Name: 从生肉中检测和分离弯曲 杆菌 属 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 学习从生肉中快速分离弯曲杆菌的高效方法，该方案可将分离时间缩短24小时并减少子采样误差。此方法已成功分离超过50株菌株用于基因组研究，对食品安全和公共卫生具有重要意义。

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本研究由美国农业部农业研究局（USDA-ARS）国家项目108资助，当前研究信息系统编号为8072-42000-093和8072-42000-094-000-D。本文中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，不构成美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

与本实验方案相关的所有操作均应在生物安全柜（BSC）内进行，以维持无菌条件，并最大限度降低样本污染或操作人员暴露于微生物病原体的风险。当样本需转移出生物安全柜时，应使用密封容器，以防意外跌落时发生泄漏，从而保持样本完整性。建议在整个操作过程中使用一次性耗材，以减少交叉污染的可能性。在无法使用一次性物品的情况下，应确保所有设备和材料在使用前均处于无菌状态。妥善的废弃物管理至关重要；所有使用过的一次性耗材均应作为生物危害废物处理。丢弃前应对材料进行高压灭菌，以确保彻底灭菌，避免潜在有害物质的扩散。遵循这些预防措施不仅可保护样本的完整性，还能最大限度降低操作人员接触微生物病原体的风险。图1展示了样本制备、选择性增菌、基于滤膜的分离以及Campylobacter菌种的mqPCR鉴别的工作流程。补充文件1提供了该过程中更详细的工作流程及各阶段的图像。
1. 肉类样品的制备
<ol>
	<li>获取肉样
	<ol>
		<li>从当地零售商处获取多种新鲜肉类包装样品，包括鸡腿、鸡翅、鸡腿肉和鸡肝。</li>
		<li>将所有样品转移至4 °C条件下储存，并在收到后24小时内进行处理。 
		注意：将新鲜样品储存在更低温度下（例如冷冻以下）会影响回收效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理肉样
	<ol>
		<li>按照FSIS采样指南中规定的组分比例进行操作6,17。</li>
		<li>从每个包装中切取450 g鸡肉样品，放入均质袋中（参见材料表）。 
		注意：推荐使用均质袋，因其具有足够的机械强度以确保后续操作顺利进行，不会破裂或泄漏。</li>
		<li>制备缓冲蛋白胨水（BPW）。
		<ol>
			<li>将20 g粉末（参见材料表）溶解于1 L纯水中。在121 °C下高压灭菌15分钟。用无菌水稀释至0.1%浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向装有鸡肉的均质袋中加入200 mL 0.1% BPW。</li>
		<li>用手从均质袋外部按摩/揉捏样品2分钟。</li>
		<li>使用电动移液控制器（参见材料表）从袋的滤膜一侧收集全部鸡肉冲洗液。</li>
		<li>将鸡肉冲洗液转移至无菌离心管中，在室温下以10,000 x g离心10分钟。</li>
		<li>使用电动移液控制器和25 mL一次性塑料刻度移液管小心收集上清液，避免扰动沉淀物。</li>
		<li>根据需要重复此步骤，确保完全去除所有上清液。</li>
		<li>弃去收集的上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.&#160;从生肉中选择性富集 Campylobacter 细菌
<ol>
	<li>添加补充剂的博尔顿肉汤的制备
	<ol>
		<li>将13.8 g粉末（见材料表）溶解于500 mL纯化水中。在121 °C条件下高压灭菌15分钟，对肉汤进行灭菌。</li>
		<li>向已灭菌的500 mL博尔顿肉汤中加入25 mL脱纤维马血（见材料表）。 
		注意：添加马血可作为氧气淬灭剂，有助于从食品基质中恢复受损的Campylobacter细胞。</li>
		<li>用5 mL 50%乙醇重悬1瓶抗生素补充剂（头孢哌酮、放线菌酮、甲氧苄啶和万古霉素，见材料表）。</li>
		<li>将重悬后的抗生素补充剂加入博尔顿肉汤中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>增菌程序
	<ol>
		<li>将沉淀物重悬于50 mL含有脱纤维马血和抗生素的博尔顿肉汤中。</li>
		<li>将样品（瓶盖松开）放入密封容器内，容器内维持85% N2、10% CO2和5% O2的气体混合环境。
		<ol>
			<li>确保瓶盖松动，但容器密封严密，以满足Campylobacter的微需氧和嗜热生长条件。 
			注意：当无环境培养舱时，可使用能维持85% N2、10% CO2和5% O2气氛的气体发生包。</li>
			<li>在42 °C条件下孵育样品24小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从生鸡肉中分离和纯化 C. jejuni 和 C. coli
<ol>
	<li>制备布鲁氏菌琼脂平板
	<ol>
		<li>将 28 g 布鲁氏菌粉末（参见材料表）溶解于 1 L 纯化水中。将 15 g 琼脂溶解于该布鲁氏菌溶液中。</li>
