Name: 微生物感染的高分辨率三维全器官断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习使用连续双光子断层扫描技术检测小鼠脾脏中的沙门氏菌，揭示抗生素治疗期间细菌持续存在的机制及其与免疫细胞的相互作用。该方法为研究宿主-病原体关系提供了高分辨率三维成像手段。

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本工作由瑞士国家科学基金会 310030_156818、310030_182315 和 NCCR_180541 AntiResist（资助 DB）提供支持。

Whole&#45;Organ Pathogen Tracking via Fluorescent Reporter Quantification

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<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
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<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细菌病原体所处的局部组织环境对于决定宿主局部免疫攻击、细菌适应性反应、宿主-病原体相互作用的局部结局以及抗菌化学治疗的效果，以及这些因素对整体疾病结局的个体化贡献至关重要。在厘米尺度的器官中对微米尺度的细菌进行成像一直具有挑战性。连续双光子（STP）断层成像技术能够提供足够的空间分辨率，以在完整器官中检测单个细菌细胞，并实现自动化切片与成像，同时具备足够的通量（约每天1个器官）11. 虽然宿主抗原可以被染色 体内，病原体细胞应表达合适的荧光蛋白，以确保对细胞内病原体细胞进行全面检测。所得数据集（0.5-1.5 TB/器官）给数据处理和存储的IT基础设施带来了巨大挑战。
该方法包含若干关键步骤。首先，需要一种能够稳定且均一表达荧光蛋白GFP或YFP的病原菌株。理想情况下，应使用染色体整合的表达盒25，以最大限度减少因质粒拷贝数变异导致的荧光异质性。荧光强度需足够，但应避免荧光蛋白过量表达，以防影响病原体的适应性23。可通过选择合适的启动子，并精细调控核糖体结合位点25或整个5'非翻译区（UTR）26，以获得适当的表达水平。第二，灌注固定前应先用缓冲液进行初步冲洗，尽可能清除血液循环中的红细胞。这一步骤对脾脏和肝脏尤为重要（尽管完全清除这些器官中的红细胞较为困难）。残留的红细胞会吸收可见光谱范围内的光线，从而降低成像质量27。第三，将固定后的组织保存在冷冻保护剂中至关重要，可降低组织自发荧光，尤其是在炎症组织中自发荧光较强，可能掩盖病原体细胞相对较弱的荧光信号11。第四，组织与周围琼脂糖块之间的有效交联对于振动切片时组织平稳切割、防止组织从琼脂糖块中弹出至关重要。第五，必须通过正交方法独立验证荧光信号并确认其为病原体细胞，例如使用针对病原体组分（如革兰氏阴性菌的脂多糖）的抗体进行染色，并对从断层成像仪获取的切片进行共聚焦显微镜观察11。某些感染组织中含有形态相似且荧光光谱重叠的自发荧光颗粒，容易被误判为病原体细胞。第六，微菌落内病原体细胞的数量应与共聚焦显微镜等正交方法进行比较，以评估定量准确性。基于这些计算所得的总体细菌载量，应通过与流式细胞术和涂布计数等正交方法的比较进行验证。
对广泛使用的STP方案的重要改进包括：在光电倍增管2前放置一个510/20 nm的窄带通滤光片11，以减少绿色-黄色自发荧光的干扰，这种自发荧光在受感染和发炎的肝脏、脾脏及派伊尔斑中尤为强烈。与以脑组织为主的应用（STP的其他主要应用）相比，这些器官具有更强的自发荧光和更高的光散射特性，因而需要更有效地校正照明不均问题。作为另一项改进，本方案采用CIDRE方法22实现该目的（图3），并结合基于人工智能的细菌分割技术。最后，通过增加在-20 °C条件下进行冷冻保护剂孵育的步骤，改变了组织预处理流程，该步骤可降低组织自发荧光，从而有助于检测荧光相对较弱的小型病原菌细胞11。
如果无法检测到病原体信号，或分割结果灵敏度不足（遗漏过多病原体细胞）或精确度不足（将过多背景颗粒误判为病原体细胞），则可能需要进行故障排除。若可检测到组织自发荧光，但病原体信号过少，则病原体中可能表达的荧光蛋白含量不足。可通过共聚焦显微镜观察同一感染组织的切片或通过流式细胞术分析组织匀浆物来验证这一情况19,28。潜在原因可能包括荧光蛋白表达水平不足或表达盒不稳定。缓解策略可包括使用其他启动子驱动表达、针对病原体物种对荧光蛋白编码基因进行密码子优化、采用具有更高拷贝数的附加体质粒构建体，或通过染色体整合或平衡致死互补系统稳定表达盒29。荧光蛋白的选择也很重要，但GFP.mut2、mWasabi、YPet和TIMERbac均可用于检测。若分割不准确，可能是由于病原体荧光信号过弱（可按上述方法解决），或组织自发荧光背景过高所致。在包埋于琼脂糖块并进行断层成像前，充分灌注洗涤液或延长储存缓冲液中的孵育时间，可能有助于解决这些问题。最后，神经网络需要足够的训练以实现精确分类，但过度训练可能导致过拟合，从而降低对新样本的分析性能。
目前，尚无其他方法能够以足够的空间分辨率对整个器官进行三维成像，从而检测单个细菌。未来在组织透明化和光片显微镜技术上的改进可能达到类似的分辨率，这或将实现更高速度的成像以及更多荧光通道的同步检测。
STP 的一个重要局限性在于其平面内像素分辨率为约 0.5 µm，垂直分辨率为 5 至 10 µm，不足以分辨位置紧密的细菌，例如在密集排列的微菌落内部。然而，可在断层扫描后回收组织切片，对选定的组织区域进行二次高分辨率共聚焦显微镜成像。STP 的另一个局限性是仅有三个荧光通道，限制了可同时成像的荧光染料数量。同样，通过对回收的组织切片采用多重检测方法进行二次分析，可以揭示更多标记物在选定组织区域中的位置和强度。这些信息可整合到由 STP 确定的周围组织的整体三维结构中。
综上所述，本方案可在局部和全器官水平上对宿主-病原体相互作用进行详细研究。该方案应易于适用于其他病原体（前提是可获得荧光标记菌株）、其他器官以及不同宿主物种。

