Name: CMOS集成高密度微电极阵列上多模态大规模神经元集成动力学的记录与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 探索高密度CMOS微电极阵列技术，用于记录和分析海马体、嗅球及人源iPSC神经元网络的大规模神经集群动力学。该方法实现高时空分辨率的多模态无标记记录，为神经环路功能与疾病机制研究提供先进工具。

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本研究得到了德国神经退行性疾病中心（DZNE）机构资金、亥姆霍兹协会亥姆霍兹验证基金（HVF-0102）以及德累斯顿国际生物医学与生物工程研究生院（DIGS-BB）的支持。我们还要感谢DZNE德累斯顿行为动物测试平台（Alexander Garthe、Anne Karasinsky、Sandra Günther 和 Jens Bergmann）提供的支持。我们谨此说明，图1的部分内容使用了BioRender.com平台绘制。

Multimodal Large-Scale Neural Recordings and Analysis on HD-MEA 

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

由相互连接的神经元群体所产生的时空神经元活动的复杂动态，长期以来一直是神经科学领域引人关注的研究课题。传统的研究方法，如膜片钳、标准多电极阵列（MEA）和钙离子（Ca2+）成像，已为揭示大脑的复杂性提供了宝贵的见解。然而，这些方法往往难以全面捕捉整个神经网络范围内的计算动态21,22,23。本 JoVE 研究中详述的高密度多电极阵列（HD-MEA）平台的技术操作流程代表了重大进步，能够从细胞集群到大规模神经网络（即急性离体小鼠脑片以及体外人诱导多能干细胞神经网络）等多种模型中，全景式地观测神经动态26,29,30,32。
急性， 离体 小鼠脑切片一直是神经元研究中的基础工具，有助于在分子和神经环路水平上开展研究6,7然而，维持组织活性的难题一直是该领域持续存在的瓶颈。本研究中详述的方案引入了若干关键性改进，以优化脑片的质量与存活时间，从而充分发挥其在高密度微电极阵列（HD-MEA）平台上的优势。该方案强调了以下要点：i）实现脑片的均一性，推荐使用振动切片机（vibratome）而非组织切片器（tissue chopper），因其具有更高的精度并可最大限度减少组织损伤，尽管切割时间相对较长；ii）从组织提取到记录全过程持续通入碳氧混合气（carbogen），以维持组织活性；iii）严格调控温度，并在记录前给予充分的恢复时间；iv）使用琼脂糖块或模具固定脑组织，以防止撕裂并减少胶水接触面积；v）在HD-MEA储液池中维持适宜流速的碳酸化人工脑脊液（carbogenated aCSF），以保障脑片健康，同时避免去耦合、噪声和信号漂移等问题。表 2).
对于小鼠脑切片和人源iPSC样本，增强电极与组织界面的耦合至关重要30,46,47。本方案强调使用促进黏附的分子聚-DL-鸟氨酸（Poly-dl-ornithine, PDLO）的重要性。该分子不仅能增大用于检测电信号的表面积，还可提高电导率46。通过这种方式，PDLO促进细胞黏附、生长以及功能性神经网络特性的形成。此类优化在提升高密度微电极阵列（HD-MEA）平台效能方面发挥关键作用，从而确保对微尺度ex-vivo和in-vitro连接组及其时空放电序列进行准确且一致的分析。值得注意的是，已有研究表明，PDLO在促进神经元培养物的自发性放电活动以及对电刺激的响应能力方面优于其他基质材料，如聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）和聚-L-鸟氨酸（poly-l-ornithine, PLO）。此外，PDLO已被用于HD-MEA表面的功能化修饰，可增强电极与脑切片之间的界面耦合，提高嗅球（OB）和海马体（HC）切片记录中的信噪比26,29。通过添加定制的铂金锚定装置，可进一步增强电极与脑切片之间的界面耦合，从而获得更高信噪比的记录结果。
利用高密度微电极阵列（HD-MEA）进行两者 离体 小鼠脑切片和 体外 人类诱导多能干细胞网络引入了一种擅长探索广泛、多尺度和多模态动态的方法。然而，这种创新方法也带来了相当大的挑战，尤其是在数据管理方面48,49,50,51单次高密度微电极阵列（HD-MEA）记录以每电极18 kHz的采样频率运行，可产生高达155 MB/s的数据量。当涉及多个脑片、不同药理条件或长时间记录时，数据量迅速增长。如此庞大的信息流对强大的存储基础设施和先进的计算工具提出了迫切需求，以实现高效的数据处理。HD-MEA平台能够同时采集数千个神经元集合的信号，这一优势既是突破，也带来挑战。它为揭示大脑功能的计算动态提供了前所未有的洞察力，但也要求建立更为精细的分析框架。在本JoVE实验方案中，我们展示了大规模事件检测、分类、图论分析、频域分析及机器学习等计算策略的应用实例。这些方法体现了科研人员为应对复杂神经数据解析难题所付出的持续努力。然而，针对此类多维神经数据集，仍需进一步开发更先进的计算分析工具。借助恰当的技术手段与方法体系，HD-MEA平台的潜力将被显著放大，为深入理解健康与疾病状态下大脑功能的复杂机制提供重要支持。
本质上，当高密度微电极阵列（HD-MEA）平台与本文讨论的详细实验方案及计算工具相结合时，为理解大脑复杂的运作机制提供了一种变革性的方法。通过捕捉大规模、多尺度和多模态的动态活动，该平台为学习、记忆和信息处理等过程提供了宝贵的见解。此外，其在体外人源诱导多能干细胞（iPSC）神经网络中的应用有望彻底改变药物筛选和个性化医疗。然而，尽管该平台代表了神经科学研究的重大进步，仍必须认识到并解决其固有的技术挑战。随着持续的优化以及先进计算工具的整合，HD-MEA平台有望 usher in 一个精准诊断工具、特异性生物标志物识别以及神经系统疾病靶向治疗的新时代。

