Name: 从冷冻保存的体外来源血细胞中进行核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: 了解从冷冻保存的人诱导多能干细胞来源血细胞中提取高质量细胞核的实验方案。该方法支持单核测序分析，有助于推进干细胞生物学和基因组学研究，为细胞治疗开发提供重要技术基础。

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作者感谢 Jason Hatakeyama（10x Genomics）和 Diana Slater（费城儿童医院应用基因组学中心）提供的指导与建议。本研究由美国国立卫生研究院（HL156052，资助对象：CST）提供资助。

1. 细胞的冷冻保存
<ol>
	<li>冷冻 &#62;1 × 106 每毫升含分离的iPSC来源细胞，加入1 mL 90% FBS和10% DMSO。将冻存管置于-80°C冷冻容器中，以降低冷冻速度，优化活细胞回收率（材料表）。预计会有显著的细胞损失，损失程度可能因培养条件和细胞类型而异。</li>
	<li>在24小时内从-80°C转移至液氮中保存。</li>
</ol>
2. 细胞解冻
<ol>
	<li>从液氮储存中取出冻存管，在37 °C水浴中解冻2分钟。当仍可见少量冰晶时，立即从水浴中取出。</li>
	<li>将细胞从冻存管转移至一个空的15 mL离心管中，边轻轻混匀边缓慢加入10 mL预热的培养基（RPMI 1640 + 10% FBS）。在25 °C下以400 × g 离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用1 mL添加了2% FBS和1 mM CaCl2 的DPBS（材料表）重悬细胞。使用1000 µL移液器轻轻吹打混匀3次。转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底试管中。</li>
</ol>
3. 去除死细胞
<ol>
	<li>向1 mL细胞悬液中加入50 µL死细胞去除试剂（材料表）。向细胞混合物中加入50 µL生物素选择试剂。室温孵育3分钟。这些步骤可使细胞悬液中的Annexin V+死细胞被生物素标记。</li>
	<li>剧烈涡旋振荡30秒，使专用于去除被生物素标记的非目标细胞类型的葡聚糖磁珠（材料表）充分悬浮。向细胞悬液中加入100 µL葡聚糖磁珠，使用1000 µL移液器轻轻吹打2次混匀（材料表）。</li>
	<li>向细胞悬液中加入1.3 mL含2% FBS和1 mM CaCl2的DPBS，使用1000 µL移液器轻轻吹打2次混匀。将离心管放入磁力架（材料表）中，室温孵育3分钟。</li>
	<li>将磁力架和离心管倒置，将富集后的活细胞悬液倒入一个新的15 mL锥形管中。在4°C下以400 × g离心3分钟。吸除大部分上清液，加入1 mL DPBS + 0.04% BSA重悬细胞。使用1000 µL移液器轻轻吹打3次混匀。</li>
</ol>
4. 细胞核的分离
<ol>
	<li>将活细胞悬液在 4 °C 条件下以 460 × g 离心 5 分钟，然后吸除上清液，确保不扰动细胞沉淀。</li>
	<li>加入 100 µL 冰上预冷的新鲜配制的 0.5× 裂解缓冲液（表 1），用 100 µL 微量移液器轻柔吹打 10 次混匀。冰上孵育 3 分钟。</li>
	<li>向离心管中加入 500 µL 预冷的洗涤缓冲液（表 2），不进行混匀。在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
5. 细胞核的洗涤与评估
<ol>
	<li>吸去上清液，加入 500 µL 冰冷的洗涤缓冲液，溶解残留的完整沉淀，不要混匀。在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟。去除所有上清液，避免扰动细胞核沉淀。</li>
	<li>用 120 µL 冰冷的稀释细胞核缓冲液（表 3）重悬沉淀。使用 40 µm 细胞筛（材料表）过滤细胞悬液。</li>
	<li>用 0.4% 台盼蓝染色，并在 10 倍显微镜下目视评估分离细胞核的质量（材料表）。</li>
</ol>
6. 分离细胞核的处理
<ol>
	<li>将细胞核置于冰上保存。请立即进行后续处理，因为随着时间推移可能发生细胞核聚集，从而需要额外的过滤步骤。</li>
</ol>

