Name: 悬浮培养物生产和纯化腺相关病毒的碘克沙醇密度梯度离心用于体内应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: 学习碘克沙醇密度梯度离心法纯化腺相关病毒，用于定向进化筛选高趋向性衣壳。该方法可获得高纯度重组AAV，适用于基因治疗临床前体内应用研究。

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本实验方案中所用溶液和缓冲液的成分见表1。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td colspan="2">成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">AAV 裂解缓冲液</td>
			<td colspan="2">1.2 mL 5 M NaCl 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">80 µL 1 M MgCl2 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 mQ 水定容至 40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AAV 沉淀溶液</td>
			<td colspan="2">40 g PEG 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50 mL 5 M NaCl 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 mQ 水定容至 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">15% 碘克沙醇组分</td>
			<td colspan="2">7.5 mL OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 mL 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6 mL 5 M NaCl 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">30 µL 1 M MgCl2 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 mQ 水定容至 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">25% 碘克沙醇组分</td>
			<td colspan="2">12.5 mL OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 mL 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">30 µL 1 M MgCl2 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">60 µL 酚红溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 mQ 水定容至 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">40% 碘克沙醇组分</td>
			<td colspan="2">33.3 mL OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5 mL 10X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">50 µL 1 M MgCl2 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 mQ 水定容至 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">60% 碘克沙醇组分</td>
			<td colspan="2">50 mL OptiPrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">100 µL 酚红溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AAV 缓冲液溶液</td>
			<td colspan="2">8 mL 5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">20 µL 10% Pluronic F-68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">用 PBS 定容至 200 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用溶液的组分。
1. Expi293 细胞的三重转染
<ol>
	<li>以每毫升 5 × 105 个活细胞（vc/mL）的初始密度接种 Expi293 细胞（参见材料表）。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、8% CO2 及 125 rpm 摇床速度条件下培养，直至细胞密度达到 3–5 × 106 vc/mL。使用台盼蓝染色法结合自动细胞计数仪（参见材料表）监测细胞密度和活率。</li>