神经元集合，常被称为细胞群，对神经编码至关重要，能够促进复杂计算以处理多尺度的神经信息1,2,3。这些神经元集合构成了广泛的神经网络及其精细的微环路4。此类网络及其振荡模式推动了包括感知和认知在内的高级脑功能。尽管已有大量研究探讨了特定类型的神经元和突触通路，但神经元如何协同形成细胞群，并影响跨回路与网络的时空信息处理，目前仍不清楚5。
急性， 离体 脑切片是研究完整神经回路的关键电生理工具，可提供受控环境，用于探究神经功能的振荡活动模式、突触传递和连接性，同时在药理学测试和疾病建模中具有重要应用价值6,7,8本研究方案重点介绍两个关键脑回路——参与学习与记忆过程的海马-皮层（HC）回路9,10，以及负责气味分辨的嗅球（OB）11,12,13在这两个区域，哺乳动物大脑终生通过成体神经发生持续产生新的功能性神经元。14两个回路均表现出多维的动态神经活动模式和内在可塑性，这些特性参与重构现有神经网络，并在需要时促进替代性的信息处理策略15,16.
急性， 离体 脑切片模型对于深入探究脑功能及在微环路水平上理解疾病机制至关重要。然而， 体外 源自人诱导性多能干细胞（iPSCs）神经元网络的细胞培养为转化研究提供了有前景的途径，可将动物实验的研究发现无缝衔接至潜在的人体临床治疗17,18. 这些以人为中心的 体外 检测方法为评估药理学毒性提供了可靠平台，有助于精确的药物筛选，并推动基于细胞的创新治疗策略的研究19,20认识到iPSC神经元模型的关键作用，本方案研究的第三部分致力于深入探究其衍生神经网络的功能特性，并优化相关的细胞培养方案。
这些具有电生理活性的神经模块通常采用钙离子（Ca2+成像）、膜片钳记录以及低密度微电极阵列（LD-MEA）等技术进行研究。尽管Ca2+成像能够实现单细胞水平的活动图谱绘制，但它依赖于细胞标记，且受限于时间分辨率较低以及长期记录困难等问题。LD-MEA空间精度不足，而膜片钳作为一种侵入性单点技术，操作繁琐，通常成功率较低21,22,23。为应对这些挑战并有效探测全网络范围的神经活动，大规模同步神经记录已成为理解大脑复杂性背后神经动力学计算原理及其在健康与疾病中意义的关键方法24,25。
在本 JoVE 实验方案中，我们展示了一种基于高密度微电极阵列（HD-MEA）的大规模神经记录方法，用于捕捉多种脑组织模式下的时空神经元活动，包括来自海马体和嗅球回路的神经活动 离体 小鼠脑急性切片图1A-C）和 体外 人iPSC来源的神经元网络（图1D-E），此前已由本课题组及其他同事报道26,27,28,29,30,31,32,33,34,35基于互补金属氧化物半导体（CMOS）技术的高密度微电极阵列（HD-MEA）具有片上电路和放大功能，可实现跨7 mm区域的亚毫秒级记录2 阵列大小36该非侵入性方法利用4096个微电极，以高时空分辨率同时记录数千个神经元集群的多部位、无标记细胞外放电模式，揭示局部场电位（LFPs）和多单元放电活动（MUA）的复杂动态特征26,29.
由于该方法产生的数据量巨大，因此需要一个复杂的分析框架，但这同时也带来了挑战37。我们开发了涵盖自动事件检测、分类、图论、机器学习及其他先进分析技术的计算工具（图1F）26,29,38,39。通过将高密度微电极阵列（HD-MEA）与这些分析工具相结合，构建了一种整体性研究方法，可用于探究从单个细胞集群到跨多种神经模式的更大规模神经网络的复杂动态过程。这种综合方法加深了我们对正常脑功能中计算动态的理解，并为病理状态下存在的异常提供了新的见解28。此外，该方法所获得的洞察有望推动类脑建模、神经形态计算以及神经学习算法的发展。最终，该技术有望揭示神经网络功能紊乱的核心机制，发现潜在的生物标志物，并指导针对神经系统疾病的精准诊断工具和靶向治疗策略的开发。

