Name: 一种成年斑马鱼腹腔注射技术，可最大限度地减少身体损伤和相关死亡率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 2 min 32 s
Description: 学习一种新型成年斑马鱼腹腔注射技术，通过调整进针位置和角度，有效减少身体损伤和死亡率，便于研究人员快速建立蒽环类药物心脏毒性模型。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：HL107304 和 HL081753）以及梅奥基金会&#160;（生物医学发现中心和心血管研究中心）资助，资助对象为 X.X。J.L. 受中南大学中央高校基本科研业务费资助，项目编号：56021702。特别感谢 Beninio Gore 和 Quentin Stevens 对斑马鱼实验设施的管理。

所有操作程序均经梅奥诊所机构动物护理与使用委员会批准，遵循《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，2011年）中规定标准。本研究中使用的所有斑马鱼均属于野生印度卡型（Wild Indian Karyotype, WIK）品系。实验所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 阿霉素储备液的配制与保存
<ol>
	<li>从商业来源获取多柔比星（doxorubicin）储备液。 
	注意：多柔比星对光敏感，因此应以粉末形式获取，并储存于不透光容器中以避免光照。多柔比星粉末的全部配制操作均应在化学通风橱内进行。</li>
	<li>将多柔比星粉末完全溶解于蒸馏水中，配制成终浓度为 5 mg/mL 的储备溶液。</li>
	<li>将储备液分装至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>用铝箔包裹离心管，以避免光照。</li>
	<li>分装后的多柔比星溶液可于 4 °C 短期保存（&lt;1 个月），或于 -20 °C 长期保存10。</li>
</ol>
2. 根据体重对鱼类进行分组
<ol>
	<li>将体重（BW）差异小于10%的鱼类分组，用于后续注射。 
	注意：为减少此阶段的工作量，将体重变异小于10%的鱼类归为同一规格。</li>
	<li>在注射前使鱼类禁食24小时。</li>
	<li>使用含有0.16 mg/mL 三卡因的胚胎水对鱼类进行麻醉，持续1分钟。</li>
	<li>将鱼类从含三卡因的水中取出，并用干净的滤纸轻拭鱼体两侧，去除多余水分。</li>
	<li>测量并记录每条鱼的体重（BW），然后立即将其放回装有新鲜系统水的恢复缸中。 
	注意：多西环素（Dox）注射在鱼类达到3个月龄后进行。本研究中研究人员使用了3至10月龄的鱼类。成熟WIK品系斑马鱼的体重（BW）范围可能为0.2 g至0.5 g。若麻醉时间超过5分钟，再进行多西环素注射，会导致鱼类死亡率显著升高。</li>
</ol>
3. 注射用针头及注射台的准备
<ol>
	<li>根据斑马鱼的平均体重，确定每条鱼所需注射的多柔比星（Dox）储备液（例如，5 mg/mL）体积，以达到目标剂量 20 µg/g。</li>
	<li>使用以下公式计算注射体积： 
	<img alt="注射体积计算公式：鱼类给药计算方程；生物学实验示意图。" src="/files/ftp_upload/66500/66500eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>加入 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）稀释第 1 步中计算出的多柔比星溶液，使总体积达到 5 µL。 
	注意：根据每组鱼的体重制备批量溶液，并在每组中额外增加 3 条鱼，以确保实验过程中注射溶液不会短缺。</li>
	<li>轻轻敲击离心管，然后在室温下以最高速度短暂离心 10 秒，使溶液沉降至管底。</li>
	<li>将配制好的溶液置于冰上，并避免光照。</li>
	<li>在体视显微镜下放置一个洁净的 100 mm 培养皿，培养皿下方垫一块带有 4 cm 长凹槽的海绵，然后调节焦距。 
	注意：海绵中的凹槽可通过弹性回缩为斑马鱼提供支撑，固定鱼体位置。该海绵可重复使用。</li>
	<li>为 10 µL 微量注射器装配一根 34 G 斜面针头。</li>
	<li>用 1× HBSS 缓冲液冲洗针头，以排除任何气泡并清除注射器中可能存在的堵塞物。</li>
	<li>量取第 4 步中配制好的溶液 5 µL，用于注射。</li>
</ol>
4. 腹腔注射 Dox 操作步骤
<ol>
	<li>将成年鱼置于含有 0.16 mg/mL 三卡因的水中 1 分钟，以诱导其进入无意识状态。</li>
	<li>将鱼腹面朝上放置于嵌入式海绵的凹槽中（图 1A）。</li>
	<li>以接近 0° 的角度插入针头，从胸鳍中点开始，向心腔后侧推进（图 1B）。 
	注意：操作过程中避免接触心脏。</li>
	<li>将针头朝尾部方向推进，并进入银膜下方。 
	注意：针头应紧贴银膜，注意避免刮伤或刺穿。</li>
	<li>在整个操作过程中，持续观察针尖在腹腔内的位置（图 1C）。 
	注意：避免损伤肝脏、肠道、 swim bladder（ swim bladder 为原文术语，保留）及其他器官。确保针头到达肠道末端，靠近泄殖腔孔。</li>
	<li>缓慢且均匀地注入 5 µL Dox 溶液，然后沿原路径缓慢撤出针头，以防止泄漏（图 1D）。</li>
	<li>通过观察 Dox 溶液的红色染色现象，监测腹腔内是否存在 Dox（图 1E）。</li>
	<li>迅速将注射后的鱼转移至装有新鲜系统水的清洁交配缸中，以帮助其恢复。 
	注意：每次注射之间，用 1x HBSS 缓冲液冲洗针头一次。</li>
</ol>
5. 注射后鱼类管理
<ol>
	<li>注射后将鱼放回循环系统中。</li>
	<li>注射后的鱼禁食额外24小时，以促进其恢复。</li>
	<li>在第一周内密切观察鱼的状态。一旦发现死亡个体，应立即移除，以避免感染其他鱼。 
	注意：注射后最初24小时内出现的鱼死亡，可能源于注射造成的物理损伤或麻醉时间过长。记录鱼的数量以绘制生存曲线。</li>
	<li>在注射后第56天对注射多西环素（Dox）的鱼进行超声心动图检查，以进行表型分析11。 
	注意：确保注射HBSS溶液的相应对照组在条件和操作上保持一致。</li>
</ol>