High-Quality Nuclei from iPSC-Derived Hematopoietic Cells for Multiomics Studies

<ol><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>An, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pluripotent+stem+cells+to+generate+diagnostic+tools+for+transfusion+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.</a> Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).</li>
<li>Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+%26%2334%3BOff-the-Shelf%26%2334%3B+Natural+Killer+Cells+from+Peripheral+Blood+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of &#34;Off-the-Shelf&#34; Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).</li>
<li>Pavani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primitive+and+definitive+erythropoiesis+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells.</a> Blood Adv. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+epigenomic+and+transcriptomic+analysis+reveals+the+requirement+of+JUNB+for+hematopoietic+fate+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction.</a> Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).</li>
<li>Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+bioinformatics+analysis+of+data+from+bulk+and+single-cell+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments.</a> Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+med%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).</li>
<li>Del-Aguila, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nuclei+RNA+sequencing+study+of+Mendelian+and+sporadic+AD+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain.</a> Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS one. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Maciejowski, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+rupture+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane rupture and its consequences.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+single+cell+ATAC-seq+data+with+SnapATAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC.</a> Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).</li>
<li>Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technological+landscape+and+applications+of+single-cell+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The technological landscape and applications of single-cell multi-omics.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

方案中的关键步骤 
分离高质量的细胞核对于当前基于单细胞核的下一代测序技术的成功实施至关重要，而这些技术正在迅速发展。鉴于对这些方法感兴趣的实验室目前仍面临诸多障碍，特别是针对冷冻保存样本的情况，我们的目标是开发一种专门适用于先前冷冻细胞的细胞核分离技术。对于临床样本以及稀有的诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞群体，从冷冻保存的样本中分离细胞核通常是必要的。
针对特定的细胞群体，优化裂解缓冲液的稀释比例、裂解时间以及过滤次数至关重要。我们观察到某些特别敏感的细胞类型，例如冻存的人诱导多能干细胞来源的造血祖细胞，在使用1倍浓度裂解缓冲液的情况下，不到一分钟即可能发生过度裂解。这种过度裂解不仅仅是一种技术或操作上的失误，反而可能提示黏附性核物质的泄漏。对于具有强健细胞骨架结构和易于形成牢固细胞间黏附的贴壁基质细胞和内皮细胞，需要进行两次过滤才能有效去除聚集的细胞核。核物质的聚集体可能堵塞微流控通道，对实验的完整性构成实际风险，甚至可能导致无法获得任何数据结果。
我们还发现，加入死细胞去除步骤&#160;显著增加&#160;在限制结块和碎片的同时，完整细胞核的回收。有必要处理含有 &#62;实验开始时，基于台盼蓝染色结果，细胞存活率为70%。将所有缓冲液置于冰上也有助于维持细胞活性。
该技术的局限性 
所述方法旨在优化从培养的诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞类型中回收细胞核4。类似的故障排除步骤可能不仅适用于iPSC诱导的细胞，还可扩展至其他冷冻保存的细胞类型，但在未进行测试的情况下，难以预测不同样本或细胞类型的具体需求。无论样本或细胞类型如何，实验成功与以下因素直接相关：获得残留活细胞少于&#60;5%的细胞核制备物，尽量减少聚集，并减少过度裂解的细胞核。



相较于现有方法的意义 
具有翻译相关性的iPSC诱导分化系统可产生多种细胞类型和前体细胞。本方案重点&#160;在iPSC来源的贴壁型基质/内皮细胞和非贴壁型造血祖细胞这两类具有不同方法学优化需求的代表性细胞类型中，我们展示了细胞核分离的优化策略。我们预期本方案可经调整后应用于其他iPSC来源的细胞类型，以探究关键的发育阶段。需注意的是，根据蛋白质含量、膜结构及细胞刚性等特性，需对分离方法进行精细调整。然而，本文所述方法可能适用于多种冷冻保存的细胞类型，实现高质量细胞核的回收。