		<li>在 121 °C 条件下高压灭菌 15 分钟，对布鲁氏菌琼脂进行灭菌。将培养基与琼脂的混合物置于 55 °C 水浴中冷却。</li>
		<li>向每个直径为 100 mm 的培养皿中倒入 20 mL 布鲁氏菌琼脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤法与菌落培养
	<ol>
		<li>通过在生物安全柜中将布鲁氏菌琼脂平板的盖子打开 0 h、1 h、2 h 和 3 h 以干燥平板，评估湿度对Campylobacter通过滤膜的影响。</li>
		<li>设置无滤膜对照组，直接将 80 µL 样品涂布于布鲁氏菌琼脂平板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将醋酸纤维素滤膜（0.45 µm 或 0.65 µm 孔径，参见材料表）置于布鲁氏菌琼脂平板中央。</li>
	<li>向每张滤膜上用移液器滴加 4 滴样品，每滴 20 µL。
	<ol>
		<li>将液滴滴加在滤膜中心附近，确保液体穿过滤膜而非从滤膜周围流下，从而接触平板。</li>
		<li>滴加方式应确保液滴不会扩散并聚集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下孵育 15 分钟，然后小心移除滤膜。 
	注意：此步骤可为Campylobacter细胞穿过膜并到达琼脂培养基提供足够时间，同时避免过度干燥。</li>
	<li>在前述描述的微需氧条件下，于 42 °C 孵育平板约 24 小时。</li>
	<li>挑选具有特定特征的Campylobacter菌落。 
	注意：Campylobacter菌落通常呈圆形，边缘光滑，有光泽，呈半透明淡黄色或淡粉色6。</li>
	<li>将菌落划线接种至布鲁氏菌琼脂平板进行纯化。重复此步骤，直至获得具有单一且一致菌落形态的平板。</li>
	<li>制备用于长期保存的样品。
	<ol>
		<li>按前述方法制备Bolton肉汤。从具有均一菌落形态的平板上挑取一个菌落加入其中。</li>
		<li>在前述描述的微需氧条件下过夜（24 小时）培养。将 900 µL 过夜培养物加入含有 100 µL DMSO 的 2 mL 冻存管中。</li>
		<li>在干冰-乙醇浴（约 -72 °C）中快速冷却 10 分钟，然后转移至 -80 °C 超低温冰箱中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 鉴定 C. jejuni 和 C. coli 物种
<ol>
	<li>使用先前开发的多重qPCR（mqPCR）检测方法对空肠弯曲菌（C. jejuni）和结肠弯曲菌（C. coli）进行种水平鉴定18,19。
	<ol>
		<li>在96孔板中进行快速细胞裂解和基因组DNA提取。 
		注：强烈建议考虑使用商业试剂盒（见材料表），以确保样本充分去除已知的PCR抑制物。
		<ol>
			<li>将纯化的弯曲菌（Campylobacter）菌落分散至100 µL提取液中。</li>
			<li>在热循环仪中于99 °C裂解10分钟，随后在20 °C冷却2分钟。</li>
			<li>在室温下以8,000 x g离心10分钟。取上清液2 µL用于mqPCR检测。</li>
			<li>配制20 µL反应体系，包含10 µL 2x主混合液、2.0 µL DNA样本、104拷贝的内参扩增对照（IAC）模板，以及每种引物和探针各200 nM（见材料表）。 
			注：hipO和cdtA的引物与探针分别为空肠弯曲菌（C. jejuni）和结肠弯曲菌（C. coli）的特异性靶基因。&#160;内参对照（IAC）包含一段79 bp的人腺病毒DNA片段，作为阳性对照，用于确保所有样本中DNA聚合酶活性的一致性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所有样本以三复孔形式加入带光学膜的96孔光学反应板中，并放入实时荧光定量PCR系统（见材料表）。
		<ol>
			<li>在95 °C进行10分钟的热启动以激活DNA聚合酶。&#160;随后进行40个循环：95 °C变性15秒，60 °C退火/延伸1分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞悬液计数
<ol>
	<li>使用6 x 6滴板法对细胞悬浮液进行计数20。有关6 x 6滴板法的图像，请参见补充文件1。</li>
	<li>将布鲁氏菌琼脂平板在超净工作台中打开盖子晾干45分钟。</li>
	<li>将200 µL细菌悬液加入96孔板第一列的六行（A-F）中。</li>
	<li>在其余各列（2-12列）的六行中每行加入180 µL布鲁氏菌培养基。</li>
	<li>使用20 µL移液进行十倍系列稀释。
	<ol>
		<li>例如，将20 µL样品从第一列转移至第二列。&#160;此操作至少重复6列。</li>
		<li>每次转移后更换枪头，用移液器反复吹打混匀各悬液10次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多通道移液器将每列六行中的菌液各取7 µL滴加到布鲁氏菌琼脂平板表面。</li>
	<li>重复操作形成6 x 6阵列，确保每行在不同列之间为技术重复。</li>
	<li>将平板晾干5分钟，然后倒置平板。在42 °C下孵育24小时。</li>
	<li>计数每个代表性稀释度中的菌落数量。</li>
</ol>