	<li>当细胞达到目标密度时，按 1:10 比例用新鲜培养基稀释，使总体积为原体积的 10 倍。如有需要，转移至更大规格的培养瓶中。继续放入培养箱中培养。</li>
	<li>按照步骤 1.2–1.3 所述方法继续扩增细胞，直至在 1 L 培养瓶中的 250 mL 培养基内达到至少 2 × 106 vc/mL 的细胞密度。</li>
	<li>转染前一天，将细胞用培养基稀释至 2 × 106 vc/mL，总体积为 250 mL，必要时弃去多余细胞。过夜培养。</li>
	<li>转染当天，取一半细胞在 18 °C 下以 58 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于等体积（125 mL）的新鲜培养基中。细胞活率应接近 98%。</li>
	<li>准备两个 50 mL 圆锥形离心管，分别标记为“PEI”和“DNA”。</li>
	<li>在标记为“PEI”的离心管中，将 1.2 mL PEI（聚乙烯亚胺，参见材料表）用 OptiMEM 培养基稀释至总体积为 12.5 mL。</li>
	<li>在标记为“DNA”的离心管中，配制等摩尔浓度的质粒 DNA 溶液，总 DNA 量为 500 µg，用 OptiMEM 培养基定容至 12.5 mL。</li>
	<li>将 DNA 溶液加入 PEI 溶液中，轻轻翻转数次以充分混匀，并在室温下静置孵育 10 分钟。 
	注意：为确保 PEI 与 DNA 形成带电复合物，DNA-PEI 溶液必须完整孵育满 10 分钟。</li>
	<li>DNA-PEI 溶液孵育 10 分钟后，使用移液管缓慢将 DNA-PEImax 混合液加入 Expi293 细胞中。将转染后的细胞放回培养箱，继续培养 72 小时（图 1）。</li>
</ol>
<img alt="细胞的荧光显微镜图像；光学激发，发射分析，100 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：转染后两天表达GFP的Expi293细胞。 使用含有GFP基因的质粒转染后，Expi293细胞瞬时表达eGFP。细胞形态呈圆形。图像的曝光时间为15 ms。显微镜图像采用配备落射荧光照明装置和10x/0.30物镜的倒置显微镜获取。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. rAAV 载体纯化
<ol>
	<li>72 小时后，将悬浮细胞转移至两个 250 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 415 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清培养基倒入一个新的 500 mL 锥形管中，置于 0 °C 冰上保存，用于后续处理。</li>
	<li>用 10 mL AAV 裂解缓冲液重悬每个细胞沉淀（表 1），将两份裂解液合并至其中一根管中。用额外的 5 mL AAV 裂解缓冲液冲洗另一根管，然后将冲洗液加入合并的裂解液中。于 -70 °C 冻存。 
	注意：实验可在此处暂停。建议将上清培养基于 -70 °C 冻存，而非置于冰上。</li>
	<li>向步骤 2.2 获得的上清培养基中加入 1:4 体积的 AAV 沉淀液。颠倒数次以充分混匀，并在 0 °C 冰上孵育至少 2 小时或过夜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 3000 × g 离心孵育后的溶液 1 小时。</li>
	<li>弃去上清，用 5 mL AAV 裂解缓冲液重悬含有病毒沉淀的沉淀物。</li>
	<li>将细胞裂解液在 37 °C 水浴中解冻。</li>
	<li>将病毒沉淀与细胞裂解液合并，得到粗裂解液。用额外的 5 mL AAV 裂解缓冲液冲洗原先盛有病毒沉淀的离心管，并将冲洗液并入粗裂解液中。</li>
	<li>将粗裂解液于 -70 °C 冻结，然后在 37 °C 解冻。重复此冻融循环一次。 
	注意：粗裂解液在 37 °C 的停留时间应尽可能短，仅限完成解冻所需时间。</li>
	<li>第三次解冻后，立即向粗裂解液中加入 4 µL 苯甲酸酶，颠倒混匀，在 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 18 °C 条件下以 650 × g 离心粗裂解液 10 分钟。</li>
	<li>将上清转移至洁净的 50 mL 锥形管中，此即粗病毒液。弃去沉淀。</li>
	<li>在 18 °C 条件下以 3000 × g 再次离心粗病毒液 30 分钟，以去除污染性蛋白。</li>
	<li>将上清转移至洁净的 50 mL 锥形管中，此即澄清病毒液。 
	注意：实验可在此处暂停。可将澄清病毒液于 -70 °C 冻存。</li>
	<li>安装多通道蠕动泵并连接四根蠕动管（见材料表）。在每根管的两端连接毛细管。</li>
	<li>将泵输入端的毛细管置于盛有去离子水的烧杯中，输出端的毛细管置于空烧杯中。以 25.0 rpm 运行蠕动泵，用去离子水冲洗管路。</li>
	<li>充分冲洗后，继续运行泵直至管路内仅充满空气，排空管路。将所有毛细管平放在洁净的无尘纸上。</li>
	<li>在泵输出端的支架上放置四个超速离心管。</li>
	<li>使用 10 mL 血清移液管，小心地将 10 mL 澄清病毒液加入每个超速离心管中，注意避免引入气泡。 
	注意：如有需要，每管澄清病毒液的体积可增至最多 12 mL。此时应相应减少步骤 2.25 中 60% 碘克沙醇的用量。</li>