Optimized Intraperitoneal Injection for Compound Delivery in Adult Zebrafish

<ol><li>Tavares, B., Lopes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Zebrafish+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Portuguesa%22%5BJournal%5D)">The importance of Zebrafish in biomedical research.</a> Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).</li>
<li>Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+drug+administration+in+the+adult+zebrafish+using+oral+gavage+for+cancer+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies.</a> Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).</li>
<li>Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gelatin-based+diet+for+oral+dosing+juvenile+to+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Sci+Prof%22%5BJournal%5D)">A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio).</a> Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+delivered+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+through+THBS1-mediated+induction+of+IL-10-competent+regulatory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells.</a> Front Immunol. 13, 853894(2022).</li>
<li>De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+drug+delivery+systems+for+intraperitoneal+therapy+to+extend+the+residence+time+of+the+chemotherapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent.</a> The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).</li>
<li>Dakwar, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine-based+intraperitoneal+therapy+for+the+treatment+of+peritoneal+carcinomatosis-Mission+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible.</a> Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).</li>
<li>Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+route+of+drug+administration%3A+should+it+be+used+in+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Res%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies.</a> Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).</li>
<li>Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+model+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (136), e57567(2018).</li>
<li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).</li>
<li>Christidi, E., Brunham, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell+death+pathways+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).</li>
<li>Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+juvenile+doxorubicin-induced+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction.</a> Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).</li>
<li>Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+models+of+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+in+rats+and+mice.+A+modern+view+from+the+perspective+of+the+pathophysiologist+and+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician.</a> Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).</li>
<li>Chaoul, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+administration+techniques+in+zebrafish+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).</li>
<li>Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calycosin+attenuates+doxorubicin-induced+cardiotoxicity+via+autophagy+regulation+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models.</a> Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).</li>
</ol>

