Name: 在体外溶栓模型中跟踪剪切流下钱德勒环形成的全血凝块的纤维蛋白溶解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 了解体外溶栓模型中钱德勒环结合实时荧光流动纤溶检测法监测全血凝块纤维蛋白溶解的方法。该技术可提高体外检测的生理相关性，为筛选更优溶栓药物提供可靠平台。

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本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助，项目编号为 R01HL167877。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

以下提到的所有方法均符合机构审查委员会（IRB）协议以及机构人类研究伦理委员会的要求。所有健康志愿者在献血前均签署了书面知情同意书。需要注意的是，本方案中提及的所有材料均可在材料表中找到。尽管本方案主要讨论人全血（WB）和血浆，但也可购买并使用实验动物血液及因子缺乏的血液制品作为替代。
1. 全血采集
<ol>
	<li>采用标准静脉穿刺技术，从知情同意的健康志愿者处采集静脉全血（WB）。 
	注意：在整个操作过程中，必须遵循通用预防措施，以降低接触血液或其他潜在传染性物质的风险。操作时需佩戴手套、实验服和面罩。</li>
	<li>将约 50 mL 全血直接采集至含 3.2% 枸橼酸钠的采血管中，并立即转移至 50&#160;mL 管中混合，以供后续使用。 
	注：在使用枸橼酸钠管采集血液前，应先弃去一管血液，同时确保采血管填充至制造商推荐的体积。新鲜采集的全血最能真实反映宿主的凝血动态。全血可在室温下短期保存（使用前 ≤4 小时），但不可过夜保存，因为已有研究表明，通过血栓弹力图检测时，过夜保存会影响凝血动态15。</li>
</ol>
2. 血栓形成
<ol>
	<li>在3 mL抗凝全血中加入荧光素（异硫氰酸荧光素 [FITC]）标记的纤维蛋白原（FITC-Fg），使其终浓度为60 µg/mL（假设血浆内源性纤维蛋白原浓度为3 mg/mL，则标记纤维蛋白原与未修饰纤维蛋白原的比例为1:50）。 
	注意：该比例可提高至最高1:10，对凝块形态的影响极小。13, 14 荧光标记纤维蛋白原可直接购买，或通过将纤维蛋白原与异硫氰酸荧光素（FITC）反应自行制备。纤维蛋白原的混合应在实验开始前≤5分钟内完成。
	<ol>
		<li>若纤维蛋白原先前已分装并冷冻保存，使用前应检查解冻后的FITC-Fg，确保其未提前发生聚合而失效（确保溶液中无颗粒物或纤维存在）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将Chandler环装置置于37 °C水浴中，使用直径为120&#160;mm的滚筒（图1）。确保Chandler环装置在整个凝块形成过程中能够以0–90 rpm的恒定转速旋转。 
	注意：更多关于Chandler环装置的设置与改进方法可参见Zeng等人的研究.16。</li>
	<li>裁剪导管（内径5/32&#34;，外径7/32&#34;），使其形成可牢固但不过紧地环绕滚筒的环状结构。对于本文推荐的导管尺寸，可将标准200 µL PCR管裁剪后用作连接导管两端以形成闭合回路的接头。 
	注意：可使用不同尺寸的导管以生成不同大小的凝块16。</li>
	<li>通过加入200 mM氯化钙溶液启动血液凝固，氯化钙溶液与全血的体积比为1:17。使用3 mL注射器将血液注入导管中（填充约导管体积的50%）。立即将导管环安装到Chandler环滚筒上，连接两端并开始旋转。
	<ol>
		<li>在装样前应轻轻倒置混合，确保充分混匀，避免因全血成分沉降而影响实验结果。</li>
		<li>每次运行时应向每根导管中加入等量血液，否则不一致的血量可能影响凝块大小。</li>
		<li>由于血液柱中的气泡也可能影响凝血过程，可在装样前通过轻柔地以&#34;跷跷板&#34;方式移动导管，促使气泡逸出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将滚筒部分浸入水浴中，以40 RPM的转速旋转，以实现约450 s-1的计算剪切速率。 
	注意：有关基于导管尺寸和转速（20至60 RPM）的剪切速率计算方法，请参见Zeng等人的研究16。典型的静脉和动脉剪切速率分别为20–200 s-1和300–1,000 s-1，而约400–500 s-1可代表肺动脉的剪切条件。</li>
	<li>在低光照条件下使凝块形成40–60分钟，以最大程度减少荧光标记纤维蛋白原的光漂白。</li>
	<li>达到所需凝血时间后，从导管中取出凝块并立即使用。为确保轻柔取出凝块而不破坏其结构，可轻轻倒置导管，使凝块缓慢滑出至小型容器中。 
	注意：将形成的凝块在4 °C条件下过夜保存于抗凝血浆或PBS中，可能会影响后续在流动环路中对凝块降解的分析。</li>
</ol>
3. RT-FluFF 仪器设置
<ol>
	<li>确保流环装置的连接方式如图2所示，并且所有连接处均牢固可靠。简而言之，流环装置按流动方向依次包括：泵 &#62; 阻尼器 &#62; 入口压力传感器 &#62; 血栓 &#62; 出口压力传感器 &#62; 荧光计 &#62; 加热储液槽 &#62; 泵。根据每项研究特有的实验需求，调整泵容量、实验流速、管路直径与长度、温度、储液槽体积以及血栓大小/几何形状的选择。 
	注意：在本示例中，RT-FluFF 使用了与钱德勒环路相同直径的管路。同一天内管路可多次使用，但需监测是否出现降解或泄漏情况，并根据需要进行更换或冲洗。建议每次运行之间用温热的蒸馏水冲洗管路。根据实验设计的不同，可能需要在每次运行后更换管路。</li>
	<li>所有管路固定完毕后，打开压力监测仪。检查压力监测仪显示的入口和出口传感器读数是否均为 0 mmHg。若非如此，请打开阀门，确保压力传感器与大气压相通，并将传感器归零。</li>
	<li>开启所用加热块或水浴装置，并在实验过程中持续监测温度。保持温度接近 37 °C，以模拟人体生理温度。</li>
	<li>将泵开启至所需流速，检查是否存在泄漏，并确认压力传感器正常工作。 