造血作用是一个相对研究较为清楚的发育系统，但目前仍无法完全重现血细胞的形成过程 体外 对相关因素的理解尚不完整。基于诱导多能干细胞（iPSC）的造血模型有助于阐明关键的发育因子及相关生物学机制。iPSC 系统还为研究血液疾病提供了优良的模型，且已利用 iPSC 衍生的血细胞开发出具有转化医学和治疗应用价值的试剂1,2,3,4单细胞研究已被广泛用于探究基于iPSC的发育生物学，包括造血过程中产生的细胞类型5与无法推断细胞亚群之间关系的批量RNA测序相比6单细胞多组学技术能够评估细胞异质性，并有助于细胞发育的鉴定与表征6,7.
iPSCs 形成造血细胞需要依次经过原始条纹、中胚层和内皮细胞阶段，最终生成生血性内皮细胞。生血性内皮细胞是造血干细胞和祖细胞的直接前体。8这些细胞类型具有显著不同的形态学和细胞特性。目前对表观遗传景观及发育动态的理解仍然有限 体外衍生的造血细胞模型，尽管这对于充分释放iPSC系统的治疗潜力至关重要。在许多情况下，只有单细胞分析方法能够识别出异质性细胞群体中的细胞亚群、转录活性、染色质景观以及调控发育的调控机制。
单细胞RNA测序（scRNAseq）和单细胞核RNA测序（snRNAseq）两种方法均可在单个细胞水平上揭示转录组信息9。决定数据有效性和可靠性的主要因素是对样本质量的严格要求。这些要求包括精确的细胞/细胞核密度、最佳的存活率以及尽可能少的细胞聚团。单细胞核的制备在技术上具有挑战性，而使用先前冷冻保存的细胞可能带来额外的困难。
我们注意到标准单细胞RNA测序（scRNAseq）方法存在四个重要的潜在局限性。首先，制备细胞悬液的标准方案通常参考的是新鲜细胞或组织的制备方法，而非冻存后复苏的样本10，这可能限制了潜在宝贵资源的利用价值。其次，不同类型细胞的解离效率存在差异。例如，许多免疫细胞类型较易实现解离；相比之下，基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞通常嵌于细胞外基质和基底膜中，具有独特的细胞特性，可能增加细胞核分离的难度11,12。这些特性可能需要采用较为剧烈的解离方案，从而可能损害更为脆弱的细胞群体的结构完整性。第三，某些细胞（如巨核细胞）直径可超过100 µm，对现有的多种商业化单细胞平台构成挑战13。此外，在细胞分离的初始步骤中，若操作不当，可能在酶解和机械解离过程中造成细胞损伤和应激反应，进而影响基因表达谱11,14。
由于这些及其他原因，单核方法可能是单细胞方法的一种更优替代方案15。鉴于细胞核膜相比细胞膜具有更高的稳定性，即使在组织冷冻保存后，核膜仍可能保持完整16。这有助于细胞核的提取，并可扩大适用于下一代测序技术的样本类型范围。其次，细胞核对机械扰动具有更强的耐受性，在解离过程中转录变化较少14，因此可提供更高的RNA稳定性以及更可重复的转录谱。单核方法的第三个显著优势是不受细胞大小限制，适用于 cardiomyocytes 或 megakaryocytes 等较大细胞12。第四，细胞核是多组学分析的合适底物，通过对基因表达、开放染色质区域及其他参数的整合分析，可获得更深入的信息17，从而更全面地理解细胞异质性、发育过程及功能状态18。
通过分析iPSCs在造血发育过程中的特征，多组学方法有助于定义正常或病理疾病模型中的发育过程。将iPSC来源的细胞与原代细胞或组织进行比较，也可评估iPSC模型的保真度 体内 生物学，促进iPSC模型的优化以及驱动血液形成的新型细胞群和因子的发现。
尽管许多研究团队已成功完成细胞核分离及后续的高通量测序分析，但对于希望开展基于单细胞核分析的研究实验室而言，获得高质量细胞核仍是技术瓶颈。本文详细描述了一种从先前冷冻保存的诱导多能干细胞（iPSC）来源细胞中分离高质量细胞核的实验方案。我们重点针对贴壁的基质/内皮细胞以及非贴壁的造血祖细胞进行优化，因为这两类细胞在结构和内容物上差异显著，需要进行针对性的调整和问题排查，以提高适用于高通量测序或其他实验的高质量细胞核的回收率。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜溶液（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>673439</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>康宁</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GeminiBio</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1X）</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>诱导性多能干细胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本研究中使用的诱导多能干细胞（iPSCs）通过费城儿童医院人类多能干细胞核心设施获得</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞染色试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>康宁</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;死细胞去除试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 死细胞去除（Annexin V）试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>17899</td><td>该试剂盒用于去除经生物素标记的非目标细胞类型。试剂盒包含死细胞去除（Annexin V）混合液、生物素筛选混合液以及葡聚糖磁珠。该试剂盒利用Annexin V靶向结合凋亡细胞质膜外小叶上的磷脂酰丝氨酸。非目标细胞通过Annexin V、生物素化抗体及磁性颗粒进行标记，并使用EasySep磁铁在无柱条件下实现分离。目标细胞可直接倾入新离心管中收集。