Enhanced Campylobacter Isolation from Meat

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</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

该实验方案的意义 
C. jejuni 和 C. coli 是在家禽22以及动物肝脏23,24中检出的主要 Campylobacter 菌种。在本研究中，鸡肉部位（腿、翅、大腿）、鸡肝和牛肝的肉样在不同时间段内从不同的零售商店和生产商随机采集，用于分离Campylobacter spp.。在总共分离出的49株Campylobacter中，36株被鉴定为C. jejuni，13株为C. coli，未发现其他Campylobacter菌种，该结果与其他报道一致25。
该检测基于Campylobacter spp. 的螺旋形细胞形态及其特有的螺旋钻动式运动方式。一种简单而有效的被动过滤技术26,27，利用了Campylobacter的螺旋形细胞形态（细长，0.2–0.9 × 0.5–5 µm）以及强烈的螺旋钻动能力，从而将其从背景微生物混合物中分离出来。由于Campylobacter具有高度运动性，细胞能够穿过膜滤器并向琼脂培养基中适宜的环境迁移，而肉类样品中的其他背景微生物则无法通过滤膜。该方法成本相对较低、操作快速且具有选择性，适用于多种环境，包括食品加工设施、临床实验室和科研实验室。
一篇常被引用的开创性文章指出，0.45 µm 滤膜效果极佳，因此未对 0.65 µm 滤膜进行评估28。本研究的结果表明，0.65 µm 孔径滤膜的表现显著优于 0.45 µm 孔径滤膜，使富集后回收的细胞数量增加了 29 倍。这一点非常重要，因为所选用的滤膜并未表现出此前报道中所提及的选择性降低问题29。此外，已知与直接涂布法相比，过滤会显著减少回收的Campylobacter数量30，因此增大滤膜孔径有助于提高该微生物的回收率，这一发现与先前报道的结果一致21。这一结果具有重要意义，因为所有穿过滤膜的细胞均形成了形态均一的Campylobacter菌落，表明两种滤膜均能有效阻止其他微生物群落和食物颗粒通过。此外，FSIS 流程图7指出，由于需在含抗生素的 Campy-Cefex 平板上对分离物进行再次划线培养，可能导致结果出具时间延长。相比之下，本文所述的方案结合了过滤与选择性富集，使用头孢哌酮（cefoperazone）、放线菌酮（cycloheximide）、甲氧苄啶（trimethoprim）和万古霉素（vancomycin），无需进行再次划线培养。
当前采用的方法与食品安全检验局（FSIS）的抽样和验证程序保持一致17. 随着水平的 弯曲杆菌 污染水平可能较低（153 CFU/450 g 鸡肉），因此通过离心将冲洗液浓缩四倍，以提高检测的灵敏度。将冲洗液浓缩4倍后，样品富集48小时，并使用分子检测系统（Molecular Detection System, MDS）进行筛查，以复制FSIS实验室所采用的方法（数据未显示）。值得注意的是，本方法在24小时内从未遗漏过经分子检测系统在48小时富集后检出的阳性菌株（数据未显示）。最后，该方案的另一优势在于，其可提供与细菌种类相关的信息，并确定是否存在特定的 弯曲杆菌 是 C.coli, C. jejuni或 C. lari，而MLG 41.07中采用的MDS仅能提供二元的阳性/阴性反应结果 弯曲杆菌.
关键步骤 
Campylobacter 分离与鉴定的操作流程在离心、过滤和分子分析过程中必须精确。准确的稀释倍数、适当的培养条件以及严格遵循qPCR检测条件，对于可靠的物种鉴定至关重要。
作为一种微需氧细菌，Campylobacter 非常脆弱，对多种环境胁迫高度敏感，且需要特殊的苛养条件才能生长31,32,33。在通常经历长时间运输和储存的食品样品中，许多 Campylobacter 细胞可能处于休眠状态或亚致死/致死性损伤状态34,35。因此，从食品基质中有效复苏这些受胁迫的细胞并使其增殖至较高浓度至关重要。在本实验流程的第一步中，我们使用添加了溶血马血和抗生素的 Bolton 肉汤，以实现从食品中选择性增菌 Campylobacter。添加的血液可作为氧清除剂，以减轻游离氧自由基的不利影响36。抗生素则用于抑制背景微生物群的生长37。
为了尽量缩短Campylobacter暴露于环境大气氧的时间，选择15分钟的孵育时间，以允许细胞穿过滤膜。此外，滤膜下方布鲁氏菌琼脂平板的湿度在细胞通过速率中起着重要作用。具体而言，对干燥0 h、1 h、2 h和3 h的琼脂平板进行测试的结果表明，滤膜中过高的水分含量会阻碍细胞穿过。同样关键的是滤膜及液滴在平板和滤膜上的精确放置位置，二者均会影响细胞分离的成功率。
潜在的陷阱和局限性 
尽管本方案提供了从生鸡肉样本中分离和鉴定Campylobacter物种的系统性方法，但仍有一些局限性值得注意。外部污染、平板干燥不充分、滤膜堵塞阻碍微生物迁移、微生物被困在沉淀物中、厌氧培养盒密封不完全以及液滴扩散超出滤膜边界等，均属于主要的技术陷阱。
微生物与食品表面分离不充分，或微生物被限制在样品本体内部，可能会阻碍通过本方法实现其分离。此外，依赖微生物的运动能力穿过被动滤膜存在明显局限性；有可能某些运动性较弱的弯曲杆菌（Campylobacter）菌株被滤膜截留，已有研究表明滤膜可降低食品中微生物病原体的捕获效率38。其他局限性还包括离心和过滤过程的批次处理特性、滤膜易发生堵塞，以及对形成的沉淀物再分散效率低下，这些因素均会影响微生物载量测定的准确性。上述局限性共同表明，在确保全面分析时需谨慎操作，并辅以其他补充方法，尤其是在处理不同类型样品或追求高通量能力的情况下。
故障排除建议 
为预防潜在问题，首先应确保所有材料均符合必要的质量标准且未过期。若遇到滤器堵塞问题，可通过增加一次过滤步骤，去除可能阻碍液体通过的较大污染物来排查故障。 弯曲杆菌 通过硝酸纤维素膜。如果观察到污染，请确认液滴未过于靠近滤膜边缘，导致液体绕过滤膜而非通过膜孔进入琼脂。若富集后菌体生长不足，请检查厌氧罐的密封圈是否紧密、无泄漏。
潜在的优化与拓展 
探索替代性滤膜材料可能增强微生物的穿滤能力，并使本方案得以拓展应用于从食品等异质混合物中分离其他可运动的微生物。建议寻找合适的对照条件，以保留运动性较弱的Campylobacter变异株，同时不损害检测的特异性。此外，尽管本研究中使用的多重qPCR检测方法已证明能够检测C. lari18，但该检测体系也可进一步纳入其他感兴趣的Campylobacter物种。
综上所述，通过评估不同的参数和设置，建立了从食品中采用滤膜法分离并进行空肠弯曲菌（C. jejuni）和结肠弯曲菌（C. coli）种水平鉴定的适宜条件。该方法已被证明具有高灵敏度、高特异性、稳健且成本效益良好。通过对实际食品样品的应用，该方案从79份肉类包装样品中成功分离出36株空肠弯曲菌（C. jejuni）和13株结肠弯曲菌（C. coli）。
该方案符合美国食品安全检验局（FSIS）第10,250.1号指令。17，该流程规定了生鸡肉部位取样的步骤，以及MLG 41.076 用于分离与鉴定的 弯曲杆菌 数据表明，将样本浓缩4倍并富集24小时，结合过滤与涂布培养，可在48小时内获得分离且确认的菌落，相较传统的96小时更为高效。该方案可与基于DNA的检测方法（如基因组测序）兼容，从而实现对目标微生物的全面表征。 弯曲杆菌 菌株，包括其抗菌药物耐药性谱、毒力预测及系统发育关系。该方案代表了一种高效回收与分离菌株的有前景的替代方法 弯曲杆菌 从生禽肉中分离spp.，有助于流行病学研究和公共卫生干预。