	注意：在此管径条件下，约 160 mL/min 的流速对应约 500 s-1 的剪切速率。</li>
	<li>关闭泵，以便进行血栓加载。</li>
</ol>
4. 将血栓装入流动回路
<ol>
	<li>如果使用的是之前制备并储存的血栓，请确保在将其装入流动回路系统前，先将血栓恢复至室温。</li>
	<li>血栓质量损失是溶栓实验中一项重要的终点测量指标。最佳做法是在将血栓装入流动回路前立即测量其质量，而不是依赖之前的测量结果。
	<ol>
		<li>为了确保不同样本及不同实验日之间的数据一致性，每次测量血栓质量时都应采用相同的方法，因为血栓内部及表面的液体含量会显著影响其质量。推荐做法是用实验室擦拭纸轻轻吸去血栓表面液体，直至擦拭纸上不再有明显液体渗出，注意在整个测量过程中避免挤压血栓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血栓浸入血浆（自体或配型血浆）或其他用于流动回路的流动相溶液（如 PBS 或特定培养基）中，容器可选用称量皿等浅底容器。流动相溶液应直接取自 50 mL 系统储液罐，以控制整个系统的总体积。在血栓装载阶段，不应含有任何溶栓剂或药物测试剂。建议流动回路运行时流动相的总体积 ≥50 mL，并在所有样本间保持一致。</li>
	<li>拆下流动回路管路的中央部分（位于入口和出口传感器之间），并将一个 10 mL 注射器连接到管路的一端。</li>
	<li>使用管路的自由端插入血浆（或流动相）中，吸取少量溶液以润洗并填充管路。然后将管路入口靠近血栓，仔细观察血栓以识别其头部（通常为稍厚的一端）和尾部（与头部相对的一端）。血栓头部应朝向入口压力传感器，并远离出口。将管路置于血栓的&#34;尾部&#34;端，用注射器抽吸使血栓进入管路。 
	注意：当无法通过视觉判断血栓头尾方向时，可根据 Chandler 回路滚筒的旋转方向确定——血栓头部朝向与滚筒旋转方向相反。</li>
	<li>将管路重新连接至主装置，使血栓最靠近出口压力传感器（血栓头部应背向出口传感器）。使用两根 30 G 针头以&#34;X&#34;形方式刺穿管路和血栓头部，将血栓固定在位。实验全程保留这些针头。 
	注意：根据阻尼器和泵的设置，可能需要额外针头以防止血栓过早破裂。如有必要，可在血栓下游的管路中加装滤网，防止血栓碎片在系统中循环。一旦确定固定血栓所需的针头数量，应在所有实验条件下保持一致。</li>
	<li>将剩余的流动相溶液转移至一个 50 mL 离心管中作为储液罐。</li>
	<li>将储液罐放入水浴中，并将入口和出口管路置入其中（出口连接荧光检测仪，入口插入泵头）。</li>
	<li>检查所用荧光检测仪是否已连接并正常监测。确认实验开始时，其初始读数相对于仅含流动相系统的基线值是否合适。 
	注意：若无在线荧光检测仪，可在流动回路分析期间按预定时间间隔对储液罐进行连续定期取样。实验结束后，可使用 96 孔板在任何商用分光光度计上立即读取所收集的样品。</li>
	<li>向储液罐中直接加入 500 µL 浓度为 100,000 ng/mL 的 tPA，使 50 mL 体系中的终浓度达到 1,000 ng/mL。所加体积、浓度及具体药物应根据目标循环浓度和系统储液罐体积进行调整。</li>
	<li>启动泵前请检查以下事项：
	<ol>
		<li>所有连接处均已牢固。</li>
		<li>压力传感器上方的两个阀门处于适当的关闭位置。</li>
		<li>储液罐中残留的血浆（或液体）已补充完整。</li>
		<li>溶栓剂已加入储液罐并充分混匀。</li>
		<li>入口管路接近储液罐底部（以确保气泡最少）。</li>
		<li>出口管路已固定，并处于目标压力所需的高度（取决于所模拟的血管位置）。</li>
		<li>泵的旋转方向正确（流动顺序：泵 &#62; 阻尼器 &#62; 血栓 &#62; 荧光检测仪 &#62; 储液罐 &#62; 泵）。</li>
		<li>若泵转速设置过高（&#62;150 rpm），应先以较低速度启动，再逐步提高转速，以避免压力骤变导致血栓破裂或管路泄漏。</li>
		<li>确保系统正从荧光检测仪正确记录数据，或已准备好试剂用于实验期间对流动相进行定期取样，以便在各时间点进行后续检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启泵并调节至目标体积流速 160 mL/min，或调节流速直至达到目标压力。系统将充满液体并产生气泡。气泡会人为升高荧光读数，因此需观察气泡排出情况。待气泡排尽后，关闭光源并开始数据采集。</li>
	<li>保持泵持续运行，直至血栓显著降解或达到预定实验时间（≥60 分钟）。实验过程中可根据需要通过储液罐向系统添加试剂，以创建不同的实验条件，测试多种溶栓方案的变化。 
	注意：实验时间将取决于泵的流速（剪切力水平）和溶栓剂浓度。</li>
	<li>实验完成后，降低体积流速，在泵仍在运行时移除入口管路，使系统中的大部分液体排入储液罐（部分流动相将残留在管路中）。断开位于出口压力传感器侧的含血栓管路段，并将其放入称量皿中。</li>
	<li>移除固定血栓的针头，收集系统内残留液体以及血栓/血栓碎片中的残余液体。必要时可使用注射器辅助清除系统内液体。</li>
	<li>称重并处理剩余血栓，用于进一步分析，如计算质量损失百分比或进行组织学分析。</li>
</ol>
5. 系统清洗
<ol>
	<li>在不同样品之间，使用温水以高转速（&#62;150 rpm）冲洗整个系统。将水加入储液罐中，运行系统至少2分钟，排空后重复冲洗两次。完成上述冲洗步骤后，若荧光计读数仍未恢复至基线水平，则额外重复一次冲洗流程。若读数仍无法回到基线，应在检测下一个样品前彻底更换管路。 
	注意：实验过程中，管路可在样品间重复使用；但由于用于固定凝块的针头穿刺会造成管路破损，因此位于入口和出口压力传感器之间的管路段应在每次运行后更换。在某些实验条件下，为避免样品间的交叉污染，可能需要在每次运行后或成组检测后更换整套管路。</li>
	<li>当日所有样品检测完成后，取下全部管路并丢弃。用热水和毛刷彻底刷洗T型接头直至洁净，晾干，并用热水冲洗注射器减震装置。可使用70%乙醇以提高无菌性。</li>
</ol>