不同于现有的两种IP注射方法4,10，新的腹腔注射方法具有以下显著特征：首先，采用独特的进针角度（接近零度）；其次，针头刺入鱼体 通过 一个独特的位置，即鱼类腹面的天然孔洞，有助于注射；最后，针头的移动方向为从前向后。这些调整有效减少了器官损伤，原因是阿霉素（Dox）在穿刺过程中的泄漏量被降至最低。针头路径位于银膜下方，研究者可对此过程进行持续观察。因此，可有效避免针尖与内脏器官的直接接触。注射后，所有注入的阿霉素均保留在腹腔内，而唯一的出口（穿刺点）在鱼苏醒并开始向前游动时即可闭合。
与现有的两种腹腔注射方法4,10相比，新的腹腔注射方法始终能够显著减少机体损伤并提高存活率。这一优势进一步体现在可对同一条鱼进行多次注射，从而成功建立慢性斑马鱼弥散性血管内凝血（DIC）模型。尤为重要的是，与先前的两种腹腔注射方法4,10相比，该新方法易于掌握，即使是没有成年斑马鱼操作经验的研究人员也能迅速学会。至少4位不同的研究人员在首次或第二次尝试时，便成功获得了可靠的DIC模型。注射是否成功可在注射后第一周内轻松判断：&#62;80%，最好达到100%的鱼类在注射后应能存活。所有鱼类应存活至56天（dpi），此时大多数鱼类（&#62;80%）应无明显身体损伤。这是一个显著的改进，因为使用前两种腹腔注射方法建立可靠的DIC模型，研究人员通常需经过至少三轮练习（每轮至少10条鱼）才能掌握。这一学习过程可能耗时较长，因为每轮练习均需约两个月时间来评估注射是否成功。减少组织创伤不仅改善了鱼类的福利，也最大限度地减少了可能影响研究结果的混杂因素。
确保新方法成功的关键步骤之一是穿刺角度。如图2所示，当穿刺角度从0°变为45°时，观察到鱼类死亡显著增加，可能是由于针尖与内部器官接触的风险增加所致。
该方法的主要局限性在于无法用于向3个月以下的鱼类给药。由于幼鱼体型较小，在针头穿刺造成的物理损伤后无法存活。然而，当鱼类体重超过0.15 g时，该方法可用于成年鱼，包括年龄在3个月至4年之间的个体。
这种新方法将广泛应用于成年斑马鱼的药物递送，尤其是在处理潜在有毒化合物（如Dox15,16）时。对于非毒性化合物，这三种方法均应适用。

斑马鱼（Danio rerio）因其与人类具有高度的基因和器官同源性、体外&#160;受精、易于进行遗传操作以及在发育早期身体透明等特性，已成为研究人类疾病的实验模型并受到广泛关注，这些特点为多种成像应用提供了便利1。与将药物直接加入水中以处理斑马鱼胚胎和幼鱼的简便方法不同，对成年斑马鱼给药则是一项更为复杂且具有挑战性的任务2。
在成年鱼类中，化合物可通过被动给药技术（例如直接加入水中）或口服给药方法（如灌胃）进行递送2其他方法包括将化合物涂覆于鱼食表面，随后喂食鱼类3，以及在预定浓度下直接给予难溶于水的药物，包括眶后注射或腹腔注射4,5腹腔注射给药为首选方法 体内 因其独特的药代动力学优势而被用于疾病模型研究6该方法可在腹腔内维持高药物浓度和延长的半衰期，为药物递送提供了一条有效途径7,8该方法在研究环境中常被用于确保药物的最佳吸收与分布 9. 尽管基于注射的方法在单次递送中表现出高效性，但长期反复注射常导致机体损伤和慢性感染2.
目前，成年斑马鱼的腹腔注射有两种方法4,10。然而，这两种方法在递送阿霉素等有毒化合物时均存在局限性，可导致鱼体形态严重受损及鱼类死亡。这些副作用会显著增加数据分析的复杂性。尽管通过大量训练可能缓解上述问题10，但仍迫切需要一种能最大限度减少副作用的新型腹腔注射方法。
本研究旨在建立一种优化的腹腔注射方法，以高效地将阿霉素递送至成年斑马鱼体内，从而在尽量减少机体损伤及相关死亡率的前提下，可靠地构建阿霉素诱导的心肌病（DIC）模型。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;L NanoFil-注射器</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NANOFIL</td><td>注射工具</td></tr><tr><td>34 G 针头</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NI34BV-2</td><td>注射工具</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>fisher scientific/fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>放置海绵&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>注射多柔比星</td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td>构建扩张型心肌病模型的药物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超声心动图仪</td><td>VISUAL SONICS</td><td>Vevo 3100</td><td>测量心脏功能</td></tr><tr><td>泡沫海绵</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td>放置斑马鱼</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td>多柔比星的溶剂</td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>southernlabware</td><td>MyFuge/C1012</td><td>收集多柔比星溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>精密电子天平</td><td>Torbal</td><td>AD60</td><td>数字天平</td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Argent</td><td>MS-222</td><td>麻醉斑马鱼</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Eppendorf</td><td>1.5 mL</td><td>储存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>vevo LAB&amp;nbsp; 软件</td><td>FUJIFILM VISUAL SONICS&amp;nbsp;</td><td>5.6.0</td><td>心脏定量分析</td></tr></tbody></table>