Campylobacter 属细菌是全球细菌性食源性胃肠炎的首要病因，每年估计有 8 亿例病例1。作为一种重要的人畜共患细菌，Campylobacter 可自然定植于多种动物的胃肠道中，包括野生鸟类、家畜和宠物2。在屠宰或食品加工过程中，Campylobacter 属细菌常污染动物尸体或肉类产品3。弯曲杆菌病通常与食用未煮熟的禽肉或生禽汁液交叉污染其他食品有关2。该病可导致严重并发症，例如吉兰-巴雷综合征、反应性关节炎，以及免疫功能低下个体的败血症4。从食品来源（尤其是禽类产品）中检测和分离 Campylobacter 对公共卫生监测、疫情调查和风险评估至关重要。
基于培养的传统方法是检测Campylobacter的常规和标准方法5,6。然而，这些方法存在若干局限性，包括培养时间较长（48小时或更久）、灵敏度较低（最高仅为50%），且无法涵盖所有菌株（某些处于应激状态的Campylobacter细胞可能在培养基中生长不良或完全不生长）7。分子生物学方法（如聚合酶链式反应（PCR））比基于培养的方法更快速且更灵敏，但无法提供可存活的分离株用于进一步的特征分析8,9。
免疫学方法是Campylobacter检测的替代和补充方法。这些方法快速、简便且用途广泛，但也存在若干局限性，包括交叉反应性（某些抗体可能与具有相似抗原的非Campylobacter细菌或其他物质结合）、特异性低（某些抗体可能无法与所有Campylobacter菌株或血清型结合）以及样本前处理要求（免疫学方法通常需要对样本进行预处理，以去除干扰物质，从而增强抗体结合）10。
在属内 弯曲杆菌, C. jejuni 和 C. coli 导致大多数人 弯曲杆菌 感染（分别为81%和8.4%）11两者均为螺旋形、微需氧且嗜热的细菌，具有单极鞭毛或双极鞭毛。每极鞭毛的旋转被认为是其特征性螺旋式运动的主要驱动力，同时也对其致病性至关重要，因为这种运动使细菌能够在宿主胃肠道黏稠的黏膜中穿行。该细菌的运动能力 弯曲杆菌 由其化学感受系统控制，该系统可使细胞向有利环境移动12,13根据细胞形态和生理特性 弯曲杆菌，少数研究已采用膜过滤法来分离 弯曲杆菌 来自粪便和环境样本的spp.14,15,16.
本研究提出了一种快速且可靠的从生肉中分离并后续检测C. jejuni和C. coli的实验方案，该方法克服了现有方法的诸多缺陷，并具有多项优势。可疑菌落可通过多种方法确认是否为Campylobacter属细菌，例如显微镜检查、生化试验（如过氧化氢酶和氧化酶活性检测）或分子生物学方法6。本方法采用针对C. jejuni和C. coli特有基因的多重实时荧光定量PCR（mqPCR）检测技术，实现对分离菌株的种水平鉴定。该方法成本相对较低、快速且具有选择性，适用于多种环境，包括食品加工场所、临床实验室和科研实验室。

