贺氏菌培养物并涡旋混匀。将100微升培养物加入含有5毫升新鲜TSB的培养管中。在37摄氏度、250转/分钟振荡条件下培养，直至培养物在600纳米处的光密度达到0.7。将两次培养的志贺氏菌各10^8个菌落形成单位转移至2毫升微量离心管中。在室温下以17,000 ×g离心2分钟，使细胞沉淀。吸除上清液。加入一毫升预热的PBS，充分重悬沉淀。再次离心细胞后，将沉淀重悬于两毫升预热的DMEM中，并涡旋混匀细胞悬液。然后，向六孔板中每个HT-29结肠上皮单层细胞孔中加入一毫升重悬的志贺氏菌和一毫升DMEM。为确保细菌与HT-29细胞充分接触，将六孔板在室温或37摄氏度下以2,000 G离心10分钟。将六孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育45分钟。为测定细菌感染滴度，用PBS对重悬的志贺氏菌细胞进行10倍系列稀释。取100微升浓度为1×10⁻⁵和1×10⁻⁶的稀释液，分别接种到含有TSB的刚果红平板上，于37°C过夜培养。培养结束后，吸去每个孔中的培养基。向每个孔中加入1毫升预热的PBS，轻轻洗涤。然后每孔加入2毫升含50微克/毫升庆大霉素的温热DMEM，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。用1毫升PBS洗涤感染的HT-29细胞3次。每孔加入2毫升含庆大霉素的温热DMEM，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育长达24小时，以进行胞内复制。孵育结束后，用一毫升 PBS 将细胞洗涤两次。每孔加入含 1% Triton X-100 的一毫升 PBS，以裂解 HT-29 细胞。然后使用细胞刮棒或弯头移液器吸头，将裂解后的细胞从孔底刮下，并将混合液转移至 1.7 毫升微量离心管中。将每支试管涡旋至少30秒，以进一步使志贺氏菌从裂解的真核细胞中分离。用PBS对裂解液进行10倍系列稀释。取100微升系列稀释液接种于含TSB的刚果红平板上，37摄氏度过夜培养。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

志贺氏菌上皮细胞感染分析

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斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

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流式细胞术分离小鼠原代II型肺泡上皮细胞用于功能与分子研究

Entamoeba histolytica 感染所致上皮损伤的分析

学习志贺氏菌上皮细胞感染检测方法，利用体外细胞系研究其黏附、入侵和胞内复制机制。该方案有助于深入理解感染过程，为开发有效疫苗和治疗策略提供重要依据。

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