<table><tbody><tr><td>150 毫米玻璃培养皿</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>脑组织准备工作站，脑切片记录工作站</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 无菌滤器单元&amp;nbsp;</td><td>混合</td><td>混合</td><td>各种</td></tr><tr><td>90 mm 塑料培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>脑组织准备工作站，脑切片记录工作站</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Roth</td><td>6351.5</td><td>脑组织制备工作区</td></tr><tr><td>琼脂糖模具</td><td>定制</td><td>定制</td><td>脑组织制备工作区；定制设计的3D打印机，可根据需求提供</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>麻醉室</td><td>通用的</td><td>通用</td><td>脑提取工作区；各种烧杯、垫料等</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>各种烧杯</td><td>通用</td><td>通用的</td><td>溶液配制工作区；50 mL</td></tr><tr><td>各种鲁尔接头</td><td>Cole Parmer</td><td>45511-00</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>各种规格的容量瓶</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>溶液配制工作区；500 mL，1 L</td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>BrainXell 商业供应商操作规程</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>带有紫外灯的生物安全柜</td><td>各种</td><td>各种</td><td>高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作区</td></tr><tr><td>BrainPhys神经元培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>05790&amp;nbsp;</td><td>CDI 和 BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>脑电波软件</td><td>3Brain AG</td><td>版本 4</td><td>脑切片与人源iPSC记录工作站</td></tr><tr><td>BrainXell&amp;nbsp;谷氨酸能神经元检测&amp;nbsp;</td><td>BrainXell</td><td>&amp;nbsp;BX-0300&amp;nbsp;</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>碳合气</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>所有工作区；95% O₂/5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 混合物</td></tr><tr><td>细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td>各种</td><td>各种</td><td>各种</td></tr><tr><td>基于CMOS的高密度微电极阵列芯片</td><td>3Brain AG</td><td>定制</td><td>脑切片与人源iPSC记录工作站</td></tr><tr><td>锥形管，50 mL，Falcon（离心管）&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>38010&amp;nbsp;</td><td>CDI 商业供应商方案</td></tr><tr><td>鳄鱼夹接地线</td><td>JWQIDI</td><td>B06WGZG17W</td><td>脑片记录工作区</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>FST</td><td>11052-10</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;11330-032</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙的磷酸盐缓冲液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; (D-PBS)</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>37350&amp;nbsp;</td><td>CDI 商业供应商方案</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Macherey-Nagel</td><td>531 011</td><td>脑组织制备工作区</td></tr><tr><td>细毛刷</td><td>Leonhardy</td><td>773</td><td>脑片制备工作站，脑片记录工作站</td></tr><tr><td>镊子</td><td>VITLAB</td><td>67895</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>巴斯德玻璃吸管</td><td>Roth</td><td>4518</td><td>脑片制备工作区，脑片记录工作区</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>重力驱动灌注系统</td><td>ALA</td><td>VC3-8xG</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>高密度微电极阵列记录平台</td><td>3Brain AG</td><td>定制</td><td>脑切片与人源iPSC记录工作站</td></tr><tr><td>加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>血细胞计数板或自动细胞计数仪</td><td>混合</td><td>各种</td><td>高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作流程</td></tr><tr><td>低流量针头</td><td>Warner Instruments</td><td>641489</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>iCell GlutaNeurons 试剂盒，01279&amp;nbsp;</td><td>CDI</td><td>R1061&amp;nbsp;</td><td>CDI 商用供应商方案</td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Vantage</td><td>V95-304</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>巴克斯特</td><td>HDG9623</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-250G</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>层粘连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L2020&amp;nbsp;</td><td>CDI 商业供应商方案</td></tr><tr><td>液氮储存装置&amp;nbsp;</td><td>各种</td><td>各种</td><td>高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作流程</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>金属螺钉</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138-250G</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>显微解剖工具架&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>脑片制备工作站，脑片记录工作站</td></tr><tr><td>显微解剖工具针</td><td>布劳恩&amp;nbsp;</td><td>9186166</td><td>脑片制备工作区，脑片记录工作区</td></tr><tr><td>模块化体视显微镜</td><td>Leica</td><td>定制</td><td>脑片记录工作站；定制规格与改造</td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 补充材料</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>CDI 和 BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-1KG</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751-100G</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>光学笼系统</td><td>Thorlabs</td><td>各种</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>带面包板的光学平台</td><td>Thorlabs</td><td>SDA7590</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>PDLO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0671</td><td>高密度微电极阵列涂层，脑切片记录工作区</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>15140-122&amp;nbsp;</td><td>CDI 商业供应商方案</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>TipONE</td><td>S1120-8810</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td>各种</td><td>各种</td><td>各种</td></tr><tr><td>铂金锚定器</td><td>定制</td><td>定制</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>各种</td><td>各种</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>泵</td><td>MasterFlex</td><td>78018-22</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>阿波罗</td><td>10179960</td><td>脑组织制备工作区</td></tr><tr><td>参比电极细胞培养帽</td><td>定制</td><td>定制</td><td>人类诱导多能干细胞记录工作站；定制设计的3D打印机设计，可根据要求提供</td></tr><tr><td>橡胶移液球</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>292000205</td><td>脑片制备工作站，脑片记录工作站</td></tr><tr><td>血清移液管，1 mL，2 mL，5 mL，10 mL，25 mL</td><td>各种</td><td>各种</td><td>各种</td></tr><tr><td>切片恢复室</td><td>定制</td><td>定制</td><td>脑片恢复工作区；定制设计的3D打印装置，可根据要求提供</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>ISOLAB</td><td>047.06.150</td><td>脑组织制备工作区</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100-1KG</td><td>溶液配制工作区</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>UHU</td><td>358221</td><td>脑片制备工作区</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Peters Instruments</td><td>BC 344</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>各种</td><td>各种</td><td>各种</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td>BrainXell 商业供应商方案</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>通用的</td><td>通用的</td><td>脑提取工作区</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>07050&amp;nbsp;</td><td>CDI 商业供应商方案</td></tr><tr><td>正置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>定制</td><td>成像工作区；自定义规格与改造</td></tr><tr><td>Vacusip</td><td>Integra</td><td>159010</td><td>脑片记录工作站</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td>脑切片制备工作台；包含：样本托盘、缓冲液托盘、冰盒、样本托盘固定工具、振动切片机刀片调节工具</td></tr><tr><td>振动切片机刀片</td><td>Personna</td><td>N/A</td><td>脑片制备工作区</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Lauda</td><td>L000595</td><td>脑片恢复工作区</td></tr></tbody></table>