<table><tbody><tr><td>琼脂——凝固剂（Difco）</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>281230</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>JL602-G/L</td><td>仪器设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td>仪器设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗生素添加剂：头孢哌酮、放线菌酮、甲氧苄啶、万古霉素</td><td>Oxoid有限公司</td><td>SR0183E</td><td></td></tr><tr><td>气氛控制气体包&amp;nbsp; （弯曲杆菌，85% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，以及5% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>260680</td><td></td></tr><tr><td>大气控制容器，&amp;nbsp; GasPak EZ CampyPak 厌氧培养容器系统&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>260678</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器 - Amsco Lab250，实验室蒸汽灭菌器</td><td>Steris plc</td><td>LV-250</td><td>仪器设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物安全柜，A2型，Purifier Logic+</td><td>Labconco Corporation</td><td>302411101</td><td>仪器设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bolton肉汤&amp;nbsp;</td><td>Oxoid Ltd.</td><td>CM0983</td><td></td></tr><tr><td>布氏肉汤（Difco）</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>211088</td><td></td></tr><tr><td>缓冲蛋白胨水</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>3564684</td><td></td></tr><tr><td>离心机 Microcentrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>Avanti J-25 离心机</td><td>贝克曼库尔特公司&amp;nbsp;</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>鸡大腿、鸡翅、鸡腿、鸡肝</td><td>本地零售商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA提取——PreMan Ultra样品制备试剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>hipO 的 FAM 探针（序列 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC&lt;br/&gt; ACAGCT-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜 - 0.45 &amp;micro;m 无菌醋酸纤维素滤膜&amp;nbsp;</td><td>默克-密理博有限公司</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>过滤器 - 0.65 &amp;micro;m 无菌醋酸纤维素滤膜&amp;nbsp;</td><td>默克密理博有限公司</td><td>HAWG04700</td><td></td></tr><tr><td>cdtA 基因的上游引物（序列 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT&lt;br/&gt; T-3' ')</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hipO 基因的上游引物（序列 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3'）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IAC 的上游引物（序列 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cdtA 的 HEX 探针（序列 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG&lt;br/&gt; TCCC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>孵育器 - Inova 4230 制冷型摇床孵育器</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>4230</td><td>仪器设备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>接种环 - 组合环&amp;nbsp; 10&amp;micro;L 和 1&amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>22-363-602</td><td></td></tr><tr><td>内部扩增对照（IAC）DNA片段（序列5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT&lt;br/&gt; GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC&lt;br/&gt; GTTGTAACTATCCACTGAGATG&lt;br/&gt; TGTTAGGCGCGCC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>马血（Laked horse blood）&amp;nbsp;</td><td>Remel 公司</td><td>R54072</td><td></td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014382</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-100XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014384</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014388</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014391</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17014392</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17013805</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-20XLS+</td><td>Mettler Toledo</td><td>17013803</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>PYREX 1 L 方形玻璃培养基储存瓶&amp;nbsp; 带GL45螺口盖的瓶子</td><td>康宁公司</td><td>1396-1L</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>PYREX 2 L 圆形广口瓶，带 GLS80 螺口盖 - 培养基储存瓶</td><td>康宁公司</td><td>1397-2L</td><td>设备</td></tr><tr><td>96孔微孔板，平底，聚苯乙烯材质，0.34 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，无菌，108/细胞</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z707902</td><td></td></tr><tr><td>混匀器 - Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0236</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>电动移液器控制器，PIPETBOY2</td><td>INTEGRA Biosciences Corp.</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>PCR预混液 2&amp;times; TaqMan 基因表达&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>4369542</td><td></td></tr><tr><td>培养皿旋转器&amp;nbsp; bioWORLD 接种转盘</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>3489E20</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>带透明盖的培养皿（100 mm × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 1000&amp;micro;L S 768A/8</td><td>Mettler Toledo</td><td>&amp;nbsp;30389273</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 20&amp;micro;L 960A/10</td><td>Mettler Toledo</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 200&amp;micro;L F 960A/10</td><td>Mettler Toledo</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽，25 mL无菌储液槽，用于多通道移液器</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>8093-11</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR - 7500 实时荧光定量 PCR 系统&amp;nbsp;</td><td>（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>cdtA 的反向引物（序列 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3'）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hipO 的反向引物（序列 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG&lt;br/&gt; A-3')</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IAC 的反向引物（序列 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA&lt;br/&gt; -3')</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，Nunc 血清移液管（10 mL）</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，Nunc 血清移液管（2 mL）</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>170372N</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，Nunc 血清移液管（25 mL）</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，Nunc 血清移液管（50 mL）</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>170376N</td><td></td></tr><tr><td>涂布棒 - Fisherbrand L型细胞涂布棒</td><td>Fisher Scientific International, Inc</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 均质袋，Nasco Whirl-Pak 可书写均质过滤袋</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>01-812</td><td></td></tr><tr><td>用于IAC的TAMRA探针（序列 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC）&lt;br/&gt; ACCA-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR扩增仪（GeneAmp PCR system 9700）</td><td>应用生物系统公司</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>水过滤 - Elga Veolia Purelab Flex&amp;nbsp;</td><td>Elga LabWater</td><td>PF2XXXXM1-US</td><td>仪器设备</td></tr></tbody></table>

