Name: 术后肠梗阻鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: 了解通过肠道操作建立小鼠术后肠梗阻模型的方法，用于研究肠道免疫和病理生理机制。该模型有助于评估新型抗炎治疗策略并推动临床转化研究。

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我们感谢北京临床研究中心和北京友谊医院的实验动物中心提供动物护理。本工作由国家关键技术研发项目资助&amp;#38;D 计划（编号：2015BAI13B09）、北京市自然科学基金（编号：7232035）、国家自然科学基金（编号：82171823、82374190）以及北京友谊医院杰出青年学者项目（编号：yyqcjh2022-4）

动物饲养和实验操作均遵循《实验动物护理与使用指南原则（中国）》，并经北京友谊医院伦理审查委员会批准（编号：20-2056）。本研究采用 C57BL/6 小鼠（8–12 周龄）。
1. 手术准备
<ol>
	<li>在计划建模前 12 小时对所有小鼠进行禁食，以满足实验条件的标准化要求（图 1A）。</li>
	<li>准备并灭菌手术器械。</li>
	<li>准备麻醉剂三溴乙醇和加热垫。监测加热垫以防止过热，并保持其温度恒定（37.5 °C）。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>用三溴乙醇对每只小鼠进行麻醉。
	<ol>
		<li>将三溴乙醇稀释，用生理盐水配制成 20 mg/mL 的溶液。按每 10 g 体重 0.2 mL 的剂量，通过腹腔注射给予三溴乙醇工作液。在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。</li>
		<li>确保小鼠在 5 分钟内完全麻醉，并维持麻醉状态至少 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过观察小鼠是否无法保持直立姿势并检查肌肉是否松弛来评估麻醉深度。观察其自主运动、眨眼反射以及对反射刺激（如用力捏脚趾或尾巴）的反应是否消失。</li>
	<li>通过观察胸壁和腹部的运动来监测小鼠的呼吸频率和呼吸模式。在理想麻醉状态下，确保呼吸频率约为 55–65 次/分钟。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠固定在板上，并用胶带固定。</li>
	<li>小鼠完全麻醉后，使用电动剃毛器去除腹部毛发。剃毛后，用生理盐水浸湿的棉球擦去腹部所有松散的毛发。 
	注意：操作三溴乙醇时，应确保良好通风，并使用通风橱或生物安全柜，以尽量减少暴露风险。实验过程中应穿戴适当个人防护装备，包括手套和实验服，以防止与化学品和生物材料发生意外接触。</li>
</ol>
3. 手术
<ol>
	<li>充分伸展四肢以暴露腹部。确保小鼠头部位置正确，以保持呼吸道通畅（图1B）。</li>
	<li>使用浸有75%酒精的棉球对术区皮肤进行两次消毒。消毒后，用干燥无菌医用纱布擦去腹部多余的酒精。在切口前，于预定部位皮下注射利多卡因（10 mg/kg）。</li>
	<li>使用无菌手术刀切开皮肤，并用镊子提起腹直肌中部。
	<ol>
		<li>沿腹直肌中线做一小切口，注意避免损伤腹腔内各器官。</li>
		<li>确保切口范围大致如下：切口上缘距胸骨剑突6–8 mm，下缘距外生殖器6–8 mm，切口长度约1 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腹部切口两侧各放置一块无菌手术巾或无菌纱布&#160;。使用止血钳将无菌纱布固定在切口上下边缘，以暴露手术视野（图1C）。 
	注意：假手术组在覆盖湿纱布5分钟后不进行任何手术操作。</li>
	<li>妥善固定无菌手术巾或纱布，然后使用两根预先用生理盐水润湿的棉签，轻轻按压切口两侧的腹壁。将少量肠管轻柔挤出切口，并将其置于无菌手术巾或纱布上以暴露肠段（图1D）。</li>
	<li>将两根无菌棉签完全浸湿于生理盐水中。用湿润的棉签轻轻夹住肠组织，小心地将小肠取出。
	<ol>
		<li>定位盲肠，然后用无菌棉签将肠管拉出，至距胃约2 cm处停止，避免触碰胰腺。将肠管从胰十二指肠韧带近端延伸至回盲部远端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从近端至远端沿整个小肠施加均匀压力。持续施力5分钟，直至肠表面出现少量出血点（图1E）。</li>
	<li>5分钟后，使用预先润湿的无菌棉签，将全部小肠按照小肠正常的生理解剖位置小心放回腹腔内。</li>
	<li>隔着无菌纱布和腹壁，轻柔按摩腹部3–5秒，以确保肠道恢复至自然解剖位置，并防止术后发生人为机械性肠梗阻或肠系膜扭转。</li>
	<li>向腹腔内注射100 µL生理盐水，以补充术中丢失的液体并润滑腹腔组织。</li>
	<li>使用6-0外科缝线关闭腹腔，并对腹部切口进行两层缝合。首先采用连续缝合法闭合肌层，注意避免损伤腹腔器官。缝合时提起腹直肌（图1F）。</li>
	<li>完全闭合腹直肌后，使用6-0外科缝线以单纯间断缝合法进行全层缝合。保持针距约0.5 mm，进针间隔约2 mm。</li>
	<li>关闭腹部切口后，用干燥的无菌医用纱布轻轻擦拭切口周围区域，保持切口干燥清洁，避免残留血液、组织液或生理盐水。</li>
	<li>在切口及周围涂抹少量医用切口粘合剂，以防止术后切口裂开。</li>
	<li>待医用切口粘合剂完全干燥后，将小鼠转移至铺有纸巾的加热毯上，加热毯温度维持在恒定的37.5 °C，直至小鼠完全苏醒。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。</li>