	<li>使用蠕动泵，从最低密度到最高密度依次将碘克沙醇梯度液（表 1）铺置于澄清病毒液下方。先加入 15% 梯度液，随后依次为 25%、40% 和 60% 梯度液。将 22 mL（每超速离心管 5.5 mL）15% 碘克沙醇梯度液转移至洁净的 50 mL 锥形管中。将泵输入端的毛细管插入该管中，确保所有毛细管均接触管底。</li>
	<li>启动泵，使管路充满碘克沙醇梯度液。当碘克沙醇梯度液到达泵输出端毛细管末端时，停止泵。</li>
	<li>将一根输出端毛细管插入每个含有澄清病毒液的超速离心管中，确保毛细管接触管底。 
	注意：毛细管中不得残留空气。由于碘克沙醇在蠕动管中流动速度可能略有差异，因此在插入澄清病毒液前，必须确保每根输出端毛细管完全充满碘克沙醇。可能需要多次启停泵以实现此目的。</li>
	<li>启动泵，使超速离心管逐渐充满液体。当 15% 梯度液即将被吸入输入端毛细管时，停止泵。必须确保无气泡进入蠕动管路。 
	注意：若气泡进入输入端毛细管，可短暂反向运行泵以将其排出。</li>
	<li>将 22 mL（每超速离心管 5.5 mL）25% 碘克沙醇梯度液转移至 50 mL 锥形管中。确保所有毛细管接触管底，然后启动泵。当 25% 梯度液即将被吸入输入端毛细管时，停止泵。</li>
	<li>重复步骤 2.24，依次加入 20 mL（每超速离心管 5 mL）40% 碘克沙醇梯度液和 24 mL（每超速离心管 6 mL）60% 梯度液。</li>
	<li>若超速离心管中仍有未填充空间，继续加入 60% 梯度液，直至管内完全充满液体。</li>
	<li>加样至液面在管口形成凸面但不溢出为止。停止泵，小心移除每根输出端毛细管，注意不要扰动碘克沙醇梯度。</li>
	<li>为每个超速离心管加盖并插入垫片，装入 Type 70 Ti 转子（见材料表）。 
	注意：确保转子平衡。未经适当培训，不得操作超速离心机。</li>
	<li>将 Type 70 Ti 转子装入超速离心机，在 18 °C 条件下以 489,000 × g 离心 1 小时。</li>
	<li>离心结束后，从超速离心机中取出转子。使用尖嘴钳小心地从转子中取出每个超速离心管，注意不要扰动碘克沙醇梯度。</li>
	<li>使用带夹子的支架固定一根超速离心管。</li>
	<li>将 20 号针头连接至 5 mL 注射器，备用。用无尘纸擦去超速离心管盖。</li>
	<li>用针头在超速离心管管壁上穿刺，位置位于 40%-60% 碘克沙醇界面下方约 3 mm 处（图 2）。</li>
	<li>缓慢吸取界面及部分 40% 梯度层，避免吸取 40% 梯度层上部，总吸取量约为 4 mL。</li>
	<li>用手指堵住超速离心管顶部开口，拔出注射器，将吸取的 AAV 组分转移至 50 mL 锥形管中。将注射器弃入锐器盒，超速离心管弃去。</li>
	<li>对每个超速离心管重复步骤 2.31–2.35。</li>
	<li>用 AAV 裂解缓冲液将吸取的 AAV 组分稀释约两倍，终体积为 40 mL。</li>
	<li>按照步骤 2.16–2.17 所述方法冲洗蠕动管路。 
	注意：实验可在此处暂停。可将稀释后的 AAV 组分于 0 °C 保存过夜。</li>
	<li>将 20 mL 稀释后的 AAV 组分分别加入两个新的超速离心管中。</li>
	<li>进行第二轮碘克沙醇密度梯度离心时，仅使用 10 mL（每管 5 mL）40% 梯度液和 14 mL（每管 7 mL）60% 梯度液，按上述方法将稀释后的 AAV 组分铺置于梯度下方。重复步骤 2.29–2.36 进行超速离心和吸取。 
	注意：在存放蠕动泵和管路前，需按照步骤 2.16–2.17 所述方法用去离子水冲洗管路。</li>
</ol>
<img alt="密度梯度离心结果；试管中分层溶液显示大分子分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：碘克沙醇梯度，标注 40%-60% 碘克沙醇界面。（A）第一次碘克沙醇梯度。酚红被用于 40% 和 60% 碘克沙醇组分中，由于两组分间 pH 值不同，呈现不同颜色。箭头指示了注射器插入位置，以收集 rAAV 组分，该位置位于 40%-60% 碘克沙醇界面下方。 （B）第二次碘克沙醇梯度。此步骤仅使用 40% 和 60% 碘克沙醇组分。箭头指示了注射器插入位置，以收集 rAAV 组分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 缓冲液置换与病毒浓缩
<ol>
	<li>在获得第二轮碘克沙醇密度梯度离心的AAV组分后，用AAV缓冲液将其稀释两倍。</li>
	<li>通过向滤膜上方加入 20 mL AAV 缓冲液来平衡离心滤器。以 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。</li>
	<li>将稀释后的 AAV 组分加入离心过滤装置中。以 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。</li>
	<li>向滤膜上方加入 20 mL AAV 缓冲液。将装置在 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。 
	注意：若离心滤膜发生堵塞，导致溶液流过效率降低，可小心使用P200移液器在滤膜上方反复吸取溶液。务必注意不要使移液器吸头接触滤膜。</li>
	<li>重复步骤 3.4 两次。 
	注意：确保AAV浓缩过程中滤器顶部始终保留至少1 mL体积，以避免过度浓缩。可能需要调整离心时间以防止过度浓缩。若AAV过度浓缩，可能发生沉淀。</li>