Combining the Chandler Loop and RT-FluFF for Ex Vivo Clot Lysis Monitoring

<ol><li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+of+thrombolytic+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).</li>
<li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+ischemic+stroke+models%3A+replicating+human+stroke+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li>
<li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684(2014).</li>
<li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14(2006).</li>
<li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li>
<li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).</li>
<li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+haemostasis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833(2020).</li>
<li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).</li>
<li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li>
<li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization%2C+fibrinogenolysis%2C+or+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

血凝块形成与标记 
Chandler循环已被证明是一种简便有效的方法，可重复地生成模拟血栓 体内 血栓16通过微调管路尺寸、转速、滚筒直径和凝血时间等参数，可在不同剪切条件下快速生成具有多种血栓结构特征的凝块，从而模拟动脉和静脉来源的血栓。如我们在RT-FluFF系统中所展示的，引入FITC-Fg等标记物的额外灵活性进一步拓展了这些血栓的应用潜力。尽管Chandler环路的基本原理较为简单，但在血块形成过程中需持续处理全血及血液制品，因此在实现稳定一致的血块形成方面仍存在较高的初始学习曲线。这主要是因为全血在启动凝血前后极短时间内对操作方式极为敏感。尤其重要的是，在Chandler环路的血块形成步骤中所选用的管路，因血液与材料表面的相互作用可能影响血块形成的进程。管路应选用医用或外科级材料（无热原、无溶血性），并具有低生物反应性。如我们结果部分所述，在技术掌握的初期阶段，随着实验者根据实验规模和特定检测需求逐步优化操作流程，所形成的血块出现差异是可预期的。鉴于血块结构对其在纤溶过程中的行为具有重要影响，最终实现可重复性至关重要。最后，即使在健康志愿者之间，凝血特性也存在个体差异，这应在实验设计中予以充分考虑。
RT-FluFF 检测 
以 FITC-Fg 作为标记物，通过荧光/分光光度法定量检测纤维蛋白溶解，相较于主要依赖终点凝块质量评估的传统技术，具有诸多优势。该方法能够在接近生理流动参数的环境中实时或近实时地监测纤维蛋白溶解动力学，较传统的溶栓药物筛选检测实现了显著改进。本检测在设计时有意采用当前规模，以更贴近临床相关的凝块尺寸、流场、体积流量及凝块负荷，而非完全微型化的微流控方法。若将 RT-FluFF 装置缩小，则需使用更小直径或更短长度的管路，这将导致系统偏离理想的流动模式，降低其生理相关性。与钱德勒环路（Chandler loop）类似，RT-FluFF 系统可通过在恒定流速下调节流体压力来控制剪切速率，并可选择所使用的流动介质。此外，RT-FluFF 系统还能支持脉动流和独特的凝块消化几何结构，同时在整个消化过程中允许对流动相进行周期性取样，而钱德勒环路因其旋转封闭式消化结构，无法实现取样。这些参数对凝块溶解的影响已在 Zeng 等人的研究中得到深入探讨14。
综上所述，钱德勒环路形成的血栓以及RT-FluFF分析管路在血栓形成和血栓消化步骤中可采用相同或不同直径，以实现不同程度的血管阻塞，从而模拟从部分到接近完全血管闭塞的血栓栓塞情况。本文所述的所有实验均在钱德勒环路和RT-FluFF系统中使用了相同直径的管路。若RT-FluFF系统中管路直径增大，则流动相储液池的体积可能需要相应增加，以容纳系统填充所需的额外体积。储液池体积的增加还可能导致需要向系统中添加更多的溶栓药物或药物，并同时增加血浆或流动相的需求量。尽管使用自体血浆最为理想，但为满足所有实验组及重复样本在钱德勒环路血栓形成和RT-FluFF流动相体积方面的需求，需从单个供体采集极大量的血液，这在实际操作中难以实现。因此，通常采用血型匹配的混合血浆，其来源可为血液捐献中心或商业供应商。虽然整体RT-FluFF分析管路可在一定程度上缩短，但仍存在限制，需确保所有组件有足够的空间保留在循环回路中以完成消化实验。尤其重要的是，血栓上游所用管路段必须超过基于管路直径和流速计算得出的最小长度，以确保流动到达悬浮血栓时已形成层流。无论选择何种管路尺寸，钱德勒环路血栓形成步骤中所述的管路设计原则同样适用于RT-FluFF系统的管路。需要再次强调的是，在压力传感器之间的管路段（通过两根针以&#34;X&#34;形方式固定钱德勒环路形成的血栓）必须在每次实验后更换，以防止针刺部位发生泄漏。在流动条件下利用针头固定血栓可有效限制血栓聚集，并使血栓相对于流动方向具有特定取向，从而提高实验间的一致性。尽管本文仅描述了使用tPA进行的一次代表性血栓消化实验，但钱德勒环路与RT-FluFF分析系统具备高度可定制性，可适应多种血栓结构、报告分子、剪切速率及消化条件，用于测试新型纤溶药物。
局限性 
与目前用于筛选纤溶药物的任何平台或方法一样，RT-FluFF 检测也存在某些必须承认的局限性。首先，在钱德勒环路（Chandler loop）中形成的血栓，尽管表现出在体内常见的结构特征， 体内 血栓仍在与原来不同的环境中形成 体内 存在脉动血流及内皮细胞相互作用的血栓17 此外，尽管已优化 FITC-Fg 浓度以尽量减少对凝块结构的影响，但添加修饰后的纤维蛋白原仍偏离了生理条件。选择血浆作为流动相介质可能影响荧光分光光度计的使用，因为血浆中的蛋白质和脂质成分会产生少量背景信号，且该信号可能因供体不同而有所差异。RT-FluFF 装置的一个潜在重要局限性在于红细胞（RBCs）对荧光测定读数的负面影响，这限制了在使用 FITC 作为荧光标记的凝块降解示踪剂时将全血（WB）用作流动相。一种可行的缓解方法是在使用分光光度计读取各个时间点之前，增加离心步骤以沉淀红细胞，或采用受红细胞存在影响较小的其他凝块降解报告标记。18在实验设计时应仔细考虑，以确保对重要变量进行有效控制。例如，若选择血浆作为流动相，则最好将多个供体的血浆混合使用，以尽量减少不同供体之间在凝血和纤溶特性上的差异。最后，与任何荧光标记蛋白一样，由于纤维蛋白原表面的FITC标记彼此相对靠近，自然会产生荧光淬灭的问题19.
结论与未来方向 
研究溶栓等动态过程需要一个同样动态的环境，以复制生理条件并同时控制多个参数。高保真 RT-FluFF 系统填补了这一空白，将在新型溶栓药物的未来开发和筛选中发挥重要作用，助力其在进入动物模型前的转化研究。RT-FluFF 是一个高度灵活的平台，具备多种本文未详述的功能，可根据制药药物设计的独特需求、作用机制或不同凝血疾病状态的模拟需要，整合到实验方案中。我们在 RT-FluFF 系统中已观察到的优势包括：(a) 可变的管路几何结构和配置，(b) 实时压力监测，与管腔阻塞程度相关联，(c) 无需人工干预的实时荧光检测，(d) 实验时长和采样频率的灵活性，(e) 使用储液器以模拟 in-vivo 条件，(f) 类似 in-vivo 的剪切&#160;流模式，(g) 可选脉动流模式，(h) 在 Chandler 环中灵活构建代表不同疾病的血栓模拟物，(i) 可检测药物对血栓形成或血栓降解的影响，以及 (j) 通过透明管路对血栓底物进行直接成像，以追踪整体血栓降解过程，并支持降解后进行纵向视频分析。