关键词：试剂盒，生物素，细胞去除，死细胞清除，Annexin V，磷脂酰丝氨酸，凋亡细胞，生物素化抗体，磁珠分离，EasySep磁铁，非目标细胞，目标细胞</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;微量移液器</td><td>Wards Science</td><td>470231606</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;微量移液器</td><td>Wards Science</td><td>470231598</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;l 加长型通用吸头</td><td>Oxford Lab Products</td><td>OAR-1000XL-SLF</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;微量移液器</td><td>Wards Science</td><td>470231602</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 冻存管</td><td>康宁</td><td>431386</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;微量移液器</td><td>Wards Science</td><td>470231608</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;微量移液器</td><td>Wards Science</td><td>470231600</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Corning DeckWork 0.1-10 &amp;micro;移液器吸头架</td><td>康宁</td><td>4143</td><td></td></tr><tr><td>Corning DeckWork 1-200 &amp;micro;移液器吸头架</td><td>康宁</td><td>4144</td><td></td></tr><tr><td>计数室</td><td>CytoSMART</td><td>699910591</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 细胞筛，40 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Bel-Art</td><td>H136800040</td><td></td></tr><tr><td>磁铁</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>NALGENE 冻存管 1&amp;deg;C 冻存容器</td><td>Nalgene</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞核分离试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>细胞核分离试剂包括裂解缓冲液，&amp;nbsp; 洗涤缓冲液、稀释核缓冲液和裂解稀释缓冲液。这些缓冲液的组成见表1、表2和表3。我们的细胞核分离方法相较于标准试剂盒方案有所改进（例如，10x Genomics Chromium Next GEM 单细胞多组学ATAC + 基因表达用户指南 [CG000338]）。本方案可与多种商业试剂盒联合使用，包括Chromium Next GEM 单细胞多组学ATAC + 基因表达试剂套装，16次反应（PN-1000283）。</td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>STEMCELL</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇溶液（DTT）</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>Bel-Art</td><td>H136800040</td><td></td></tr><tr><td>MACS 牛血清白蛋白（BSA）储备液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td></td></tr><tr><td>1 M 氯化镁溶液</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代品</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>细胞核缓冲液（20X）</td><td>10X Genomics</td><td>2000153</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase抑制剂</td><td>Sigma</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>5 M 氯化钠溶液</td><td>Sigma</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐溶液，pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Trizma盐酸盐（Tris-HCl）（pH 7.4）</td><td>Sigma</td><td>T3252-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>CytoSMART</td><td>699910591</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>蔡司</td><td>Primostar 3</td><td></td></tr></tbody></table>