在cmos集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

大规模神经元网络及其复杂的分布式微环路对于产生感知、认知和行为至关重要，这些功能源自神经元时空活动的特定模式。由相互连接的神经元集合体所构成的功能性神经群产生的动态活动模式，能够精确计算并处理多尺度神经信息，从而驱动大脑的高级功能。为了探究产生这种复杂性的神经动力学计算原理，并研究生物过程在健康与疾病状态下对神经系统的多尺度影响，大规模同步记录技术已成为关键手段。本文采用高密度微电极阵列（HD-MEA）来研究两种神经动力学模式——海马体和嗅球神经环路 离体 小鼠脑切片及神经元网络 体外 人诱导多能干细胞（iPSCs）的细胞培养。该HD-MEA平台配备4096个微电极，能够在高时空分辨率下非侵入性地同时记录数千个神经元集合的多部位、无标记细胞外放电模式。该方法可用于表征多种全网络电生理特征，包括单/多单元放电活动模式以及局部场电位振荡。为深入分析这些多维神经数据，我们开发了多种计算工具，整合了机器学习算法、自动事件检测与分类、图论及其他高级分析方法。通过将这些计算流程与该平台相结合，我们提供了一种研究从细胞集群到神经网络的大尺度、多尺度及多模态动态的方法学。该方法有望增进我们对健康与疾病状态下复杂脑功能和认知过程的理解。秉持开放科学的理念，并深入探索大规模计算神经动力学，有望推动类脑建模、神经形态计算和神经学习算法的发展。此外，阐明大规模神经计算功能障碍及其相互关联的微环路动力学的潜在机制，可能有助于发现特异性生物标志物，为神经系统疾病的精准诊断工具和靶向治疗策略开辟新途径。