由血栓栓塞性病因根本引起的疾病是当今社会发病率和死亡率的主要来源。血栓栓塞性发病机制的表现包括但不限于心肌梗死、缺血性卒中、深静脉血栓形成和肺栓塞1。大量正在进行的跨学科研究集中在开发安全有效的病理性血栓处理方法上。由于血栓在动脉和静脉中的表现不同，且解剖位置各异，因而发展出了不同的治疗策略。然而，在急性期治疗中，通常依赖于通过纤溶酶原激活剂进行药物溶栓，而在某些临床情况下，可能辅以机械取栓术2。
新型药物治疗策略的开发从根本上依赖于用于临床前测试的体内动物模型和体外消化模型3,4。体内模型的优势在于能够自然地反映多种生理参数对治疗效果的复杂相互作用，包括药物清除过程以及细胞与药物之间的相互作用。然而，这种复杂性本身常常导致模型成本高昂，并且在试图解析与人类生理显著不同的动物体内的药效动力学/药代动力学机制时，会引入额外的问题。体外模型的开发通过提供一个简化的测试环境，有助于药物的开发与筛选，但往往缺乏充分的保真度，难以准确重现所研究的疾病状态。
目前常见的体外（in-vitro）测试新型溶栓药物的方案通常依赖于在静态条件下形成并溶解血栓，以残留血栓质量作为主要终点指标5,6。然而，这类方法未能考虑血栓溶解过程中的力学因素，例如湍流和跨血栓压力降，这些因素可能显著改变受试药物的药效动力学。此外，在静态条件下形成的血栓其微观结构与生理状态下的血栓存在差异。已有可重复的研究表明，血栓形成过程中剪切力的存在会影响最终血栓的特性，如血小板活化和纤维蛋白交联。在剪切流动条件下形成的血栓从头到尾呈现出复杂的异质性，而静态形成的血栓则缺乏这种特征7,8。此类与生理血栓结构的偏离可能影响药物研发中的关键表征参数，包括药物在血栓内的渗透能力及其后续的溶解效率9。
为解决与静态凝血/血凝块溶解模型相关的部分局限性，近年来重新采用了钱德勒回路（Chandler loop）系统，用于在剪切力存在条件下同时研究血凝块的形成与溶解10。尽管此类系统相较于相对静态的检测方法能更真实地模拟血流动力学，并生成具有更接近生理结构特征的血凝块，但其简化的流动条件仍与真实生理环境存在偏差。最后，微流控技术也已被应用于相关研究，因其成像便捷且流动模式均匀；然而，该方法仍显著偏离大多数临床相关血栓栓塞性疾病中主要受累大血管内的实际生理条件11,12。
鉴于上述讨论，我们开发了一种高保真的 体外 用于临床前溶栓药物筛选的溶栓模型。该模型旨在解决上述新型溶栓疗法筛选领域中存在的一些当前缺陷，并已通过不同浓度组织型纤溶酶原激活物（tPA）条件下的可重复性和敏感性验证。本文所述系统利用蠕动泵、压力阻尼器、加热储液槽、两个压力传感器、在线荧光计以及荧光标记的钱德勒环剪切形成的血凝块类似物，提供生理性的剪切流，以实现对纤维蛋白溶解过程的实时追踪13综上所述，整个系统被称为 实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF 检测法）14 本文将探讨在此高保真系统中成功建立和运行检测方法的复杂细节 体外 溶栓模型

<table><tbody><tr><td>30 G&amp;nbsp;一次性皮下注射针头</td><td>Exel International&amp;nbsp;</td><td>26439</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>6 mm 高速钢车床棒料，长 150 mm</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96孔透明平底紫外透光微孔板</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>其他耗材，未处理丙烯酸共聚物，非无菌</td></tr><tr><td>Air-Tite 带鲁尔锁非无菌 60 mL 注射器</td><td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF 装置，减震器</td></tr><tr><td>Arium Mini Plus 超纯水系统</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>去离子水水源</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>一次性血压传感器</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>Drager Siemans HemoMed 模块</td><td>Drager</td><td>5588822</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>Drager Siemans 患者监护仪</td><td>Drager</td><td>SC 7000</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>滚筒（圆柱体，直径 120 mm，宽度 85 mm）</td><td></td><td></td><td>钱德勒循环仪</td></tr><tr><td>面罩</td><td>Moxe</td><td>SHIELDS10</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人血浆来源纤维蛋白原，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>接头，聚碳酸酯材质，四通旋塞，雄性鲁尔锁，非无菌</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>荧光素（FITC）</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>通用型水浴锅</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4 &amp;times; 4 加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>人源新鲜冷冻血浆</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂</td></tr><tr><td>人全血&amp;nbsp;</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-WB-SDS&amp;nbsp;</td><td>其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂</td></tr><tr><td>L/S Easy-Load II 泵头，适用于高性能精密管路，PPS 外壳，不锈钢转子</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF 装置，泵头</td></tr><tr><td>L/S 可调速数字驱动泵，带远程 I/O，6 至 600 rpm；90 至 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF 装置，泵</td></tr><tr><td>电机调速控制器</td><td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nalgene 管路 T 型连接器</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>蠕动泵管路&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>06424-15&amp;nbsp;</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>其他耗材，粉末，pH 7.4，用于配制 1 L 溶液</td></tr><tr><td>开关电源</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific National Target 全塑料一次性 10 mL 注射器</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>人组织型纤溶酶原激活物</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>管路内径 1/4''，外径 3/8''</td><td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>其他耗材，切成 1.5 cm 小段，用于将管路连接至 T 型连接器</td></tr><tr><td>管路内径 5/32&quot;，外径 7/32&quot;</td><td>Tygon</td><td>ND-100-65, ADF 00009&amp;nbsp;</td><td>其他耗材</td></tr><tr><td>V3 365 nm 迷你黑光紫外手电筒</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>钱德勒循环仪，用于检查已形成的血凝块</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 直流电机，12 V，100 rpm</td><td>Pangyoo</td><td>ZGA37RG</td><td>钱德勒循环仪，&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