从冷冻保存的体外衍生血细胞中分离细胞核

Nuclear Isolation from Cryopreserved In Vitro Derived Blood Cells

基于诱导性多能干细胞（iPSC）的模型是研究血液发育的优良平台，且iPSC衍生的血细胞在临床检测试剂和可输注细胞治疗产品方面具有转化应用价值。多组学分析技术的发展与拓展，包括但不限于单细胞核RNA测序（snRNAseq）和转座酶可及染色质测序（snATACseq），有望彻底改变我们对细胞发育过程的理解。这涵盖了发育生物学领域的研究应用 体外 造血模型。然而，从培养细胞或原代细胞中分离完整细胞核在技术上具有挑战性。不同细胞类型通常需要根据细胞的刚性和内容物特性定制相应的细胞核制备方法。这些技术难题可能限制数据质量，并阻碍有意开展多组学研究的研究人员。由于细胞采集和/或处理的限制，样本通常需要冷冻保存，而冻存样本在完整细胞核分离过程中可能带来额外的技术挑战。本文中，我们提供了一种详细的方法，用于从不同分化阶段的iPSC来源细胞中分离高质量细胞核 体外 造血发育在单核多组学工作流程中的应用。本方法开发的重点是分离由iPSC衍生的贴壁基质/内皮细胞以及非贴壁造血祖细胞的细胞核，因为这些细胞在结构和细胞特性方面代表了截然不同的细胞类型。所描述的故障排除步骤可有效减少细胞核聚集和碎片，从而获得足够数量和质量的细胞核用于后续分析。类似方法可经调整后用于从其他冷冻保存的细胞类型中分离细胞核。

我们采用上述方案从冻存的iPSC来源的贴壁基质/内皮细胞以及非贴壁（悬浮）造血祖细胞中提取细胞核。细胞核分离步骤的详细示意图见图1。
为了进行形态学检查，分离的细胞核用台盼蓝染色，并在显微镜下观察。在处理前必须立即进行细胞核形态学检查，因为碎片或成团的细胞核可能导致精密微流控仪器发生堵塞，从而降低数据质量或无法获得有效数据。图2A-B显示了使用常规试剂盒方案制备的样本中分离出的细胞核，显微镜检查发现存在碎片以及每个视野中至少有一个细胞核聚集体。由于质量较差，这些样本被弃用。
高质量的细胞核呈圆形且完整，几乎无团块或无团块，例如我们在方法优化后观察到的结果（图 2C-D）。在这些样本中，我们未观察到任何聚集体或成团现象。这些细胞核在质量和数量上均足以支持后续的处理与分析。类似的故障排查和方案优化方法可能适用于其他冷冻保存的细胞类型。
<img alt="细胞分离实验示意图；用于活细胞分离的离心和缓冲液步骤" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66490/66490fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：示意图展示从冻存细胞中提取细胞核的过程. 冷冻保存细胞中细胞核分离步骤的可视化示意图 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66490/66490fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同阶段细胞增殖的显微镜图像；带网格线，比例尺为 100 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66490/66490fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：从冻存的人iPSC来源细胞中分离的细胞核。 从贴壁的基质/内皮细胞中分离的细胞核经台盼蓝染色后显示出大量碎片（A）小颗粒和（B）细胞核聚集体（大颗粒），这些杂质阻碍了后续分析。在实施本文所述的技术改进后，成功从（C）冻存的人iPSC来源造血祖细胞或（D）基质/内皮细胞群体中获得了高质量的细胞核，且数量足以支持后续分析。作为参考，这些非贴壁的造血祖细胞采集于造血分化第9+8天，而贴壁的基质/内皮细胞采集于第9+7天，具体方法见文献4。请注意，不同细胞类型的细胞核形态可能存在差异。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66490/66490fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液配制</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5X 裂解缓冲液</td>
			<td>储存液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X 裂解缓冲液</td>
			<td>1X</td>
			<td>0.5X</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解稀释缓冲液</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解缓冲液</td>
			<td>储存液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.67 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>1 U/µL</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7.4)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解稀释缓冲液</td>
			<td>储存液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.72 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>1 U/µL</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7.4)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：0.5x 裂解缓冲液的配制。 该溶液用于第4.2步的细胞核分离操作。通过混合裂解缓冲液与裂解稀释缓冲液来配制0.5x裂解缓冲液。每次实验前必须立即新鲜配制，并置于冰上保存。请注意，针对某些细胞类型的问题排查可能需要使用1x、0.5x或更低浓度的裂解缓冲液，以促进完整细胞核的分离。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">缓冲液配制</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤缓冲液</td>
			<td>储存液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>4 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>12 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase抑制剂</td>
			<td>40 U/µl</td>
			<td>1 U/µl</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH7.4)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>40 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>40 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：洗涤缓冲液的配制。该溶液用于细胞核分离过程中。每次实验前应新鲜配制，并置于冰上保存。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液配制</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释核缓冲液</td>
			<td>储存液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>924 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核缓冲液</td>
			<td>20X</td>
			<td>1X</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>1 U/µL</td>
			<td>25 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：稀释细胞核缓冲液的配制。该溶液用于步骤5.2，每次实验前应新鲜配制，并置于冰上保存。