感染发生在具有复杂解剖结构和分区生理特性的组织中。感染组织内共存的多样化微环境可决定局部病原体亚群的命运及其对整体疾病结局的贡献。1,2,3然而，在厘米级组织中对微生物病原体进行全面的三维定位仍然具有挑战性4脑及其他器官的成像是一项高度活跃的研究领域，其实验策略在不断改进5，但许多方法仍然缺乏亚微米级的分辨率&#181;m 分辨率，这是识别所必需的 &#181;微米级细菌病原体。相比之下，连续双光子（STP）断层成像技术6 可实现整个组织的自动化多色、无变形成像，具有亚微米级分辨率&#181;m 的平面分辨率，生成完整的三维体积数据集。该方法结合使用振动切片机对组织进行重复物理切片，并利用红外光对暴露的切面进行间歇性双光子成像。STP 断层扫描已广泛用于绘制脑内细小轴突的分布图，以建立神经连接图谱7,8,9,10.
STP 断层扫描还能利用断层扫描仪在全部感染组织中实现单个微生物病原体细胞（Salmonella、Toxoplasma）的三维定位11,12。二次谐波生成可显示动脉周围的胶原鞘以及脾小梁等纤维带结构，从而提供解剖学背景信息。体内注射的荧光抗体可用于标记宿主细胞，揭示单个病原体细胞与中性粒细胞等浸润性免疫细胞之间的相互作用。本文描述了包括组织处理、成像、校正光照后拼接图像瓦片、三维图像堆叠以及利用机器学习工具进行分割的完整流程。该流程可获得病原体细胞及微菌落在宿主环境中的三维位置。由于分辨率限制，对微菌落内单个细胞数量的精确计数仍较困难，但可根据微菌落的总荧光强度对细胞数量进行估算。若可获得表达重组 GFP 或 YFP 的病原体，该流程可轻松适用于其他感染模型。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Roth</td><td>货号 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>瞬干胶 Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水（TBS）</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤装置 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>Campden Instruments Limited&amp;nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI 激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可剥离塑料模具</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 断层扫描仪</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体/染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗-LPS 抗体，&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;，兔源</td><td>Sifin</td><td>货号 TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD169-PE，克隆号 3D6.112</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>142403</td><td></td></tr><tr><td>抗-Ly-6G-PE，克隆号 1A8</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡抗兔 Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td>公司</td><td>版本</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b 或更高版本</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator（断层扫描仪配套软件）</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三维可视化软件 Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 或更高版本</td><td></td></tr></tbody></table>