在体外溶栓模型中通过剪切流追踪钱德勒环路法形成的全血凝块的纤维蛋白溶解过程

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

血栓栓塞及相关并发症是全球范围内导致发病和死亡的主要原因，目前已开发出多种检测方法，用于评估溶栓药物的有效性 体外 和 体内对更符合生理相关性的需求日益增长 体外 用于药物开发的血栓模型，由于动物模型的复杂性和高昂成本，以及其结果往往难以转化为人类生理情况。血流、压力和剪切速率是循环系统的重要特征，流动条件下形成的血栓在形态和降解特性上均不同于静态条件下形成的血栓。这些因素在传统模型中常常未被体现 体外 血凝块消化实验，可能具有影响药物转化成功率的药理学意义。
的 Real-T时间 流感口部测量法 F低 F纤维蛋白溶解（RT-FluFF）检测是一种高保真血栓溶解测试平台，采用在剪切流条件下形成的荧光标记血凝块，并在有或无纤维蛋白溶解药物存在的情况下，利用循环血浆对其进行消化。通过调节血凝块形成和消化阶段的流速，该系统可在高度多样化的实验设置中模拟动脉、肺动脉和静脉环境。可通过在线荧光计连续测量，或采集离散时间点进行检测，亦可采用传统的终点血凝块质量测定方法。RT-FluFF检测是一种灵活的系统，能够在更真实地模拟生理流动条件的情况下，实时追踪血凝块的消化过程。 体内 生理条件下同时保持实验的可控性与可重复性 体外 测试系统