	<li>将清醒后的小鼠转移至动物饲养屏障环境中，并允许其自由饮水，直至检测时间。</li>
</ol>
4. 胃肠传输实验
<ol>
	<li>术后22.5小时，通过灌胃向禁食小鼠给予200 µL FITC-葡聚糖溶液（5 mg/mL，溶于PBS中）（图1A）。</li>
	<li>采用机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方法处死小鼠，例如先吸入CO2，随后进行颈椎脱位。
	<ol>
		<li>为分离消化道，从膈肌至骨盆沿中线做切口，小心移除周围结缔组织和器官。</li>
		<li>将消化道与周围组织和器官分离，确保包含从胃至肛门的完整消化道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将消化道按生理位置均分为15个等长节段（从胃到结肠），依次编号为1至15（顺序：St -S1:S10-Ce-L1:L3）（图2A）。</li>
	<li>将每个肠段组织连同内容物剪成1–4 mm大小的碎片，分别放入含有1 mL DPBS的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管涡旋振荡10秒，以充分混匀样品。</li>
	<li>在500 × g 条件下离心1分钟，收集上清液，用于多模式微孔板读数仪检测FITC荧光强度。</li>
	<li>通过计算FITC-葡聚糖的几何中心（GC）来描述胃肠道传输情况，计算公式如下：(Σ[各节段FITC百分比 × 节段编号]) / 100。</li>
</ol>
5. 石蜡包埋和苏木精-伊红（HE）染色
<ol>
	<li>在24小时后，通过吸入CO2并辅以颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。使用同一只动物进行石蜡包埋和胃肠道检测。</li>
	<li>打开腹腔，采集小肠组织用于进一步分析。</li>
	<li>将含有肠内容物的整个肠道置于Carnoy固定液（60%甲醇 + 10%乙酸 + 30%氯仿）中，在4 °C下固定2小时。</li>
	<li>用甲醇漂洗两次，每次30分钟，以去除组织中的酸性成分。</li>
	<li>用乙醇置换甲醇两次，每次30分钟。</li>
	<li>再次用甲醇漂洗两次，每次30分钟。为使组织透明化，将组织浸入二甲苯中，孵育1小时。</li>
	<li>使用石蜡包埋机将组织包埋于石蜡中。用切片机将包埋好的组织切成4 µm厚的切片。 
	注意：为提高处理效率，可将小肠不同节段分别包埋于不同石蜡块中。应正确标记各节段以识别其位置。</li>
	<li>使用苏木精-伊红（HE）染色试剂盒进行染色。封片后在显微镜下观察并分析。</li>
</ol>
6. 免疫细胞分离与流式细胞术
<ol>
	<li>配制以下溶液。
	<ol>
		<li>预消化液：配制不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hank's 平衡盐溶液，加入 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。</li>
		<li>消化液：在 RPMI 1640 培养基中配制含有 200 µg/mL DNA酶 I、500 µg/mL 胶原酶 IV、4% 胎牛血清（FBS）和 100 µM HEPES 缓冲液的溶液。</li>
		<li>磁珠激活细胞分选缓冲液（MACS 缓冲液）：在不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 中配制含有 5 g/L 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 的缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用生理盐水冲洗肠道以去除粪便内容物。去除小肠上的派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）和结缔组织。将小肠纵向剖开，然后在冰冻的 PBS 中切成 1 cm 长的片段。</li>
	<li>将肠段置于 37 °C 的预消化液中，在摇床上振荡孵育 20 分钟。收集预消化液，并通过 70 µm 细胞筛过滤，以获得上皮内淋巴细胞（IELs）。</li>
	<li>将肠段在消化液中消化 30 分钟，然后将悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，以获得固有层淋巴细胞（LPLs）。</li>
	<li>将 LPL 细胞在 500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用不含叠氮化钠、Tris 和蛋白的 DPBS 洗涤细胞，并重悬至浓度为 1 × 106 个细胞/100 µL。</li>
	<li>在室温（RT）避光条件下，加入荧光活率染料（1:500 稀释）孵育细胞 15 分钟。</li>
	<li>用 MACS 缓冲液重悬细胞，并在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对染色后的细胞进行计数。将细胞重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 1 × 106 个细胞/100 µL。根据所需抗体体积，按 1:200–1:400 的比例加入抗体，混匀后于 4 °C 孵育 15 分钟进行抗体染色。</li>
	<li>按照步骤 6.8 所述方法洗涤细胞。</li>
	<li>使用流式细胞术检测样品，并利用配套的流式细胞分析软件进行数据分析7,8。</li>
</ol>