我们描述了一种从冻存的诱导多能干细胞来源的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单细胞核下一代测序分析。获得高质量且完整的细胞核对于多组学实验至关重要，但对部分实验室而言，这可能构成进入该领域的技术障碍。

基于诱导性多能干细胞（iPSC）的模型是研究血液发育的优良平台，且由iPSC衍生的血细胞具有转化……

我的实验室研究影响血细胞形成的基因和机制。我们利用人诱导性多能干细胞生成血细胞，并希望提高这一过程的效率，以支持针对特定患者的临床规模细胞治疗产品的生产。我们采用单细胞基因组学技术，识别基因表达及其他有助于血细胞形成的因素中的模式。体外血液细胞生产面临的一个主要挑战是成本高昂且效率低下。我们正在采用遗传学方法来解决这一问题。我们希望利用人类遗传学和体内造血过程中的线索，指导对体外系统进行优化改进。我们正致力于利用功能基因组学和单细胞核分析技术，推动在体外鉴定驱动正确类型血细胞形成的基因及信号网络领域的研究进展。构建高质量的多组学数据集，帮助我们发现了驱动血细胞体外分化的转录因子、能量代谢机制以及调控机制。我们正在利用这些数据来解析人类遗传数据，例如 GUS 位点，以及其他此前尚未发现的驱动分化的关键因素。我们非常期待基于高质量细胞核分离所获得的多模态数据集的深入见解开展后续研究。我们计划将未来的研究重点放在能够在体外以临床规模生成血细胞类型的基因和发育机制上。首先，从液氮中取出装有细胞的冻存管，在37摄氏度水浴中解冻两分钟。将冻存细胞转移至15毫升离心管后，缓慢加入10毫升预热的培养基，离心该离心管。弃去上清液，用含有FBS和氯化钙的1毫升补充型DPBS重悬细胞。接下来，取1毫升细胞悬液与50微升死细胞去除试剂混合物和50微升生物素筛选试剂混合物加入5毫升聚苯乙烯圆底管中，混匀后孵育。涡旋后，向细胞悬液中加入100微升葡聚糖珠，用移液器轻轻吹打混匀两次。然后向混合物中加入1.3毫升添加了补充物的DPBS，室温下置于磁力架上孵育3分钟。将磁力架和离心管倒置，将活细胞悬液倒入一个新的15毫升锥形管中。在离心机中离心沉淀细胞。除去大部分上清液后，将细胞重悬于1毫升含0.04%牛血清白蛋白的DPBS中。首先，取富集的活体iPSC来源细胞悬液置于锥形管中，在4摄氏度下以460 ×g离心5分钟。弃去上清液后，加入100微升新配制的0.5倍冷裂解缓冲液。使用P100移液器上下吹打10次以混匀细胞，将离心管置于冰上孵育3分钟。接着，向裂解液中加入500微升预冷的洗涤缓冲液。离心试管，弃去上清液。重复洗涤后，将沉淀重悬于120 µL预冷的稀释细胞核缓冲液中。使用40 µm细胞筛过滤细胞悬液，并向滤液中加入0.4%台盼蓝。最后，在显微镜下评估分离得到的细胞核的质量。利用该技术，已从冻存的人诱导多能干细胞来源的造血祖细胞中成功分离出高质量的细胞核。

nuclear-isolation-from-cryopreserved-in-vitro-derived-blood-cells

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从冷冻保存的体外来源血细胞中进行核分离

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

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我们概述了一种用于处理全血以获取多种组分以供进一步分析的方法。我们优化了一个简化的操作流程，可在非临床环境下快速、高通量地同时处理多个全血样本。...

基于社区环境采集样本的全血成分快速分离与提取

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

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