从生肉中检测与分离campylobacter spp.

Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Raw Meat

本文介绍了一种快速且可靠的分离方案 弯曲杆菌 生肉中 spp. 的分离，特别关注 空肠弯曲菌 和 空肠弯曲菌该方案基于已建立的方法，确保与美国食品药品监督管理局（FDA）、美国农业部（USDA）以及欧洲国际标准化组织（ISO）等监管机构普遍采用的技术相兼容。本方案的核心步骤是收集冲洗液，将其浓缩后重悬于含有马血的Bolton肉汤培养基中。该培养基已被证实可有效促进受损弯曲杆菌的复苏 弯曲杆菌 细胞并使所需的富集时间缩短50%。随后将富集后的样品转移至含牛布鲁氏菌的硝酸纤维素膜上。为提高该方法的灵敏度和特异性，评估了孔径为0.45 µm和0.65 µm的滤膜。数据显示，与0.45 µm孔径滤膜相比，使用0.65 µm孔径滤膜的细胞回收率提高了29倍，且未影响特异性。该高度运动性的特征 弯曲杆菌 使细胞能够主动穿过膜滤器向琼脂培养基迁移，从而实现纯培养物的有效分离 弯曲杆菌 菌落。该方案采用多重定量实时聚合酶链式反应（mqPCR）检测技术对分离株进行种水平鉴定。这种分子技术为物种鉴定提供了可靠且高效的方法。过去十二年针对市售肉类的多项研究表明，该方法能够提高目标微生物的检出率。 弯曲杆菌 从天然污染的肉类样本中回收目标物，相较于当前的参考方法，具有更短的制备和处理时间。因此，该方案为高效回收提供了有前景的替代方法 弯曲杆菌 从肉类中提取。此外，该方法可与基于DNA的技术无缝结合，便于在进行阳性样本快速筛查的同时，开展全面的全基因组测序分析。