Murine Model for Studying Postoperative Ileus through Intestinal Manipulation

<ol><li>Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+following+major+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus following major colorectal surgery.</a> Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).</li>
<li>Farro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2-dependent+monocyte-derived+macrophages+resolve+inflammation+and+restore+gut+motility+in+postoperative+ileus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus.</a> Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).</li>
<li>Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+functional+GI+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in functional GI disorders.</a> Gut. 65 (1), 155-168 (2016).</li>
<li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).</li>
<li>Schwartz, C., Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+basophils+by+flow+cytometry+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of murine basophils by flow cytometry and histology.</a> Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).</li>
<li>Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experience+with+a+novel+single-port+platform+for+transoral+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Endosc%22%5BJournal%5D)">Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery.</a> Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).</li>
<li>Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-031%3A+Immunologic+checkpoint+expression+on+murine+effector+and+memory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets.</a> Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).</li>
<li>Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-93%3A+A+41-color+high+parameter+panel+to+characterize+various+co-inhibitory+molecules+and+their+ligands+in+the+lymphoid+and+myeloid+compartment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice.</a> Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+composition+of+the+mucosal+flora+in+patients+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>van Bree, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+studying+postoperative+ileus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Physiol+Pathophysiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel method for studying postoperative ileus in mice.</a> Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

手术的成功依赖于多个关键步骤。首先，在肠道壁内（IM）手术过程中保持操作的一致性至关重要，以对小肠造成广泛的损伤。在IM操作过程中施加适当的压力，以及由此在肠壁上产生的充血效应，是手术成功的关键。用棉签擦拭后观察到整个消化道变为粉红色，并出现红色出血点，是手术成功的指标。此外，术后平均GC值维持在约5，表明与假手术小鼠相比，该模型构建成功。通过苏木精-伊红（HE）染色显示的黏膜下层组织水肿及免疫细胞浸润的显微镜检查，也是验证术后肠麻痹（POI）严重程度的关键步骤。
为了优化实验结果或解决遇到的问题，可能需要对实验方案进行调整。例如，为了准确显示肠上皮的形态学变化，建议使用卡诺氏固定液（Carnoy's fixative）将肠道组织连同其内容物一起包埋9。这种独特的包埋方法可实现快速固定，对于保持组织形态至关重要。然而，如果研究目标集中在上皮层或固有层，建议采用改良的瑞士卷技术进行肠道组织的石蜡包埋10。该技术可压缩肠道组织间的间隙，并确保绒毛方向一致，从而便于将整个小肠包埋于单个石蜡样本中。
尽管该方案具有实用性，但仍存在一些局限性。其一，该方案依赖于动物模型，而动物模型可能无法完全复制人类病理生理学的复杂性。此外，手术技术的差异以及个体小鼠的反应差异可能导致实验结果的变异性。根据我们最近的研究，由同一名操作者完成实验是减少操作者依赖性变异的重要原则。此外，Van 等人介绍了一种自制装置，可对肠道施加特定重量，从而在不同小鼠之间对肠系膜（IM）施加一致的压力11。该方法在维持模型一致性方面确实具有重要价值。
本方案通过在小鼠中采用肌间神经丛（IM）手术诱导术后肠梗阻（POI），提供了一种标准化的方法，对该领域具有重要贡献。通过阐明关键操作步骤，并针对组织包埋和免疫细胞分离提供改进方案，本方案提高了POI建模的可重复性和可靠性。利用流式细胞术7,8进行免疫细胞分析，可全面探究POI发病机制中潜在的免疫反应，不仅补充了现有技术，也拓展了我们对这一复杂综合征的理解。
本文所述方案对未来致力于理解与治疗原发性卵巢功能不全（POI）的临床前研究具有广阔前景。通过优化手术技术并改进组织处理方法，研究人员可进一步探索POI发生发展的潜在机制，并鉴定新的治疗靶点。此外，该方案与流式细胞术的兼容性使得能够进行深入的免疫谱分析，为研究旨在缓解POI症状的免疫调节干预措施提供了新途径。总体而言，该方案为推进我们对POI的认识以及开发靶向治疗策略以改善患者预后奠定了基础。