	<li>最终滴度在10的范围内12 vg/mL，离心浓缩病毒至终体积约1 mL。 
	注意：根据所使用的血清型骨架及病毒的包装效率，您可能需要将病毒浓缩至较小体积。</li>
	<li>使用 p1000 移液器将浓缩的 AAV 从离心过滤器顶部转移至微量离心管中。使用 p200 移液器用 50 µL 加入AAV缓冲液以收集任何残留的病毒，并与其余浓缩的AAV合并。</li>
	<li>暂置一旁 2 µL 用于滴度测定的浓缩 AAV 分装样品。参见 补充表1 查看可用于qPCR的ITR引物。</li>
	<li>将浓缩的 AAV 通过一个 0.2 µm 使用注射器滤器进行灭菌。 
	注意：对小体积样品进行灭菌时，应选择小直径的注射器滤器，以尽量减少病毒损失。使用小直径的低蛋白结合滤器可将病毒损失降至最低（数据未显示）。</li>
	<li>灭菌后的 AAV 可立即用于转导细胞，或保存于 4 °C 四周期间使用。应于 -70 °C 用于长期保存。</li>
</ol>

AAV Isolation by Double Iodixanol Density Gradient Centrifugation

<ol><li>Strauss, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onasemnogene+abeparvovec+for+presymptomatic+infants+with+three+copies+of+SMN2+at+risk+for+spinal+muscular+atrophy%3A+the+Phase+III+SPR1NT+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial.</a> Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).</li>
<li>Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+update+on+AAV-based+gene+therapy+clinical+trials+for+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration.</a> BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).</li>
<li>George, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiyear+factor+VIII+expression+after+AAV+gene+transfer+for+hemophilia+A%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A.</a> N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biodrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
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<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
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</ol>

作者无任何披露事项需要报告。

双碘海醇密度梯度纯化法是一种通用方法，因其适用于所有腺相关病毒（AAV）突变体，而不论其受体特异性如何。早期的AAV纯化方法依赖于病毒颗粒的密度，包括在氯化铯（CsCl）中进行等密度离心以及连续蔗糖密度梯度离心19。随后，发展出针对特定血清型的方法，利用结合在Sepharose柱上的单克隆抗体进行纯化20。1999年开发出一种基于密度的新型纯化方法，采用不连续的碘海醇梯度，所得AAV的感染性高于从CsCl梯度中分离的病毒21。进入21世纪初，AAV纯化方法继续发展，一些研究团队采用高效液相色谱法纯化重组AAV（rAAV），从粗裂解液中回收率超过70%22,23,24。这些方法至今仍用于大规模生产工艺中25。尽管色谱法在AAV分离中已取得进展，碘海醇密度梯度离心纯化法因其成本较低且不依赖血清型，仍被广泛使用26,27。
尽管该方法适用于rAAV的高效、快速临床前制备，但其在可扩展性以及适应cGMP生产方面存在显著局限性25。因此，如上所述，大规模生产更倾向于采用其他纯化方法。此外，rAAV载体的转基因容量也有限。研究表明，能够被完整包装的AAV基因组大小上限约为5.2 kb，扣除ITR序列后，转基因的最大尺寸为4.9 kb6。这使得cDNA长度超过该限制的蛋白质表达变得复杂。对于此类蛋白质，若不改造转基因本身或采用分裂载体系统，则无法通过本文所述系统进行表达。Chamberlain等描述了多种表达大于4.9 kb转基因的方法28。
该方法特别适用于构建高复杂度的组合衣壳文库，可产生因衣壳表面突变而导致生化特性各异的腺相关病毒（AAV）衣壳。如果制备的重组腺相关病毒（rAAV）将用于动物注射，尤其是非人灵长类动物，必须严格限制内毒素污染。应特别注意将用于培养细菌的区域与rAAV制备区域分开，以防止在所有操作步骤中发生细菌污染。所有涉及人源细胞和粗制AAV的操作均应在生物安全柜中进行，并使用一次性塑料耗材。这不仅可以防止细菌污染，而且对于AAV操作至关重要，因为AAV属于生物安全等级1（BSL1）的病原体。