水分对布鲁氏菌琼脂平板被动过滤效果的影响 弯曲杆菌 
弯曲杆菌 基因组较小，且缺乏其他细菌中常见的多种应激反应基因，例如 E. coli O157:H7 和 沙门氏菌因此，它对各种环境胁迫更为敏感，无法耐受脱水或环境氧气水平。相反，过于湿润的琼脂培养基可能导致滤膜被淹没，这不仅会引起样品向滤膜外扩散，还会延长其暴露于氧气的时间。21.
为了确定基于滤膜分离Campylobacter的合适条件，将布鲁氏菌琼脂平板在生物安全柜中打开皿盖分别干燥0小时、1小时、2小时和3小时，并评估Campylobacter细胞穿过孔径为0.65 µm滤膜的效率。取浓度分别为1.53 × 104 和 1.53 × 105 CFU/mL的C. jejuni S27培养物，各取20 µL四份，加至置于布鲁氏菌琼脂平板表面的滤膜上。经过15分钟穿透后，移除滤膜，平板置于恒温培养箱中过夜培养以促进菌体生长。
随后对5个重复培养皿中的细胞进行计数，并记录于表1中。结果表明，干燥时间为2小时和3小时的琼脂平板表现相似，通过被动过滤回收的细胞数量几乎相等。值得注意的是，在0小时和1小时干燥条件下，细胞在15分钟的时间内未能完全穿过膜。
不同孔径滤膜在从鸡肝中分离 Campylobacter 中的比较 
考虑到Campylobacter的细胞大小（长度为0.5–5 µm，宽度为0.2–0.9 µm）以及食品颗粒尺寸的广泛范围，测试了孔径为0.45 µm和0.65 µm的醋酸纤维素滤膜在15分钟孵育时间内对Campylobacter通过效率的影响。实验使用由450 g鸡肝组成的食品样品，该样品接种了153 CFU的C. jejuni，并经过过夜增菌处理。作为无滤膜对照，同时进行了增菌样品的直接涂布。5次重复平板的结果（图2）一致显示，0.65 µm孔径滤膜比0.45 µm孔径滤膜允许更多的细胞通过，获得的细胞数量增加了约29倍。0.45 µm孔径滤膜在滤膜上表面截留了过多的细胞，导致从食品中回收的Campylobacter数量显著低于0.65 µm孔径滤膜。如预期所示，无滤膜对照平板上生长出了大量不同的背景菌群。
被动过滤技术的应用 弯曲杆菌 从市售鸡肉中分离 
由于其不寻常的运动性 弯曲杆菌 细胞，选择被动过滤技术用于分离 C. jejuni 和 C. coli 来自零售肉类制品，这些制品通常被大量背景微生物污染。在2014年至2023年期间，共采集了79份生肉样品，包括鸡肉的不同部位、鸡肝、牛肝和小牛肝，均来自当地多家超市。从每份包装中取450 g样品用于分离 弯曲杆菌 spp. 通过结合选择性富集 弯曲杆菌 在含血的Bolton肉汤中并通过细胞被动过滤穿过 0.65 µm 孔径为醋酸纤维素滤膜直接置于布氏杆菌琼脂平板上，49 弯曲杆菌 菌株已成功从79份肉类样本中分离表 2). 图3 表示分离出一种新物质的结果 弯曲杆菌 从鸡肝脏中分离的菌株。该方法已被反复证明具有高灵敏度、高特异性和成本效益。
鉴定与区分 C. jejuni 和 C. coli 分离株 
验证属的分类并区分物种 弯曲杆菌 从生肉中分离获得的菌株，采用多重qPCR检测方法扩增特异性基因靶标（hipO 和 cdtA）用于 C. jejuni 和 C. coli，并使用了内部扩增对照（IAC）。IAC用于在多个基因同时扩增过程中指示假阴性结果。该检测采用96孔板格式进行，通过市售试剂快速裂解细胞并提取DNA（见 材料表). 表 2 总结了物种鉴定结果的 C. jejuni 和 C. coli 菌株。作为进一步验证，全基因组测序结果确认了所有分离株的物种身份（数据未显示）。
<img alt="弯曲杆菌分离方法；微需氧培养过程；多重qPCR用于种属鉴定；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66462/66462fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：分离与鉴定的工作流程图 弯曲杆菌 来自市售肉类的物种 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/66462fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="菌落生长比较；柱状图；滤膜尺寸对菌落数量的影响；微生物分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66462/66462fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2滤膜尺寸对回收率的影响 弯曲杆菌. 结果表明，该 0.65 µm 滤膜可回收平均 900 ± 138 个菌落，而 0.45 µm 滤膜回收菌落数为 31 ± 7。该结果基于 N = 20（5 个培养皿，每皿 4 滴）的实验数据，并采用 Student's t检验 表示均值具有统计学上的显著差异（p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/66462fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="在琼脂平板上进行的微生物生长实验、抗生素扩散试验示意图、抑菌圈。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66462/66462fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过被动过滤富集的禽类样品分离Campylobacter。 （A）显示将四滴每滴20 µL的富集样品滴加到硝酸纤维素膜滤器上的情况。图像拍摄于15分钟被动过滤过程中。（B）显示移除硝酸纤维素滤膜后的平板。四个斑点指示富集样品穿过膜的位置。（C）显示培养24小时后的平板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/66462fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：布鲁氏菌琼脂平板干燥时间对空肠弯曲菌被动过滤效果的影响。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：从生肉中分离的空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌菌株。在2008年至2023年期间，从24种不同的零售肉类产品的79个肉类包装中分离出36株空肠弯曲杆菌（C. jejuni）和13株结肠弯曲杆菌（C. coli）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件1：分离与计数过程中的各阶段图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66462/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