术后肠梗阻（POI）是一种在人类健康领域中具有重大挑战性的综合征，尤其在接受腹部手术的患者管理中尤为突出。POI以胃肠道运动功能恢复延迟为特征，导致住院时间延长和医疗成本增加，然而目前尚无公认的定义、病因或治疗方法1。近期研究表明，免疫细胞在POI进展中发挥关键作用2,3,4，但仍需进一步研究以阐明其潜在机制。
在本实验方案中，我们介绍了一种通过腹腔内手术诱导小鼠术后肠功能障碍（POI）的动物模型，该模型能够较好地模拟腹部手术对消化道的影响。我们的目标是提供一种标准化的小鼠POI建模方法，以帮助研究人员深入探究其病理生理机制，并探索新的治疗干预手段。
开发和利用该技术的理论基础在于需要可靠的临床前模型来研究术后肠梗阻（POI）。传统的POI研究方法往往缺乏转化相关性，或无法充分反映导致该病症的多种因素之间的复杂相互作用。通过建立一种能紧密模拟临床情况的小鼠模型，研究人员可以在受控的实验环境中更准确地探究POI的潜在机制，并评估潜在的治疗干预措施。
与替代技术相比，本方案中介绍的小鼠POI模型具有多项优势。首先，我们将实验结果与最新研究进展相结合，建立了一套标准化且可重复的实验动物POI诱导方案，该方案有助于对胃肠道传输功能进行一致性评估。其次，通过采用组织学染色和流式细胞术，能够评估组织肿胀、免疫细胞增殖及活化情况，从而为揭示POI背后的炎症机制提供重要见解5。
从现有文献的整体背景来看，建立一种小鼠的术后肠梗阻（POI）模型有助于拓展对该疾病病理生理机制的研究。通过连接基础科学与临床实践之间的桥梁，临床前模型在开发针对POI的新型治疗策略中发挥着关键作用6。此外，标准化动物模型的可获得性提高了不同实验室之间研究结果的可重复性和可比性。然而，该POI模型依赖于手术过程中施加的机械刺激，其他类型的刺激诱发性肠梗阻可能不适用于此模型。此外，研究人员在使用该模型设计实验时，还应考虑动物福利法规、伦理问题以及资源可及性等因素。
总之，卵巢功能不全（POI）小鼠模型的建立标志着这一致残性疾病在临床前研究领域取得了显著进展。此外，我们采用苏木精和伊红（H&E）染色以及流式细胞术来评估组织肿胀及免疫细胞的增殖与活化情况。小鼠POI模型的建立将有助于揭示POI的发病机制，并推动针对POI的新型治疗方法的研发。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 I-A/I-E (MHC-II)</td><td>Biolegend</td><td>107614</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 TCRb</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗小鼠 CD4</td><td>Biolegend</td><td>100414</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗小鼠 Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127624</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD69</td><td>Biolegend</td><td>104545</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗小鼠 F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123132</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 抗小鼠/人 CD44</td><td>Biolegend</td><td>103041</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 抗小鼠 CD8a</td><td>BD</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>BUV737 抗小鼠 CD3e</td><td>BD</td><td>612771</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>培养显微镜</td><td>CKX53</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I (&lt;strong&gt;DNase I&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-5G</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 CD45</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td></td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖 (70 kWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70-100MG</td><td>胃肠道转运实验</td></tr><tr><td>HE 染色试剂盒</td><td>solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 PD-1</td><td>Biolegend</td><td>114118</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE (Pharmacia)</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Symphony A5 流式细胞仪</td><td>BD</td><td>-</td><td>免疫细胞检测与分选</td></tr><tr><td>三溴乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Varioskan LUX</td><td>Thermo</td><td>N16699</td><td>多功能微孔板读板仪</td></tr><tr><td>Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>荧光细胞活力染料&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