高分辨率三维全器官微生物感染断层成像

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

大多数感染发生在具有复杂解剖结构和局部生理状态各异的三维宿主组织中。病原体细胞在这一多样化环境中的定位显著影响其应激水平、反应、命运以及对疾病整体进展和治疗失败的贡献。然而，由于在厘米尺度的宿主器官中定位微米尺度病原体细胞存在技术困难，这一研究领域尚未得到充分探索。 &#181;微米级病原体细胞在厘米级宿主器官内的定位，这一研究领域尚未得到充分探索。本文提出了一种应对该挑战的方法。我们采用连续双光子断层扫描结合人工智能增强的图像分析技术，以定位单个 沙门氏菌 感染小鼠整个脾脏、肝叶及完整淋巴结中的细胞。利用荧光报告基因和 在体内 抗体给药，单个细菌的复制速率 沙门氏菌 细胞，其与特定免疫细胞的局部相互作用，以及细菌对抗生素的反应均可被确定。这些方法为在三维组织环境中对感染、预防及治疗进行全面研究开辟了途径。

该方法可检测整个小鼠器官（如脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结和派伊尔集合淋巴结）中的单个Salmonella细胞（图5和图6）11。该方法还可检测小鼠脑组织中的Toxoplasma gondii寄生虫12。某些感染组织（包括肝脏、派伊尔集合淋巴结和脾脏）在绿色至黄色波段具有较强的自发荧光。使用甲醛固定会进一步增强自发荧光，但该步骤对于维持组织结构是必需的。为提高在自发荧光背景下对GFP、mWasabi以及TIMERbac绿色组分的绿色荧光信号的检测效果，可在第二光电倍增管（用于收集绿色发射光）前安装510/20 nm窄带通滤光片（可透过大部分GFP发射光，同时阻断大部分自发荧光光谱），并可通过将固定后的组织在冷冻保护剂中保存3天或更长时间以降低组织自发荧光11。然而，细菌细胞仍需表达每细胞至少数千个拷贝的GFP或其他荧光蛋白。另一方面，应避免荧光蛋白表达水平过高，以尽量减少可能引起毒力减弱的适应性代价23。
通过成像后对回收的组织切片进行免疫组织化学染色，可验证组织中荧光细菌的正确分割。具体而言，使用针对细菌表面组分（如脂多糖）的抗体进行染色的结构，可与STP断层扫描获得的荧光图像进行比对对齐图5）。需要注意的是，某些染色的 沙门氏菌 细胞缺乏荧光蛋白，因此在共聚焦显微镜和STP断层扫描中均无法检测到荧光信号。这些细胞为 沙门氏菌 由流式细胞分选及单个分选细胞的培养生长实验所证实，这些细胞已被宿主免疫系统杀死，且琼脂平板上的菌落形成单位数量与荧光标记细胞数量之间存在密切的相关性 沙门氏菌 通过流式细胞术确定的细胞24此外，质粒丢失可能导致产生无荧光的活细胞，这需要通过在含有和不含对应于质粒上选择标记的适当抗生素的培养基上进行涂布培养来检测。对于源自pSC101的质粒，质粒丢失 体内 罕见19对于大多数染色体整合的表达盒，例如 sifB::gfp 用于11，表达缺失无法被检测到 体内如果分割结果与免疫组织化学数据不一致，则需要修改分割流程。
STP 断层扫描的分辨率不足以分辨出紧密堆积的微菌落中的单个细菌细胞。然而，微菌落的总荧光强度可用于估计其细胞数量 沙门氏菌 细胞。这需要一种具有高度均一荧光水平的荧光菌株，例如 沙门氏菌 sifB::gfp11. 结合估算的数量 沙门氏菌 所有微菌落和单个细胞的计数所得的总细菌组织载量与平板计数或组织匀浆物流式细胞术等替代方法的结果一致11接种培养与流式细胞术无法直接使用同一组织样本进行，因为这些组织需经灌注固定以用于STP断层扫描。因此，接种培养与流式细胞术必须使用未经固定的额外动物样本。若不同方法所测定的细菌载量中位数相差超过3倍，则可能存在荧光标记细菌活力受损（菌落形成单位较低时）或部分细菌丢失了荧光报告基因构建体（菌落形成单位较高时）的情况。此时需进行对照实验，以确定此类差异的来源。
STP断层扫描可实现细菌细胞在感染组织三维结构中的定位。胶原的二次谐波信号可提供解剖学标志，如动脉和小梁。此外，宿主细胞可进行染色 体内 通过在灌注前注射针对表面标志物的抗体（图5 和 图6）。该染色可为组织区室及特定微环境提供额外的解剖标志，包括炎症病灶（某些细胞内标记物以及具有扩散屏障的区室，如脾脏白髓或脑组织，不易被此类方法标记） 体内 染色）。该方法揭示了脾脏白髓作为一个组织区室，能够支持长期存活 沙门氏菌 在抗菌化学治疗期间11.