钱德勒环路血栓形成 
在形成血栓时，我们通常制备四份重复样本，以确保即使存在个别血栓异常（基于宏观形态和质量判断），仍可进行三份重复的溶栓实验。在理想加样条件下，所形成的血栓在长度（约3.3 cm）、重量（约100 mg）和外观上应高度均一，如图3所示。当使用FITC-Fg时，我们还旨在通过紫外光下观察血栓，以确认荧光分布相对均匀，而非在血栓内部出现荧光标记过强的不规则区域。在我们研究的浓度范围内，全血中FITC-Fg的浓度变化不应影响血栓的重量或外观；然而，在最高浓度的FITC-Fg（1:5 FITC-Fg与未修饰Fg）下，微血栓结构会受到影响。Zeng等人的前期工作展示了在不同剪切力条件下，钱德勒环路中可能形成的广泛血栓表型16。
有时可能发生异常凝血。最常见的凝块形成问题可分为两类：（i）过早凝血和（ii）凝血功能受损。在过早凝血的情况下，全部血样会在钱德勒循环管路内完全固化。当启动滚筒旋转时，这一现象会变得明显：血液不会“流动”，而是黏附在管壁上并随管壁同步旋转。在此情况下，所形成的凝块无法使用，必须弃用。为避免此问题，需确保在加入氯化钙启动凝血后，立即关闭循环回路并将其置于旋转滚筒上，以启动凝血过程。第二种情况即凝血功能受损，通常发生在样本混合不充分，或血液在旋转开始前已启动凝血但程度尚不及第一种情况时。具有上述问题的凝块在操作时通常呈现纤维状且结构松散，并常伴有显著增高的凝块质量。从表型上看，这类凝块类似于在极低静脉剪切力条件下观察到的凝块，因为这本质上代表了静止状态下的凝血过程。偶尔出现不规则凝块属正常现象，应予以弃用。
RT-FluFF 荧光计校准 
RT-FluFF 系统的一个重要组成部分是用于在血凝块消化过程中实时追踪溶栓过程的荧光计或分光光度计。在开展任何实验之前，确保荧光计或分光光度计正常工作至关重要。就我们的目的而言，由于我们设计的荧光计专用于 RT-FluFF 装置，因此需要验证其在含有已知浓度 FITC-Fg 稀释液的静态溶液中，能否与分光光度计保持良好的相关性（图 4A）。在明确确定了荧光计的线性检测范围后，我们进一步探究了其在流动条件下的响应行为。通过逐步向流动溶液中注入荧光素，验证仪器功能，以监测荧光信号的阶梯式上升，从而更好地理解荧光计读数的可重复性，并确定荧光在流动系统中达到平衡的速度（图 4B）。后续实验通过持续稳定地向溶液中注入荧光素和 FITC-Fg，以更真实地模拟纤维蛋白溶解实验中预期的连续荧光释放过程（图 4C）。FITC-Fg 与 FITC 之间斜率的差异被认为源于荧光猝灭效应，即当 FITC 分子彼此靠近时（例如多个 FITC 分子连接于单个蛋白质分子上，此处为纤维蛋白原）所发生的荧光强度降低现象。显然，阶梯式上升的幅度和斜率不仅取决于所用 FITC/FITC-Fg 的浓度，还取决于每个纤维蛋白原分子上连接的 FITC 分子数量。因此，若希望在多个血凝块批次之间比较数据，在使用 RT-FluFF 进行实验时，严格控制 FITC 与纤维蛋白原的偶联程度变得尤为关键。通过大量实验，我们发现每个纤维蛋白原分子上偶联约 14 个 FITC 分子时，既能提供足够强的荧光信号用于追踪血凝块消化过程，又可在溶液中保持稳定（减少过早聚集），并对最终形成的血凝块微结构影响最小。需要注意的是，当将纯的、未凝固的 FITC-Fg 通过 RT-FluFF 装置时，FITC-Fg 暴露于高剪切力环境可能促进其聚集。该现象最常出现在管路连接处和泵头管段中，并可能随着时间推移影响溶液中可检测的荧光强度。
当从流环系统中在离散时间点采集样本，并使用分光光度计检测荧光时，许多与荧光计校准相关的因素可能无需考虑。然而，仍需评估所用特定分光光度计的动态范围，以确保FITC-Fg标记效率、钱德勒环路（Chandler loop）中形成的血凝块内FITC-Fg的含量以及血凝块的大小在您的系统中均处于最佳状态。建议样本在从系统中分离后立即检测，或在实验结束后置于96孔板中进行多孔批量读数。如有必要，可在采集样本后直接进行酸化处理，以在分析前终止可能的酶活性。
RT-FluFF 血栓溶解 
为验证在钱德勒环路（Chandler loop）中模拟动脉剪切力条件下形成的血栓所使用的 RT-FluFF 系统，我们在装置中采用人血浆作为流动相，并以 tPA（阿替普酶，Alteplase）作为纤溶剂。所测试的 tPA 浓度范围为 0 至 1,000 ng/mL。为模拟人体肺部血流条件，血浆储液槽的温度维持在 37 °C，并将其物理抬高至血栓水平上方 8 cm，以提供平均 12 mmHg 的流动压力；同时调节泵速，使在无血栓情况下产生约 500 s-1 的剪切流动。系统中加入了脉动流阻尼器，以最小化蠕动泵产生的峰压与谷压之间的波动，从而实现近乎恒定的剪切速率（图 4D）。若无压力阻尼器，由于蠕动泵通过泵头旋转逐次排出小体积液体来产生流动，其输出压力会显著波动。血栓溶解过程持续观察 60 分钟。如预期所示，随着 tPA 浓度升高，血栓溶解速率（RFU/分钟）加快，质量损失也较低浓度或无 tPA 条件下更为显著。当 tPA 浓度为 1,000 ng/mL 时，在 60 分钟孵育期间实现了约 85% 的血栓溶解。通过观察血栓溶解过程中的宏观图像可见，溶解主要起始于血栓尾部区域，随后才影响结构更致密的头部，这既体现在血栓结构的物理降解，也反映在表面荧光的丧失。此外，随着机械完整性随时间推移而减弱，血栓还会出现预期的拉伸现象，且该现象依赖于剪切速率。