多模态时空映射与振荡性放电特征提取 
为了量化由动态神经元集合产生的全网络LFP和脉冲事件，我们研究了海马体（HC）和嗅球（OB）回路以及人源iPSC神经网络中的同步大规模放电模式。对步骤3.2中记录的脑片回路和步骤3.3中记录的iPSC神经网络，依据本方案的步骤4.1–4.2进行分析。首先，对所有记录的数据集进行事件检测与去噪处理，并根据各回路的区域特性进行空间分辨。随后，绘制平均大规模LFP和脉冲放电模式的拓扑伪彩色空间图、已检测事件的点阵图，以及滤波后波形的代表性5秒轨迹图图3A-I). 将大规模局部场电位（LFP）和脉冲放电率模式的地形伪彩色图叠加在显微镜拍摄的海马体（HC）光学图像上图3A)，OB（图3B）以及人iPSC神经元网络（图 3C）。这使得能够研究单个环路及基于网络的振荡模式和响应。HC和OB的点阵图包含了在60秒时间窗内，按HC环路的DG、Hilus、CA3、CA1、EC和PC层以及OB网络的ONL、OCx、GL、PL和GCL层分类记录的LFP事件检测次数。图3D,E）。人类诱导多能干细胞（iPSC）栅格图显示了互连培养网络在20秒时间窗内同步记录到的尖峰事件图3G）。接下来，来自大规模高密度微电极阵列（HD-MEA）记录位点的5秒代表性事件轨迹显示了海马体（HC）中记录到的多种振荡频率（即CA3区选定电极）图3G) 和 OB（即 GL 中选定的电极）(图 3H）神经回路及来自阵列中四个选定有源电极的人类iPSC神经网络的多单元簇状放电活动图 3I）。这些典型信号展示了生物信号特征，包括低频局部场电位振荡（1-100 Hz），经带通滤波的δ、θ、β和γ频段；尖波涟漪（SWR）（140-220 Hz）；以及高频的单单位放电和多单位放电活动（MUA）（300-3500 Hz）。最后，采用功率谱密度（PSD）分析，对从高密度微电极阵列（HD-MEA）记录的海马（HC）与嗅球（OB）相互连接回路中特定振荡频段的功率强度进行同步量化。 (图3J,K).
多模态全网络功能连接组 
为了从同时活跃的神经元集合的同步放电模式中推断多层神经网络的大尺度连接性，根据方案第4.2.6步计算了检测事件中活跃电极对之间的互协方差。在此，相关系数依据海马体（HC）和嗅球（OB）回路中的层次进行排序，而在诱导多能干细胞（iPSC）网络中则不进行排序，随后存储于一个对称矩阵中。通过应用多元格兰杰因果性分析和有向传递函数（DTF）来量化一个时间序列对另一个时间序列的影响，并评估不同网络中相关连接内的定向信息流，从而生成HC和OB回路的功能连接组图谱。HC（图4A）和OB（图4B）的连接组映射及网络可视化使用Gephi程序9.2版本（https://gephi.org）完成。为比较HC和OB脑片回路，在功能连接上施加了类似的参数约束，并展示了检测到的局部场电位（LFP）事件100秒内的功能连接性。节点根据其度强度进行缩放，节点颜色表示所在层次，连接线颜色用于区分层内和层间连接。人类iPSC网络的功能连接组通过应用时空滤波器（STF）和距离依赖性潜伏期阈值（DdLT）生成，以增强显著连接的选择，并通过滤波和归一化的互相关直方图（FNCCH）分析进一步优化有意义连接的识别。在全高密度微电极阵列（HD-MEA）芯片上的人类iPSC网络连接组映射（图4C）可视化亦使用Gephi完成。节点颜色表示兴奋性或抑制性输入，连接线颜色标识连接关系。
<img alt="多模态生物杂化神经电子平台示意图；神经回路、光学成像、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：基于大规模高密度微电极阵列（HD-MEA）的实验与计算平台概览。 （A）我们采用基于CMOS的高密度微电极阵列（HD-MEA）构建的多模态生物杂化神经电子平台的等轴测示意图，用于记录海马体（HC）、嗅球（OB）以及人诱导多能干细胞（iPSC）来源神经回路和网络的神经动态。 （B）小鼠脑切片及其工作流程示意图，用于获取海马体（HC）和嗅球（OB）脑片。 （C）大规模放电模式的拓扑图，显示同时记录的整个海马体（HC）和嗅球（OB）脑片的放电活动，并与提取的细胞外动作电位波形叠加于脑片的光学图像上。 （D）来源于人类的诱导多能干细胞（iPSC）神经元网络的示意图。 （E）荧光显微图像，显示位于HD-MEA芯片上整个人类神经元网络中细胞核c-fos表达以及胞体/树突MAP-2标记（左图），并与全网平均放电活动图匹配（右图）。 （F）计算框架，包含先进的数据分析、连接性图谱绘制以及人工智能/机器学习工具，用于分析从大规模HD-MEA记录中获得的多维神经数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在高密度微电极阵列上进行脑片离体实验，用于神经网络记录与成像的装置设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：布局用于 离体 脑切片和 体外 人iPSC培养准备与记录工作区 (A) 示意图显示了制备HC和OB脑片的实验流程，包括各工作区所需的工具和设备。 (B人iPSC培养制备的示意图，包括所需的工具和设备。完整的材料清单见步骤1.2.2、2.1、2.2、3.1.1、3.3及后续部分 材料表. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="海马-嗅觉环路；神经元活动热图；脉冲图；频谱数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：绘制并提取网络动态的时空模式。 （A-C）基于五分钟记录数据计算得到的平均局部场电位（LFP）和脉冲频率空间图，叠加于显微镜明场图像之上。 （D-F）栅格图，显示在60秒数据子样本中检测到并去噪后的LFP事件，以及在20秒数据子样本中的脉冲。 （G-I）从栅格图数据子样本中一个5秒片段（在栅格图中以红色高亮标出）提取的代表性波形轨迹，显示为原始LFP振荡频带（1-100 Hz）；包括δ（1-4 Hz）、θ（5-12 Hz）、β（13-35 Hz）和γ（35-100 Hz）频带；尖波涟漪（SWR，140-220 Hz）；以及高频单单位和多单位活动（MUA）脉冲（300-3500 Hz）。 （J,K）快速与慢速振荡LFP（1-100 Hz）及SWR（140-220 Hz）的功率谱密度图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="海马体、嗅球和iPSC神经元网络示意图；神经回路图及连接性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：多模态全网络功能连接组的组织结构。（A-C） Gephi图谱展示节点功能连接性，其中节点对应于下方示例颜色条图例（下方），连接线（或边）的颜色则与所连接的节点匹配。图（A）海马体（HC）、（B）嗅球（OB）和（C）诱导多能干细胞来源神经元（iPSC）层的示例图例显示在一个64 × 64阵列上。为便于可视化，HC和OB层的数据在100秒的时间窗口内进行绘制，以有效减少可见节点和连接的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：脑片制备用溶液及iPSC神经元培养基质。（A）用于离体脑片制备的高蔗糖切割溶液。（B）用于离体脑片制备与记录的aCSF记录溶液。（C–D）人神经元iPSC培养基质方案，其中（C）为BrainPhys完全培养基，用于细胞复苏、HD-MEA芯片包被及培养中HD-MEA的维持；（D）为用于HD-MEA细胞铺板的点样培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：常见高密度微电极阵列（HD-MEA）记录采集问题的故障排除。 列出了与高密度微电极阵列芯片、记录平台、系统噪声及软件相关的常见问题、可能原因及相应的故障排除解决方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