最后，利用表达timerbac（一种用于报告单细胞复制速率的报告系统）的菌株，可识别并定位在组织三维结构中以中等或较慢速率复制的Salmonella11,15。
<img alt="经心灌注、双光子图像采集、基于机器学习的分割；断层扫描示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：利用连续双光子（STP）断层扫描进行全器官成像的流程图。（A-B）经心灌注后取出器官，并在4 °C条件下于4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。（C-E）将器官包埋于氧化琼脂糖中并交联，随后使用STP断层扫描技术对组织进行扫描和切片，切片被收集用于后续免疫组织化学分析。（F-J）用于定量细菌数量、验证荧光标记细菌以及重建细菌三维定位的计算分析流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="光谱学装置；光学激发方法；显示光吸收分析的实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：连续双光子（STP）断层扫描装置。（A）断层扫描仪，包含（B）双光子成像模块和（C）自动连续切片系统。（D）收集的组织切片，用于后续分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="拼接过程示意图；原始数据到CIDRE校正；图像分析增强。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：图块拼接与照明校正。 使用基于正则化能量最小化的校正强度分布（CIDRE）方法对图块进行拼接，并校正不均匀的照明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下基于分割与分类的荧光分析；数据散点图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：分割 沙门氏菌 使用支持向量机（SVM）和卷积神经网络（CNN）表达绿色荧光蛋白（GFP）。 (A) 由支持向量机（SVM）分割的GFP对象的代表性图像（左）及对应的SVM分割区域图像（右）（比例尺： 10 µm). (B) 分割区域的红绿蓝（RGB）值聚类分布。C非GFP物体被支持向量机误识别为细菌的代表性图像（左）。卷积神经网络正确将其判断为背景（右，比例尺： 10 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="双光子层析成像与共聚焦显微镜，组织成像，抗Ly6G，胶原蛋白，GFP" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5检测 沙门氏菌 通过断层扫描技术表达绿色荧光蛋白（GFP），并经免疫组织化学验证。 同一区域经断层扫描（左）或使用抗体染色后经共聚焦显微镜成像的图像 沙门氏菌 脂多糖（右侧）。中性粒细胞（红色）经染色后显示 在体 灌注前注射PE标记的抗Ly-6G抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学图谱，CD169与胶原蛋白标志物可视化，显微镜观察，组织结构分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图63D 重建与定位 沙门氏菌 在感染小鼠脾脏中。 (A5毫米厚脾脏切片的三维（3D）重建及染色 体内 灌注抗CD169抗体（红色）之前。蓝色信号代表通过二次谐波检测到的胶原。B) 显示于（A）中的三维图像堆栈的一个光学层面。所示位置为 沙门氏菌 细胞或微菌落用星号标示。C3D 重建 沙门氏菌 感染肝脏中的位置（星号）。动脉根据其胶原鞘（蓝色）可见。比例尺：1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文描述了一种能够在感染期间实现全器官范围内病原菌检测以及荧光报告基因活性定量的实验方法。