尽管从宏观观察和荧光释放情况可明显看出凝块溶解速率存在显著差异，但荧光释放量与纤溶物质含量之间并不存在完全线性的相关性。这一点在图5中最为明显。基于全血形成的凝块发生纤溶时，不仅会释放出在凝块形成过程中被包裹在纤维蛋白网络中的FITC-Fg片段，还会释放红细胞（RBC）。这些红细胞进入循环后，在RT-FluFF装置中会使循环血浆逐渐呈现明显的红色。循环血浆的这种颜色变化可能对荧光检测器传感器所读取的循环FITC-Fg的荧光发射信号产生负面影响。当纤溶物质浓度达到较高水平时，溶液中FITC-Fg的释放程度将超过红细胞对荧光发射的影响。
<img alt="旋转流变仪实验；用于血液凝块形成分析的示意图与装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：Chandler环路装置的示意图。 装有血液的试管置于Chandler环路滚筒上，在凝块形成过程中全程浸没于37 °C水浴中，并保持环境光线昏暗。滚筒通过直流电机、传动轴和控制板以恒定转速旋转。该图经Zeng等14修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态流体系统示意图；通过泵和传感器调节流速；荧光检测，激光二极管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：RT-FluFF系统的示意图。 图中标注了系统的重要组成部分。图中显示了一个大体积阻尼器，用于减少使用蠕动泵时流动中的脉动。若无在线荧光仪，还可通过以下两种方式实现周期性取样：1）直接从储液罐取样；或 2）增设一个在线取样口以提取流动相。本图改编自Zeng等14。缩写：RT-FluFF = 实时荧光流动纤维蛋白溶解测定法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静力平衡；凝块荧光、比值分析、示意图、柱状图结果、紫外光与室光对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Gross Chandler环中FITC-Fg标记的全血凝块特征，包括质量和在环境光与紫外光下的宏观外观。（A）通过优化Chandler环凝块形成方案，可在多种凝血条件下实现一致的凝块形成。需注意的是，凝块的质量和外观会因导管直径、旋转速度及凝块形成时间的长短而显著不同。图中所示凝块是在37 °C、剪切速率为506 s-1的条件下旋转1小时形成的。比例尺 = 20 mm。（B）在Chandler环中使用不同比例的FITC-Fg所形成的凝块质量。数据表示不少于三个重复数据点的平均值±标准差。本图经Zeng等14修改。缩写：FITC-Fg = 异硫氰酸荧光素标记的纤维蛋白原；WB = 全血。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="荧光检测结果：荧光素、FITC-Fg 的相对荧光单位（RFU）随时间变化；压力测试用的注射器减震装置设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：荧光计性能表征。（A）在已知浓度的 FITC-Fg 稀释液条件下，RT-FluFF 在线荧光计与分光光度计的对比结果。（B）逐步向 RT-FluFF 系统中引入荧光素，以测定荧光计在流动人血浆中的重复性及荧光平衡时间。（C）在 RT-FluFF 平台上对荧光素与 FITC-Fg 进行连续输注的比较。斜率差异可能源于 FITC-Fg 组中的荧光淬灭效应。（D）在相同体积流量条件下，使用不同尺寸减震器时，出口压力传感器（血凝块后）的波形图。本图经 Zeng 等人14 修改。缩略语：FITC-Fg = 异硫氰酸荧光素标记的纤维蛋白原；RT-FluFF = 实时荧光流动纤维蛋白溶解检测。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="tPA 效应分析；图表显示 RFU 随时间变化、质量损失随 tPA 浓度变化；实验照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：RT-FluFF 平台中的溶栓作用。（A）在循环 tPA 存在下，血凝块消化持续 60 分钟期间荧光上升的代表性斜率。注意初始溶栓滞后时间，因为 tPA 对纤溶酶原的激活及血凝块消化并非瞬时发生。（B）在不同浓度 tPA 及不同溶栓模式下血凝块质量损失的百分比，包括：RT-FluFF 系统、钱德勒循环（Chandler loop）在恒定剪切力下的血凝块消化，以及静态（无剪切力）血凝块消化。数据表示至少三个重复数据点的平均值 ± 标准差，双星号表示 p 值 < 0.01，三星号表示 p 值 < 0.001。（C）在 tPA 浓度为 200 ng/mL 时溶栓的宏观特征。本图经 Zeng 等人14 修改。缩写：RT-FluFF = 实时荧光流动纤溶测定法；tPA = 组织型纤溶酶原激活物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