在此，我们采用高密度微电极阵列（HD-MEA）深入研究大规模神经元群集的计算动力学，特别是在海马体、嗅球环路以及人类神经元网络中的应用。通过捕捉时空电活动并结合计算工具，可深入了解神经元群集的复杂性。该方法有助于增进对脑功能的理解，并有望为神经系统疾病发现生物标志物和治疗方法。

在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

大规模神经元网络及其复杂的分布式微环路对于产生感知、认知和行为至关重要，这些功能源自……

我们的研究通过整合基于高密度CMOS的微电极阵列，探索神经技术的前沿领域，以解码大规模神经网络中的神经通信。我们致力于揭示神经信息在不同尺度上如何被精细编码，从而加深对健康与疾病状态下大脑功能及功能障碍的理解。在探索神经元集群研究的复杂领域时，我们面临诸多挑战，例如如何在大脑活动背景下实现精确的信号分辨率，以及如何确保CMOS微电极区域的生物相容性。这些障碍在利用多模态记录准确捕捉和解读丰富的神经相互作用方面至关重要。本研究针对神经科学领域的一个关键空白，即目前缺乏一种能够以高空间和时间分辨率记录并分析大尺度神经元集群动态的综合方法。这一空白限制了我们对复杂脑网络及其在健康与疾病状态下功能的理解。本方案可实现对海马体、嗅球以及人源诱导多能干细胞分化神经元的多模态、无标记、高分辨率记录，为多种实验提供了一种灵活的工具。这一独特方法有助于深入理解神经元动态，弥合不同脑区与模型系统之间的研究鸿沟，显著推动我们对神经功能及其相关疾病的认识。本实验室未来的研究将深入探索从基因到神经网络层面的神经计算与动态过程，旨在通过先进的生物电子学与神经技术，连接健康与疾病状态下的分子特征与功能表型。我们将聚焦于神经可塑性、嗅觉编码、人工智能开发以及用于新型治疗手段和脑机接口的记忆增强策略。首先，建立脑片恢复与维持的工作区域。准备脑片制备的工作空间，并设置振动切片机。接下来，设置脑组织提取与制备的工作区域。然后将取出的小鼠脑组织转移至脑制备工作区中装有预冷的含碳酰气切割液的90毫米塑料培养皿中。将脑组织定向，以便在琼脂糖模具中定位。将超级胶水涂抹在琼脂糖模具的吻端。用刮铲将脑组织背侧朝下放入模具中，以进行水平切片。切取海马和嗅球组织。使用玻璃巴斯德吸管，在每轮操作后收集切片。将切片置于充满人工脑脊液的恢复室中，在32摄氏度水浴中孵育45分钟，随后在室温下放置1小时。开始时，取HD-MEA芯片。用经96%乙醇润湿的组织擦拭芯片上的玻璃环。将每个装置放入生物安全柜内的无菌培养皿中，并用70%乙醇填充MEA储液池。吸除乙醇后，用无菌过滤的双蒸水冲洗储液池三次。加入一毫升预处理培养基，过夜培养。第二天，从装置中移除预处理培养基。用一毫升聚-D-赖氨酸（PDLO）包被每个装置的活性区域。第二天，从装置中吸除PDLO。用双蒸水清洗装置三次，并在通风橱下使其干燥。用无菌、过滤的双蒸水填充一个35 mm × 10 mm的培养皿，并将其放置在芯片旁边。使用预热的培养基，将细胞悬液移液至芯片活性区域的表面。将芯片置于37摄氏度、含5%二氧化碳的环境中孵育。45分钟后，轻轻向HD-MEA储液池中加入2毫升室温预热的培养基。将芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。首先，将所有必要工具放置于指定的工作区域。用PDLO包被HD-MEA芯片，以增强组织芯片的耦合。将芯片放置在采集记录平台上。向芯片的储液槽中加入人工脑脊液，并将锚定装置放入芯片储液游戏副本以进行平衡。从恢复室中取出准备好的小鼠脑片，转移至直径90毫米的培养皿中，并持续通入碳合气。分离海马或嗅球后，用玻璃移液管将脑片转移至HD-MEA储液池中。使用细刷轻轻将脑片在MEA的活性区域上对齐。吸除芯片孔中的所有溶液。用镊子将锚轻轻放置在切片上方。轻轻向芯片储液池中加入溶液后，启动灌流系统。接着，启动 BrainWave 软件。选择文件并点击“新建记录会话”。将记录参数设置为记录频率1赫兹，采样频率每电极14千赫兹。按下“记录”以开始在预设实验条件下进行数据采集。最后，在完成最后一次记录后，对急性脑片进行明场成像。然后将脑片移回恢复室。使用刷子清除芯片上附着的任何有机物质，并继续进行下一个脑片的实验。首先，取含有iPSCs的HD-MEA芯片。在通风橱内，参照HD-MEA环的位置，小心地放置基于PDM的盖帽。然后将HD-MEA芯片置于采集平台上。启动 BrainWave 软件，选择文件，然后单击新建记录会话。将记录参数设置为记录频率 50 赫兹，采样频率每电极 18 千赫兹。根据实验计划中指定的每一天，记录 iPSC 网络的自发放电活动或药物诱导反应。在实验过程中，将高密度微电极阵列（HD-MEAs）置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。首先，记录离体小鼠脑急性切片以及体外培养的人诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元网络的时空神经元活动。在BrainWave软件中打开已记录的原始数据文件，选择“分析”（Analysis），然后点击局部场电位检测（LFP Detection）或动作电位检测（Spike Detection）。对于海马体和嗅球环路记录，将立体显微镜结构光图像导入检测事件文件的高级工作区选项进行整合。构建结构层以研究大尺度的海马皮层环路。使用自定义编写的Python脚本读取BXR文件。从iPSC神经网络记录中提取脉冲序列，并从海马和嗅球脑片电路记录中提取局部场电位事件序列。将包含时空信息的事件序列数据保存为NPY文件格式。利用BRW文件中的时间序列数据，计算64×64电极阵列中每对活跃电极之间的互协方差。将每个连接矩阵转换为动态图文件。对于网络连接图，应用地理布局以实现空间映射，并对节点度范围和边权重设置参数约束，以便进行比较。分配节点颜色、边粗细和节点度大小，以增强可视化效果。平均大尺度局部场电位（LFP）或脉冲放电模式的拓扑空间图被叠加在相应显微镜拍摄的光学图像上。光栅图显示了在特定时间频段内同步检测到的LFP或脉冲事件。来自高密度微电极阵列（HD-MEA）记录电极的代表性事件轨迹显示了海马体、皮层和嗅球环路中记录到的多种振荡频率，以及人诱导多能干细胞（iPSC）神经网络中的多单元脉冲簇状放电活动。海马体、皮层和嗅球环路连接组图谱揭示了代表不同层次的多个节点，其中节点大小表示连接强度的程度，颜色表示所属层次。在人类诱导多能干细胞（iPSC）神经网络中，通过时空滤波器和潜伏期阈值进一步优化了连接识别，节点颜色表示输入为兴奋性或抑制性。