如果实验室无法使用带摇床的CO2培养箱，可用贴壁培养的HEK293细胞替代Expi293悬浮细胞培养。传代操作请遵循试剂盒说明书，并采用Crosson等（2018）17中所述的转染方案。
本方案中的关键步骤包括Expi293细胞转染、碘克沙醇梯度的制备，以及含有AAV的碘克沙醇组分的吸取。这些步骤中的任何错误都可能导致重组腺相关病毒（rAAV）产量不理想，或无法成功产生rAAV。
转染Expi293细胞是本方案中生产重组腺相关病毒（rAAV）的关键步骤。在转染当天，细胞被重悬于一半体积的新鲜培养基中，以提供细胞从转染应激中恢复所需的营养物质29；转染过程对细胞具有很高的代谢负担。然而，条件培养基并未完全弃去，因为它含有对细胞维持和生长至关重要的生长因子及其他代谢产物。PEI与DNA必须在加入细胞前充分孵育整整十分钟，以形成带电复合物30。若DNA未能与PEI形成复合物，则无法被细胞高效摄取。
在生产重组腺相关病毒（rAAV）时，病毒在培养基中的比例取决于特定血清型与Expi293细胞受体的相互作用。某些血清型释放到细胞培养基中的速率高于其他血清型31，因此需要从细胞培养基中沉淀病毒颗粒，以获得尽可能高的产量，并防止因对Expi293细胞受体缺乏亲和力而导致某些变异体丢失。相比之下，AAV2血清型与293细胞中存在的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体具有强相互作用，因此培养基中几乎检测不到包装好的病毒32。在生产AAV2的衍生物时，应省略聚乙二醇（PEG）沉淀步骤。而在制备组合衣壳文库或非AAV2血清型的rAAV时，则适合使用PEG沉淀病毒颗粒。
在15%碘克沙醇组分中必须存在1 M氯化钠，以在超速离心过程中解离聚集的腺相关病毒（AAV）颗粒。若该组分中缺少氯化钠，可能导致转导效率降低和免疫原性增强等不良后果33。最后，在从碘克沙醇梯度中吸取AAV时需格外小心。若吸取过多碘克沙醇组分，最终产物中可能出现空衣壳颗粒17。
该方法可用于包装rAAV组合衣壳文库，以用于下游的定向进化实验，从而筛选出对特定人类细胞类型具有更高趋向性的衣壳。rAAV在4 °C下可短期保存，在-70 °C下可长期储存34。目前，重组AAV已用于五种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物中，用于治疗包括杜氏肌营养不良症在内的多种疾病35,36,37。此外，还有多种rAAV疗法正处于临床及临床前试验阶段38,39,40。因此，对该载体的进一步研究对于开发更多基因疗法至关重要。

重组腺相关病毒（rAAV）载体是治疗遗传性疾病（包括脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良和A型血友病）的常用工具1,2,3。rAAV载体经过改造，去除了野生型AAV中存在的病毒基因；野生型AAV是一种小型无包膜的二十面体病毒，含有长度为4.7 kb的线性单链DNA基因组4。AAV最早于20世纪60年代在腺病毒制备物中被发现，当时作为一种污染物5。尽管其衣壳较小，限制了可包装的转基因大小（不含ITR时最大为4.9 kb）6，但AAV仍是一种有效的转基因递送载体，因其对人类无致病性，可在多种分裂和非分裂细胞类型中实现转基因表达，并且免疫原性较弱7。
作为依赖性细小病毒属（dependoparvovirus）的成员，重组腺相关病毒（rAAV）的生产依赖于腺病毒或单纯疱疹病毒中存在的辅助基因的表达8。目前已开发出多种rAAV的生产策略，其中在携带腺病毒E1A/E1B辅助基因的HEK293细胞中进行生产是当前最成熟且广泛应用的方法9。rAAV生产的一般流程始于将三种质粒共转染至HEK293细胞：分别包含位于反向末端重复序列（ITRs）内的目的基因、AAV的rep和cap基因，以及额外的腺病毒辅助基因。转染后72小时，收集细胞并进行处理，以纯化含有目的基因的rAAV。
在开发用于治疗目的的新型重组腺相关病毒（rAAV）载体过程中，一个主要目标是提高载体的转导效率。提高靶细胞的转导效率意味着临床所需rAAV剂量的减少，从而降低从抗体介导的中和反应到急性毒性等不良免疫原性反应的发生可能性10,11为了提高重组腺相关病毒（rAAV）载体的转导效率，可对包装的基因组或衣壳进行改造。调节转导效率的有效方法 通过 包装基因组设计包括引入强效且组织特异性的启动子、精心选择mRNA加工元件，以及优化编码序列以提高翻译效率12对衣壳的改造旨在增强其对靶向人细胞类型的嗜性。在开发新型重组腺相关病毒（rAAV）转基因递送载体衣壳的研究中，通常主要采用两种策略：一是通过对AAV衣壳进行理性设计，引入特定突变以靶向特定细胞受体；二是利用高复杂度的组合衣壳文库进行定向进化，从中筛选出对特定细胞类型具有嗜性的衣壳，而不针对单一特定受体（尽管有部分研究团队将这两种方法结合使用）。13,14,15在定向进化方法中，利用特定血清型骨架并在衣壳外表面的可变区域引入突变，构建组合式衣壳文库。16组合式衣壳文库通常由非人类来源的AAV血清型构建，从而降低临床应用中预先存在的免疫反应风险10因此，适用于所有血清型的纯化方法是理想选择，可避免针对这些文库所用的、作为骨架的较少见血清型进行特异性优化。
碘克沙醇密度梯度离心法可用于纯化高滴度且具有高感染活性的重组腺相关病毒（rAAV）17。本方案采用悬浮细胞培养方式生产rAAV，以减少大量制备AAV时所需的人工操作。方案中还包括一步离心处理，用于澄清细胞裂解液，以减少污染性蛋白的存在，并降低病毒沉淀的风险。该方法是一种经济有效的策略，可制备适用于临床前研究的高纯度rAAV制剂。