一种可最大限度减少机体损伤及相关死亡率的成年斑马鱼腹腔注射技术

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

成年斑马鱼（Danio rerio）具有良好的遗传可操作性，现已被用作研究人类疾病（如心肌病）的重要脊椎动物模型。腹腔（IP）注射是一种重要的给药方法，可用于测试药物的治疗效果，或构建疾病模型，例如阿霉素诱导的心肌病（DIC）。目前，腹腔注射主要有两种方法。然而，这两种&#160;方法在处理阿霉素等毒性化合物时均存在局限性，常导致副作用，表现为鱼体形态严重受损及鱼类死亡。尽管通过大量研究人员的训练可在一定程度上克服这些缺点，但仍亟需一种副作用更小的新型腹腔注射方法。本文报道了一种独特的腹腔注射技术，能够安全处理毒性化合物，可稳定诱导心脏功能下降，同时不引起显著的鱼类死亡。该技术易于掌握，即使对成年斑马鱼操作经验较少的研究人员也能快速学会。

此前，已有两种腹腔内（IP）给药方法用于成年斑马鱼的阿霉素给药4,10。方法I即Kinkel等人所描述的经典腹腔注射法4，将针头以45°角插入腹鳍之间的中线位置，腹部朝上。方法II即Ma等人所述的替代性腹腔注射法10，将针头从鱼体背部一侧穿入（图2A(i,ii)）。相比之下，我们的方法III具有两项主要改进：第一，改变了注射部位，保持腹部朝上，针头从胸鳍中点朝向腹部方向刺入，穿刺位置由该区域的自然孔隙引导；第二，减小了针头的进针角度，应接近0°（图2A(iii)，图1）。
三种腹腔注射方法的比较 
为比较三种腹腔注射方法，本文展示了研究者 I 获得的数据，该研究者此前无斑马鱼操作经验。当采用方法 I 和方法 II 进行腹腔注射时，注射后最初两周内观察到显著的鱼类死亡率。在方法 I 中，注射后第三天即出现死亡，而在方法 II 中，死亡发生在注射后第二天。70% 的注射鱼表现出明显的身体损伤，尤其是注射部位周围，表现为注射后一至两个月内体形显著缩小和身体弯曲（图 2A (iv,v)）。推测死亡和观察到的损伤可能归因于阿霉素12的毒性，其可能在注射过程中从注射针头的开口端泄漏，沿注射路径损伤内部器官。在方法 I 中，注射针尖可能触及肠道（图 2A(i)），而在方法 II 中，可能触及鳔（图 2A(ii)）。推测通过使用方法 III 可避免针尖接触任何内部器官（图 2A(iii)）。事实上，观察到显著提高的存活率：注射后一个月时，80% 的鱼类存活（图 2B），相较于方法 I 和方法 II 的存活率（分别为 53.33% 和 33.33%）有显著改善。更重要的是，80% 的存活鱼表现出正常体形，与方法 I 和方法 II 所产生的个体形成鲜明对比（图 2A(vi)）。为验证 DIC 模型的成功建立，通过测量射血分数百分比（EF%）评估心脏功能。确实，在采用方法 III 的组别中，注射后 56 天观察到 EF% 显著降低（图 2C）。
不同研究人员对方法 III 的可重复性 
为证明方法 III 可被不同研究人员快速掌握，本研究招募了 3 名此前从未操作过斑马鱼的研究人员参与实验。在初次尝试方法 III 时，三名研究人员分别在注射后 56 天达到了 85.71%、95% 和 83.33% 的存活率，并显著降低了射血分数（图 3A、B）。值得注意的是，三名研究人员分别重复实验 3 次、3 次和 2 次，均持续获得成功结果。这些数据证实了方法 III 具有良好的可重复性，使无鱼类操作经验的研究人员也能可靠地构建 DIC 模型。
在最初尝试使用方法III的过程中，研究者II测试了该方法的一个变体：未采用常规步骤，而是 0°，一个 45° 进针穿过皮肤时采用的角度图2A(iii)，虚线箭头）。注射后仅有15%的鱼类存活了两个月图3A），80%存活的鱼表现出明显的身体损伤。数据表明，穿透角度是方法III成功的关键步骤。
方法III可建立慢性DIC模型 