体外 溶栓实验常常难以复制 体内 条件，无论是在血栓模型被消化的过程中，还是在溶栓发生的环境中。在此，我们探讨如何将钱德勒循环系统（Chandler loop）与实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF）相结合 用于高保真， 离体血凝块溶解监测

血栓栓塞及相关并发症是全球范围内导致发病和死亡的主要原因，为此已开发出多种检测方法以进行测试……

血栓形成与多种疾病状态相关，而现有治疗方法存在严重出血风险。循环系统中的血流对血凝块结构具有显著影响。将血流因素纳入体外模型可能提高其生理相关性，从而改善体内试验候选药物的筛选效果。研究纤溶作用的实验主要采用静态凝块或微流控系统，以评估溶栓时间、凝块结构或黏弹性等特性。静态凝块溶栓实验通常依赖分光光度法测量或凝块质量测定作为终点指标，以评价纤溶效率。目前的溶栓检测使用的是静态条件下形成的凝块，其结构与流动条件下形成的凝块存在差异。微流控系统需要考虑流动动力学，但由于其尺度更小，会产生独特的血流动力学特征和血栓结构。目前开发的RT-FluFF实验方法可在生理流动条件下实时监测溶栓过程，操作简便。这意味着我们现在拥有一个可调控多个参数的平台，能够更贴近研究模型的生理条件，从而在筛选新型溶栓药物时实现更优的转化应用。首先，将荧光标记的纤维蛋白原加入 3 毫升枸橼酸钠抗凝人全血中，使其终浓度达到每毫升 60 微克。在 37 摄氏度水浴中设置 Chandler 循环装置，使用直径为 120 毫米的滚筒。剪切一支标准的 200 微升 PCR 管，并连接管路两端。为启动血液凝固，向3毫升全血中加入176微升200毫摩尔氯化钙。轻轻倒置混匀后，使用3毫升注射器将血液注入导管中，并立即将导管两端连接至钱德勒环装置的滚筒上。在低光照条件下，将滚筒部分浸入水浴中，以40 rpm转速旋转。40至60分钟后，从导管中移除血凝块。大体Chandler环路中，FITC标记纤维蛋白原的全血样本在紫外光下显示荧光分布均匀。此外，在全血中改变FITC纤维蛋白原的浓度不会影响血凝块的重量。首先，连接流动回路装置，并确保所有连接处均牢固。打开压力监测仪，确保进样口和出样口传感器的压力读数均为零毫米汞柱。打开水浴并调节温度至37摄氏度，以模拟人体生理温度。启动泵并调节至所需流速，检查是否存在任何泄漏，并确认压力传感器功能正常。关闭泵以利于血浆流动相和血凝块的加载。为测量先前制备的人全血凝块质量，将凝块轻轻在实验室擦拭纸上吸干，直至无明显液体渗出。将凝块浸入称重盘中血型匹配的拉血浆内。移除连接入口与出口传感器之间流环管路的中央部分，并将10毫升注射器连接至管路一端。通过管路的自由端，用少量血浆预充管路。确定血栓的头端和尾端后，将头端朝向入口压力传感器。将管路置于血栓的尾端，并用注射器将血栓抽吸入管路中。将管路连接到流动回路装置上，使血栓最靠近出口压力传感器，并将血栓头部朝外放置。为固定血栓位置，使用两根30号针头以交叉（X形）方式刺穿管路和血栓头部。将剩余的流动相溶液转移至一个50毫升离心管中作为储液罐。将储液罐放入水浴中，然后将进液管和出液管插入储液罐。打开荧光计，通过与仅流动相系统的基线进行比较，确认初始值是否合适。将500微升组织纤溶酶原激活物直接加入储液器中。启动泵并调节流速至160毫升每分钟。系统随后充满液体并产生气泡。气泡消失后，关闭光源并开始数据采集。持续记录直至血凝块显著降解。在血浆流动过程中，监测血凝块前后的系统压力，随着血凝块质量减少，这些压力将在血凝块消化过程中发生变化。凝块消化后，在泵仍在运行时降低流速，并移除进样管路，以将大部分液体推入储液器中。在出口压力传感器侧断开含有凝块的管路段，将其放入称量皿中。移除针头以收集剩余的液体和凝块碎片。称量剩余血凝块。样品之间，将温水加入储液罐，并以150 rpm运行系统2分钟。当日所有样品检测完毕后，取下并丢弃管路。用热水和毛刷彻底刷洗T型接头，直至清洁，然后将其晾干。用热水冲洗注射器减震器，并用70%乙醇擦拭，以保持无菌状态。

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微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

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