弯曲杆菌是全球细菌性食源性胃肠炎的首要致病原因。尽管各生产机构已采取措施以降低其在生产设施中的污染率，但受污染的产品仍持续流入消费者手中。过去十二年间开发的这一技术，解决了现有方法在从生肉中分离和检测Campylobacter spp.方面的局限性。

从生肉中检测与分离Campylobacter spp.

本文介绍了一种从生肉中快速且可靠的分离弯曲杆菌属（Campylobacter spp.）的实验方案，重点针对空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和……

本研究提供了一种快速且可靠的从食品中分离弯曲杆菌的方案。该方法克服了现有方法的多种缺陷，并为后续的分离物检测与表征提供了优势。在实际操作中，用于冲洗的辅助量通常比食品安全检测（如PCR）所用样品量大10,000倍。有必要降低亚组抽样的误差，以确保结果能够代表目标群体。本方案已用于分离出50多种弯曲杆菌菌株，这些菌株随后被应用于基因组学研究。我们的数据和分析有助于深入理解弯曲杆菌与宿主相互作用及生产过程中的分子机制。其规模之大促进了管理弯曲杆菌病的新型治疗策略的开发。本方案提供了将取样量减少13倍的机会，同时将从生肉中分离弯曲杆菌所需时间缩短24小时，或可在8小时工作日内完成。未来的研究可应用此方法不仅从食品样品中，还可从环境样品中分离弯曲杆菌。这有助于消除假阴性结果，并更准确地定量受污染样本的数量。首先，从包装中取出450克鸡肉块，放入均质袋或滤袋中。向装有鸡肉的均质袋中加入200毫升0.1%缓冲蛋白胨水。从胃部或袋子外部手动按摩或触压样品 2 分钟。使用电动移液器控制器，从袋子的滤过侧收集全部鸡肉冲洗液，并将其分配至无菌离心管中。然后在室温下以 10,000 G 离心 10 分钟。使用电动移液器控制器和25毫升一次性塑料刻度移液管，小心收集上清液并弃去。为富集弯曲杆菌，向已灭菌的500毫升Bolton肉汤中加入25毫升陈旧马血。将1瓶抗生素添加剂用5毫升50%乙醇重悬，然后将重悬后的抗生素添加剂加入Bolton肉汤中。接着，将沉淀物重悬于50毫升含有马血和抗生素的Bolton肉汤中。将样品置于密封容器内，容器中维持85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气的气体混合环境。将样品在 42 摄氏度下孵育 24 小时。首先，将布氏琼脂平板打开盖子后置于生物安全柜中干燥。将醋酸纤维素滤膜置于布氏琼脂平板中央。用移液器将4滴弯曲杆菌增菌样本滴加到滤膜上，每滴20微升。滴加后，在室温下孵育15分钟，然后小心取出滤膜，将平板在42摄氏度下孵育约24小时。孵育结束后，挑取具有特定特征的典型弯曲杆菌菌落。在布氏琼脂平板上划线分离菌落以进行纯化。对于长期保存，挑取在布氏琼脂平板上生长的空肠弯曲菌菌落，接种于Bolton液体培养基中。将样品置于密封容器内，容器中维持由85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气组成的气体环境。将样品在 42 摄氏度下孵育过夜。然后将 900 微升过夜培养的空肠弯曲菌（Campylobacter）培养物加入含有 100 微升 DMSO 的 2 毫升冻存管中。在干冰乙醇浴中迅速冷却 10 分钟，随后转移至 -80 摄氏度冰箱中保存。不同孔径滤膜的比较结果显示，相较于0.45微米滤膜，更多细胞能够通过0.65微米滤膜。首先，取含有弯曲杆菌菌落的布鲁氏菌琼脂平板，将纯化的弯曲杆菌菌落分散至96孔板中，每孔加入100 µL裂解液。在热循环仪中于99 °C裂解样品10分钟，随后在20 °C冷却2分钟。然后在室温下以 8,000 G 离心 10 分钟。准备 20 微升的反应体系，包含预混液、DNA 样本、内参扩增对照模板、引物和探针。将所有样本以每份三个复孔的方式加入 96 孔光学反应板中，并用光学膜密封，随后放入实时荧光定量 PCR 系统中。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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