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Research

科研

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神经科学

CMOS集成高密度微电极阵列上多模态大规模神经元集成动力学的记录与分析

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

将介绍在麻醉大鼠中使用硅探针进行神经元活动的细胞外记录技术。该技术能够同时从超过100个神经元中获取多个脑区的信息，以单细胞分辨率提供关于多个局部神经回路中神经元集群动态的信息。...

使用硅探针在麻醉大鼠中记录大规模神经元集群活动

我们介绍了利用硅探针在活动中的啮齿类动物体内进行大规模多单细胞单位和局部场电位记录的方法。文中详细展示了驱动器的制作、探针与驱动器的连接以及探针植入过程，以便于轻松重复操作。...

通过可移动硅探针在行为啮齿类动物中进行大规模神经元记录

本文描述了用于从小鼠脑内进行在体电生理记录脑信号的微型驱动装置的设计与组装方法。通过将微电极束固定在坚固且可驱动的载体上，这些技术可实现长期且稳定的神经信号记录。该装置的轻量化设计使得动物在植入驱动装置后仍能不受限制地完成各种行为学任务。...

用于清醒行为小鼠慢性神经记录的微驱动阵列构建

本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。...

自由活动大鼠皮层局部场电位、心电图、肌电图与呼吸节律的同步记录

本方案旨在演示如何结合 体外...

将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

本方案描述了一种用于在小鼠（Mus musculus）和雪貂（Mustela putorius...

用于急性和慢性在体记录的碳纤维微电极阵列的构建与实施

我们介绍一种灵活的化学和多模式刺激方法，可同时对多条秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

该方案描述了在运动皮层（MC）进行细胞外记录的方法，以揭示自由活动的清醒小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFPs）和锋电位的数据分析方法，这对于评估与特定行为相关的神经网络活动具有重要意义。...

自由移动小鼠中的多通道胞外记录

本文概述了一种使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统（CMOS-HD-MEAs）的实验方案 记录类似癫痫发作的活动 离体...

使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统从急性脑片中获取高质量的类癫痫样活动

本文介绍了在大鼠和小鼠中进行高密度微电皮层记录（µEcoG）的两种方案，包括手术、植入和记录方法。µEcoG记录分别与大鼠听觉皮层的层状多通道电极记录或小鼠体感皮层的光遗传学神经活动操控相结合进行。...

通过整合层状多通道电极、光遗传学与微阵列皮层电图在啮齿类动物中进行皮层处理的多尺度研究

探索高密度CMOS微电极阵列技术，用于记录和分析海马体、嗅球及人源iPSC神经元网络的大规模神经集群动力学。该方法实现高时空分辨率的多模态无标记记录，为神经环路功能与疾病机制研究提供先进工具。

在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

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