大多数感染发生在具有复杂解剖结构和局部生理特性动态变化的三维宿主组织内。病原体的定位……

细菌感染对人类健康构成重大威胁。抗菌药物耐药性日益增加，且目前仍缺乏针对多种主要病原体的疫苗。为了寻找新的防控策略，我们需要更深入地了解病原体在感染组织中如何响应宿主免疫系统以及抗生素的作用。存活的细菌可能导致感染复发，如果抗菌药物未能彻底清除感染。通过连续断层扫描，我们发现引起伤寒的沙门氏菌可在治疗期间持续存在于脾脏的特定区域。该区域的炎症反应较弱，从而破坏了抗生素与炎症反应之间的关键协同作用，影响了病原体的有效清除。细菌是微米级的物体。在组织环境中定位如此微小的物体十分困难。连续双光子断层扫描技术能够在厘米级的器官中检测到单个细菌，并确定其复制速率。我们还可以检测免疫细胞（例如中性粒细胞），并确定它们与细菌之间的空间关系。我们研究抑菌性抗生素的活性。这类抗生素能够治愈感染，尽管它们只能抑制细菌生长，而不能直接杀死病原体。我们还研究缺乏特定毒力因子的细菌突变体的扩散情况，以及免疫缺陷对感染和治疗的影响。首先，用镊子夹取已解冻的沙门氏菌感染小鼠组织样本，迅速将其插入含有液体琼脂糖的塑料模具底部。聚合完成后，使用手术刀从塑料模具的角落将其打开。将刀片安装到切片机上后，用戴着手套的手指将样品转移至样品盒中。将样品置于切片机下，使琼脂糖的上表面与切片机刀片处于同一水平位置。移动载物台，使琼脂糖块位于物镜中心。在断层扫描软件中点击切片按钮，直至获得完整的琼脂糖块切片。接着，将物镜在 X 和 Y 方向上对准组织样品中心。启动激光软件，将波长调节至800纳米，然后打开激光器。关闭显微镜的柜门，随后关闭房间内的所有光源。打开光电倍增管（PMTs），并将电压设为 750 伏。将显微镜快门设为自动，然后将 V1 和 V2 的电压分别设为 20 和 1.71。使用 Z 轴压电装置调节 Z 轴，直至到达组织表面。切取多片厚度为50微米的切片。接下来，定义样本边缘。将成像区域限定在组织范围内，尽量减少对周围琼脂糖的成像。关闭PMT后，将激光波长设置为800纳米。在移动载物台的同时，利用激光光斑确定组织边缘的坐标。确认坐标后，将激光光斑定位在右前方中心位置。现在，将波长更改为 940 纳米。将显微镜快门设置为自动模式，并将快门电压设置为 V1 为 20，V2 为 1.71。按下 3D 马赛克设置选项以开始扫描。成像完成后，从水箱中收集组织切片。为了拼接图块图像，首先将数据从断层扫描仪服务器传输到Linux计算机。打开MATLAB脚本StepOneStitchingAndArchive.m，并定位源文件夹。切换到编辑器选项卡并点击运行。进度信息将显示在命令窗口中。在源文件夹内名为 stitchedimages_100 的子文件夹中查找拼接后的图像。使用 tar 命令压缩原始数据，并将其保存为扩展名为 tar.bz2 的单个文件。为训练支持向量机，预览拼接后的图像。使用 Fiji 打开每个子文件夹中同名文件的一个图像。将三个通道合并为一幅彩色图像，并调整每个通道的亮度，直至观察到细菌和组织自发荧光的清晰信号。记录每个通道调整后的最大强度值。接下来，打开 MATLAB 脚本 StepTwoSegmentationAndAnalysis.m。定义用于训练的源文件夹和图像名称，然后转到编辑器选项卡并点击运行。当弹出要求输入颜色阈值的对话框时，根据之前使用Fiji进行的手动检查结果填入相应数值。根据对话框提示，选择背景区域和感兴趣区域。将显示图表，表明模型的训练效果，并提示是否需要添加更多区域。继续添加更多感兴趣区域和背景，直到细菌能够被清晰地分割。分割过程将自动运行，进度可在命令窗口中查看。接下来，打开包含胶原蛋白二次谐波信号的蓝色通道图像。将第一个通道的图像在 X 和 Y 轴方向上均进行十倍二值化缩减，并将缩小后的图像保存到新文件夹中。在同一文件夹内创建三份缩小后图像的副本。进行三维可视化时，在全景视图中启动 Imaris 可视化软件包。随后打开 IMS 或 TIF 文件。在显示调整窗口中调节不同通道的颜色表示。在编辑菜单下点击图像属性，手动设置最小值或最大值以及伽马校正值。调整图像显示效果后，使用快照工具导出当前视图。使用导航指针找到所需视图，然后使用加号添加关键帧。使用动画图标将三维数据表示为视频。按下红色录制按钮以生成视频，然后将其保存到目标文件夹并选择所需的文件类型。在整个小鼠器官（如脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结）中检测到了单个沙门氏菌细胞。通过免疫组织化学证实了荧光细菌的分割。在灌注前，通过注射针对表面标志物的抗体对宿主细胞进行体内染色。

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