术后肠梗阻小鼠模型

Postoperative Ileus Murine Model

大多数患者在术后会出现术后肠梗阻（POI），这与发病率、死亡率以及住院时间的增加相关。POI 是手术过程中机械性损伤所导致的后果，会引起胃肠道运动功能的紊乱。POI 的发生机制与神经元敏感性异常、上皮屏障功能受损以及局部炎症反应增强有关。然而，其具体机制仍不明确。因此，实验性小鼠模型对于阐明 POI 损伤的病理生理机制以及开发新型治疗方法至关重要。
本文介绍了一种通过肠道操作（IM）建立的小鼠术后肠梗阻（POI）模型，该模型模拟了临床手术过程；具体操作是使用棉签对腹部进行1至3次按摩，从而对小肠造成机械性损伤。术后24小时，通过FITC-葡聚糖灌胃及检测消化道各节段的荧光信号，评估胃肠道传输功能，结果显示IM导致胃肠道传输延迟。此外，通过苏木精-伊红染色和流式细胞术分析了黏膜下层组织水肿及免疫细胞浸润情况。IM操作中施加适当的压力以及在肠道上产生充血效应，是该方法成功的关键。这一小鼠POI模型可用于研究腹部手术后肠道损伤与恢复的机制。

在本实验方案中，通过肠操作（IM）手术诱导术后肠梗阻（POI），该方法模拟了临床手术的影响。假手术组仅进行切口，但不进行肠操作。在POI手术后24小时，处死POI小鼠及假手术对照组小鼠。通过灌胃给予FITC-葡聚糖检测消化道的关键功能——内容物传输功能。由于在小肠近端的FITC荧光强度增加，表明POI模型构建成功（图2B）。通过计算平均胃肠传输指数（GCs）来量化IM引起的传输功能障碍，并用以反映手术操作的一致性（图2C）。
HE染色显示了消化道不同节段的形态学特征（图3）。在POI诱导后24小时，十二指肠和回肠的黏膜下层及平滑肌层出现肿胀（图3A、B）。与假手术小鼠相比，POI小鼠十二指肠的HE染色显示免疫细胞浸润增加（图3A）。
多色流式细胞术分析是评估免疫细胞比例、状态和功能的核心方法。将肠道组织用胶原酶和脱氧核糖核酸酶消化后，制备成单细胞悬液用于流式细胞术检测。通过设门策略确定肠上皮内淋巴细胞（LPLs）中CD3 T细胞及相关亚群的比例（图4A）。在POI小鼠中，CD69（活化和黏附标志物）以及CD4 T细胞、CD8 T细胞和γδ T细胞的表达均上调（图4B）7。类似地，CD44+ PD-1+（活化、终末分化及耗竭标志）亚群的比例也呈上升趋势（图4C）7。除了淋巴细胞外，骨髓来源细胞亚群（中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞）的比例在IM手术后也有所增加（图4D）8。
<img alt="小鼠手术时间线、禁食时长、FITC-葡聚糖灌胃实验、临床前研究步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：术后肠麻痹的小鼠模型。（A）术后肠麻痹小鼠模型的示意图。（B）麻醉后固定小鼠并剃毛。（C）暴露切口并用医用无菌纱布覆盖。（D）通过腹部切口将肠管挤出腹腔，并置于无菌纱布上暴露。（E）用湿润的无菌棉签暴露整个小肠。（F）用手术缝线关闭肌层。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肠道FITC分布；图A显示各肠段，图B显示荧光强度，图C比较中心位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：用于评估消化道功能的胃肠道通过实验。 手术后22.5小时，假手术组或术后肠梗阻（POI）小鼠经口灌胃给予FITC-葡聚糖溶液，并于90分钟后处死。(A) 消化道按生理位置分为15个肠段并编号。(B) 假手术组与POI小鼠各肠段的FITC荧光强度。(C) 计算并以小提琴图形式展示给予的FITC-葡聚糖在体内的几何中心位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="十二指肠和回肠组织的组织学比较，假手术组与术后肠梗阻组，100μm 和 25μm 放大视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：术后肠梗阻（POI）小鼠小肠的代表性苏木精-伊红（HE）染色。 假手术组与 POI 小鼠的（A）十二指肠和（B）回肠横切面的 HE 染色结果。比例尺：100 µm 或 25 µm（插图中放大图像）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析示意图：CD4、CD8、γδ T细胞、CD45+细胞鉴定及免疫应答研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：POI小鼠小肠免疫细胞的代表性流式细胞术分析。（A）术后24小时POI小鼠小肠组织中T细胞群体的流式细胞术设门策略。（B）假手术组与POI小鼠小肠中CD4 T细胞、CD8 T细胞及γδ T细胞表达活化标志物CD69+的比例。（C）假手术组与POI小鼠小肠中CD4 T细胞、CD8 T细胞及γδ T细胞表达CD44+ PD-1+活化标志物的比例。（D）假手术组与POI小鼠小肠中CD45+ Aqua-活免疫细胞中中性粒细胞（Ly6G+ CD11b+）、树突状细胞（CD11c+ MHC-II+）和巨噬细胞（CD11b+ F4/80+）的比例。每个图中的数值代表相应细胞类型的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种通过肠道操作建立的小鼠术后肠梗阻模型。在手术后24小时评估了胃肠道传输功能、病理变化以及免疫细胞的活化情况。