<table><tbody><tr><td>5810 R 台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>8通道蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Watson-Marlow</td><td>020.3708.00A</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>NanoEntek</td><td>EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E 高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>苯并酶（Benzonase）</td><td>Thermo Scientific</td><td>88701</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>322491101</td><td></td></tr><tr><td>带摇床的CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>设定为8% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>一次性微量移液器</td><td>Fisherbrand</td><td>21-164-2G</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>不含CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）(10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ts2R-FL 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expi293 表达培养基</td><td>Gibco</td><td>A1435101</td><td></td></tr><tr><td>Expi293F 细胞</td><td>Gibco</td><td>A14527</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td>1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>带滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>带滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td>20 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>带滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1121-3810</td><td>10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>皮下注射针头</td><td>Tyco Healthcare</td><td>820112</td><td>20 GA x 1-1/2 A</td></tr><tr><td>带盖冰桶</td><td>VWR</td><td>10146-184</td><td></td></tr><tr><td>JS-5.3 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁溶液（1 M）</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>金属支架和夹具&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>05-769-6Q</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22600028</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>尖嘴钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质（碘克沙醇）</td><td>Serumwerk</td><td>AXS-1114542</td><td>60% 碘克沙醇溶液</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P2 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td></td></tr><tr><td>酚红&amp;nbsp;溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP 移液控制器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pCapsid</td><td>De novo 或 Addgene 等&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>我们使用了 pACGrh74。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>质粒 pHelper</td><td>Addgene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pTransgene</td><td>De novo 或 Addgene 等&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>我们使用了 pdsAAV-GFP。