据推测，若显著减少机体损伤，则可在同一条鱼体内进行多次腹腔注射，从而模拟小鼠中的慢性DIC模型13,14。因此，采用方法III在连续4周内进行了一系列注射，每周注射5 µg/g的Dox（图4A）。在本实验中，所有注射鱼均存活，其中80%未表现出任何机体损伤迹象。重要的是，在56 dpi时观察到射血分数显著降低，表明已在成年斑马鱼中成功建立了慢性DIC模型（图4B）。
<img alt="鱼类注射过程示意图；显示心脏腔内注射的角度和位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：新IP注射方法的针头插入位置与角度。（A）针头插入位置。鱼体倒置，腹侧朝上，头部朝右。胸鳍之间存在一个天然孔隙，便于穿刺皮肤。（B）针头插入角度。针头与鱼体表面接近零度角。（C）针头在皮下的行进路径。一旦进入腹腔，持续监测针尖位置。由于穿刺过程中皮肤发生形变，穿刺点外观与图1A所示有所不同。（D）释放Dox后的鱼。释放Dox后腹腔呈现红色。（E）IP注射后的鱼。拔出针头后无渗漏迹象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼注射方法比较；存活率曲线；效率图表；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：成年斑马鱼三种腹腔注射方法的比较。（A）三种腹腔注射方法的示意图。（i–iii）分别为经典腹腔注射法（方法 I）、替代腹腔注射法（方法 II）和新方法（方法 III）的示意图。箭头表示三种注射方法的穿刺位点及针头角度；虚线箭头表示不成功的针头穿刺角度。比例尺：5 mm。（iv–vi）DIC 模型中体型减小和身体弯曲的表型。图中显示的是感染后第 56 天（dpi）具有代表性的 DIC 斑马鱼。（B）三种腹腔注射方法间存活率曲线的比较。每周记录存活鱼的数量（实验起始总数 n = 15）。（C）多柔比星（Dox）应激后第 56 天斑马鱼心脏功能的评估。1x HBSS 对照组 n = 6 条鱼，每批注射 Dox 的实验组起始总数均为 n = 15 条鱼。数据以均值 ± 标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="不同实验条件下注射后EF%的生存分析图和柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：方法III可使斑马鱼DIC模型在3位不同研究人员操作下稳定建立。（A）三位不同研究人员使用方法III建立DIC斑马鱼模型后的生存曲线。三位研究人员均观察到较高的存活率。活鱼数量每周记录一次。当研究者II采用不成功的方法III（针头穿刺角度为45°，如图2A中虚线箭头所示）时，存活率较低。（B）三位不同研究人员使用方法III建立的DIC斑马鱼心脏功能评估。总体而言，研究者II在针头穿刺角度为45°时，共使用了3批（9、12、14）斑马鱼进行多西环素注射；在针头穿刺角度为0°时，n = 6的斑马鱼被用于1x HBSS组作为共用对照组。实验起始共使用n = 85条斑马鱼，分别由三位研究人员（II、III、IV）在8批注射中完成：RII（9、12、14）、RIII（8、6、6）和RIV（12、18）。数据以均值±标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多柔比星注射时间线及超声心动图结果；柱状图显示WT(HBSS)与Dox组EF%的差异" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：方法III可在成年斑马鱼中实现多次多柔比星注射，重现啮齿类动物中的慢性DIC模型。（A）多次注射模型示意图。每周注射一次5 µg/g多柔比星（5 µL），连续注射四周。（B）慢性DIC模型在注射后56天（56 dpi）表现出EF%降低。数据以均值±标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种成年斑马鱼新的腹腔（IP）注射方法。在处理多柔比星等有毒化合物时，该方法比此前报道的两种腹腔注射方法更有效。该技术设计为斑马鱼模型研究经验有限的研究人员也能轻松掌握。