大多数患者在术后会出现术后肠梗阻（POI），这种情况与发病率、死亡率以及住院时间的增加相关。POI……

本研究的范围是肠道免疫。我们旨在阐明术后肠麻痹（POI）损伤的病理生理学机制，以促进新型疗法的开发。其中一个挑战是建立稳定且可重复的小鼠POI实验模型。这涉及控制手术技术等变量以及动物护理的评估方案，以尽量减少实验组之间的差异。另一个挑战是在小鼠中阐明 POI 的潜在病理生理机制。我们的方案旨在建立一个可重复且变异最小的模型，用于研究 POI 的病理生理学并评估新的抗炎策略。我们的目标是弥合小鼠模型中获得的临床前研究结果与人类临床相关性之间的差距，从而提高实验成果转化为有效治疗原发性卵巢功能不全（POI）的可能性。首先，将麻醉后的小鼠置于手术平台上。使用电动剃毛器去除腹部的毛发。然后用生理盐水浸湿的棉球擦去腹部所有松散的毛发。充分伸展四肢以暴露腹部，并调整小鼠头部位置以保持呼吸道通畅。接着用浸有75%酒精的棉球对术区皮肤进行两次消毒。随后，使用干燥的无菌医用纱布擦去腹部多余的酒精。接着，切开皮肤。用镊子提起腹部正中的腹直肌，并沿中线做一小切口。确保切口上缘距胸骨剑突6至8毫米，下缘距外生殖器6至8毫米。然后将预先用生理盐水浸湿的纱布放置在腹壁切口两侧，用止血钳分别固定切口上下边缘的纱布，以暴露切口。固定纱布后，用两个浸有生理盐水的棉签轻轻按压腹壁两侧。然后从切口处挤出少量肠管，并将其置于纱布上以暴露肠管。找到盲肠。用生理盐水浸湿的棉签取出肠道，直至距胃部前两厘米处，以避免触碰胰腺。将肠道从胰十二指肠韧带的近端延伸至回盲部的远端。然后从近端至远端沿整个小肠施加均匀压力，持续五分钟，直至出现小的出血点。随后，使用预先润湿的棉签小心地将全部小肠放回腹腔内。然后隔着纱布和腹壁轻轻按摩腹部 3 至 5 秒，以确保肠道位置正常，防止术后发生梗阻或扭转。接下来，向腹腔内注射 100 µL 生理盐水，以补充丢失的体液并润滑腹腔组织。然后移除纱布，对腹部切口进行两层缝合。缝合后，用干燥的无菌医用纱布轻轻擦拭腹部切口周围区域，以保持切口干燥清洁，避免血液、组织液或生理盐水残留。在切口及周围涂抹少量医用切口粘合剂，以防止术后切口裂开。待粘合剂干燥后，将小鼠置于37.5摄氏度的加热毯上，并持续监测小鼠状态，直至其完全恢复。

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免疫学与感染

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小鼠单吻合十二指肠-回肠旁路联合袖状胃切除术模型

了解通过肠道操作建立小鼠术后肠梗阻模型的方法，用于研究肠道免疫和病理生理机制。该模型有助于评估新型抗炎治疗策略并推动临床转化研究。

术后肠梗阻小鼠模型

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