</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 聚醇溶液（10%）</td><td>Mp Biomedicals</td><td>92750049</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>Research Products International</td><td>P48080-500.0</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺盐酸盐 Max（PEI-Max）</td><td>Polysciences</td><td>NC1038561</td><td>用水稀释至 40 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管，无菌</td><td>Corning</td><td>431123</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管，无菌</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>聚丙烯 Optiseal 管</td><td>Beckman Coulter</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP250-B</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP225-B</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP210-B</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Alkali Scientific</td><td>SP205-B</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>摇瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV1000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>摇瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV50-0</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>摇瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV250</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>摇瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>PBV12-5</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>氯化钠溶液（5 M）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1752640</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器</td><td>Fisherbrand</td><td>14-955-458</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>0.22 微米</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.5（1 M）</td><td>Kd Medical</td><td>RGE3363</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>离心管架组件</td><td>Beckman Coulter</td><td>361646</td><td></td></tr><tr><td>管间隔件（x4）</td><td>Beckman Coulter</td><td>361669</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵用管路</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190516</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti 型固定角钛转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td></td><td></td><td>设定为 -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 离心浓缩器</td><td>Sartorius</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>设定为 37 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

本方案描述了通过碘克沙醇密度梯度离心法生产与纯化重组腺相关病毒（rAAV）的方法，这是一种不依赖血清型的AAV纯化技术，最早于1999年被报道。重组腺相关病毒载体广泛应用于基因治疗中，用于将转基因递送至多种人类细胞类型。在本研究中，通过将编码转基因、载体衣壳和腺病毒辅助基因的质粒转染悬浮培养的Expi293细胞来产生重组病毒。碘克沙醇密度梯度离心法依据病毒颗粒的密度对完整的AAV颗粒进行纯化。此外，该目前已被广泛应用的方法包含三个额外步骤，分别用于提高病毒总产量、降低因污染蛋白导致沉淀的风险以及进一步浓缩最终病毒产物：使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠溶液从细胞培养上清中沉淀病毒颗粒、进行第二轮碘克沙醇密度梯度离心，以及通过离心过滤装置进行缓冲液置换。via该方法可稳定获得滴度达1012病毒颗粒/mL、纯度极高的病毒制剂，适用于in vivo实验。

该方法可用于获得至少10的滴度12 每毫升病毒颗粒数。可获得滴度（图3) 通过使用提供的ITR引物进行qPCR检测 补充表1，通过 ddPCR 或任何其他滴定方法。使用次优滴度可能导致 帽 编码衣壳蛋白的基因，其包装效率较低。
另一个可能导致结果不理想的原因是Expi293细胞的转导效率较低。建议在转染当天，细胞密度保持在3-4 × 106 vc/mL，并且细胞活力接近98%。在本研究中，作者按照此方案获得的病毒滴度为1.07 × 1012 vg。该产量与此前包装AAVrh7418所获得的产量一致。
<img alt="qPCR 扩增曲线和标准曲线；示意图；SYBR 检测；循环定量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66460/66460fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过 qPCR 测定滴度。 曲线 1 由 3.66 × 1011 vg/mL 的标准浓度生成，曲线 2 由 3.66 × 1010 vg/mL 的标准浓度生成，曲线 3 为最终浓缩的 AAV 样品，曲线 4 由 3.66 × 109 vg/mL 的标准浓度生成，曲线 5 由 3.66 × 108 vg/mL 的标准浓度生成。每个 qPCR 反应均设两个重复。(A) qPCR 扩增曲线。标准品通过 ddPCR 定量的 AAV 标准品进行系列稀释制备。未稀释标准品的浓度为 3.66 × 1012 vg/mL。(B) 由 qPCR 生成的标准曲线。所制备的 AAV 浓度确定为 1.85 × 1011 vg/mL（总体积 5.75 mL），总产量为 1.07 × 1012 vg。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/66460fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：AAV 反向末端重复序列（ITRs）的正向和反向引物序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66460/supplementarymaterial.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内 实验应用。

本方案描述了通过碘克沙醇密度梯度离心法进行重组腺相关病毒（rAAV）的生产与纯化，一种……

我们采用定向进化方法，筛选对特定人类细胞类型具有更高趋向性的腺相关病毒衣壳。通过此项研究，旨在开发出转导靶细胞效率更高、在基因治疗领域更具临床应用价值的重组腺相关病毒载体。我们课题组近期通过引入天然具有较低肝趋向性的腺相关病毒血清型的衣壳残基，成功使多种AAV血清型对肝脏的靶向性降低。如果能够成功扩展到更多血清型，这将为通过外周注射降低rAAV临床使用剂量并减少患者不良反应奠定基础。碘克沙醇纯化方法虽然成本较低，但难以实现规模化放大。此外，在后续应用中，定向进化方法通常通过动物模型或体外实验进行。因此，通过定向进化分离的衣壳在人体内对靶标的转导效率可能不如在临床前模型中那样显著。本方案成本低廉，适合规模较小的实验室采用。此外，该方法可获得高纯度的重组腺相关病毒，可用于后续临床前的体内应用。首先，从培养的细胞中获取澄清的病毒。将超速离心管放置在多通道蠕动泵输出端的支架上。使用刻度移液管，小心地将10毫升澄清病毒分装至每根超速离心管中。然后将15%碘克沙醇组分的22毫升转移至一个洁净的50毫升锥形管中。将毛细管的右端放入泵的管中，并启动泵。当碘克沙醇组分到达泵输出端毛细管末端时，停止泵的运行。将输出毛细管插入每支含有澄清病毒的超速离心管中，并启动泵。当15%的组分即将被吸入输入毛细管时，停止泵。接下来，将25%碘克沙醇组分中的22毫升转移至50毫升锥形管中。开启泵后，让整个组分进入进样毛细管，然后停止泵。如有需要，可添加更多60%组分，将每根管子加至裂解液在管口形成弯月面但不溢出为止。停止泵，并小心移除出样毛细管。用垫片盖紧超速离心管，并将其装入70 Ti型转子中。离心后，将超速离心管固定在支架上。使用无绒布擦拭去除超速离心管的管帽。然后将一支20号针头连接到5毫升注射器上，将针头刺入超速离心管管壁，位置位于40%与60%碘克沙醇界面下方约3毫升处。缓慢吸取界面层及部分40%组分。用一根手指堵住超速离心管的开口端，拔出注射器，将吸取的AAV组分转移至50毫升锥形管中。最后，用AAV裂解缓冲液将吸取的病毒组分稀释至原体积的二分之一，总体积为40毫升。冲洗蠕动泵管路后，将20毫升稀释后的AAV组分加入新的超速离心管中，进行第二轮分步离心。

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