成年斑马鱼（Danio rerio）具有易于进行遗传操作的特性，正被用作研究人类疾病（如……）的重要脊椎动物模型。

我们的目标是在成年斑马鱼中建立阿霉素诱导的心脏毒性模型，以便发现新的治疗基因和化合物。可靠的腹腔注射方法对于确保本项目的成功至关重要。此前已建立的腹腔注射方法包括经典技术和替代技术。传统的注射方法是从腹侧经腹鳍之间的中线穿透鱼体，而替代方法则是从背侧位于腹鳍与肛门鳍之间的位置进行穿透。由于阿霉素具有毒性，采用现有的这两种腹腔注射方法时，已观察到鱼类出现明显的身体损伤和较高的死亡率。研究人员需要经过 extensive 培训，才能稳定建立疾病模型。我们通过调整针头穿刺位置和穿刺角度，设计了一种新的腹腔注射方法。注射时通过位于胸鳍之间腹侧区域的天然孔洞进针，并采用独特的从前向后的穿刺方向。首先，将五毫克阿霉素粉末溶于一毫升蒸馏水中。将储备液分装至1.5毫升离心管中。接下来，将体重差异小于10%的鱼类分到同一组。用三卡因（tricaine）在胚胎水中麻醉鱼类后，将鱼从水中取出，用洁净的滤纸轻轻擦拭鱼体两侧，去除多余水分。接下来，将麻醉后的鱼置于嵌入式海绵的凹槽中，腹部朝上。用5微升阿霉素工作液填充一支10微升、配有34号针头的注射器。从胸鳍中点向心脏腔后侧，以接近0度的角度插入针头。将针头朝向尾部，刺入银色表皮下方。缓慢注入dock溶液，然后沿原路径撤出针头，以防止泄漏。dock溶液会使腹部呈现红色。

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一种成年斑马鱼腹腔注射技术，可最大限度地减少身体损伤和相关死亡率

本文展示了如何对成年斑马鱼进行眶后静脉窦注射。...

成年斑马鱼的眶后注射

我们演示了对成年斑马鱼进行腹腔注射的方法。我们使用由Micro4控制器和UltraMicroPump III驱动的10 μl...

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本视频介绍了将化合物注入成年斑马鱼背部肌肉的肌肉注射技术。...

肌肉注射（IM）：向成年斑马鱼背肌递送化合物

本视频介绍了一种腹腔注射技术，该方法用于将溶液注入成年斑马鱼的腹腔内。...

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本视频介绍了通过胸腔内注射将化合物递送至成年斑马鱼心脏的技术。...

胸腔注射：化合物递送至成年斑马鱼心脏

成年斑马鱼心脏研究的胸腔内注射

本文介绍了一种优化且高效的成年斑马鱼静脉注射细胞或药理学试剂的实验方案，可显著提高细胞植入效率，并增加受处理斑马鱼的存活率。...

优化的成年斑马鱼静脉注射方法

斑马鱼是研究脊椎动物心脏再生机制的一个重要模型。本文介绍一种利用低温损伤在成年斑马鱼中诱导心肌梗死的实验方案。该方法可导致心室壁约20%区域发生大规模细胞死亡，与哺乳动物心肌梗死中观察到的现象相似。...

利用低温损伤法在成年斑马鱼中诱导心肌梗死

介绍了一种利用斑马鱼原位肿瘤模型快速筛选黑色素瘤调控因子的方法。该方法利用miniCoopR载体，可在黑色素细胞中表达候选黑色素瘤基因。文中描述了获取无黑色素瘤生存曲线的方法、侵袭实验、鳞片黑色素细胞的抗体染色方案以及黑色素瘤移植实验。...

使用斑马鱼原位肿瘤模型筛选黑色素瘤修饰基因

在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。...

利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

学习一种新型成年斑马鱼腹腔注射技术，通过调整进针位置和角度，有效减少身体损伤和死亡率，便于研究人员快速建立蒽环类药物心脏毒性模型。

一种可最大限度减少机体损伤及相关死亡率的成年斑马鱼腹腔注射技术

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