由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

引言。破骨细胞是一种多核细胞类型，常被用于骨病研究、癌症研究、组织工程和内假体研究等领域的科研工作中。然而，破骨细胞的分化具有挑战性，因为其前体细胞的融合是必要过程。此外，由人诱导多能干细胞（IPSCs）分化为破骨细胞需要在适当的时间使用多种生物因子。

在人类原代细胞中，CD34+外周血单个核细胞是目前最广泛用于分化为破骨细胞的细胞类型。然而，该方法受限于CD34+细胞群体内的异质性及其增殖能力有限。

人诱导多能干细胞（iPSCs）为破骨细胞提供了另一种来源。由于这类细胞可无限增殖，因而能够扩增并放大破骨细胞的生产规模。这使得大量破骨细胞的分化成为可能，从而促进破骨细胞相关研究的开展。

在此，我们的博士后 Alexander Blumke 和博士生 Jessica Simon 演示了如何从人诱导多能干细胞（iPSCs）中分化破骨细胞。开始传代 iPSCs 时，在体视显微镜下使用 P-10 或 P-20 移液器吸头或细胞刮刀去除已分化的区域或含有大量死亡 iPSC 团聚物的区域。已分化的区域会显得更致密，颜色更白。

用旧培养基冲洗松散的脱落细胞，然后用 PBS 洗去残留的脱落细胞，重复两次。接着，每孔加入 1 毫升含 5 单位/毫升分散酶的溶液。3 到 5 分钟后可在体视显微镜下观察到菌落边缘从培养皿上抬起的现象。

小心移除dispase，并加入1毫升含15毫摩尔HEPES的DMEM/F-12培养基。使用干细胞传代工具或一次性细胞刮刀将细胞团块切割成小块。用5毫升血清移液管或带宽口吸头的P-1000将含有细胞团块的培养基转移至15毫升锥形管中。

用DMEM/F-12冲洗孔板，并将培养基转移至15毫升离心管中。将切碎的iPSC聚集体在200 ×g下离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管吸除上清液，加入2毫升人iPSC无血清培养基，使用5毫升血清移液管或带宽口吸头的P-1000移液器吹打，使iPSC解离并重悬。

吸出预包被孔板中残留的基底膜提取物，向六孔板的每个孔中加入一毫升无血清人源iPSC培养基。使用P-1000加样枪配合宽口枪头，将iPSC转移至六孔板的新孔中，使每孔终体积为两毫升无血清人源iPSC培养基。根据不同的iPSC细胞系，需优化传代比例。

此处采用1:6的传代比例。在类胚体转移后，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布于板内。类胚体诱导。

吸弃iPSC培养物中的旧培养基，用DPBS冲洗孔板。向六孔板的每个孔中加入0.5 mL预热至室温的溶液，轻轻晃动培养容器，使溶液覆盖整个孔表面。将培养容器置于37°C孵育5至8分钟。

从培养箱中取出容器，吸除溶液，向孔中加入第一阶段培养基，该培养基包含每毫升50纳克人骨形态发生蛋白4（human bone morphogenic protein 4）、每毫升50纳克人血管内皮生长因子165（human vascular endothelial growth factor 165）、每毫升20纳克人干细胞因子（human stem cell factor）以及10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632。用第一阶段培养基冲洗孔内细胞，轻柔地使其脱离，然后将细胞吸入锥形管中。

向孔中加入新的第一阶段培养基，并使用细胞刮刀刮下任何残留的细胞。将所有细胞转移至离心管后，在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于总共2 mL预平衡的第一阶段培养基中。

使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞，将12,500个细胞接种至含有100微升第一阶段培养基的圆底超低吸附96孔板中，每孔接种12,500个细胞。在显微镜下观察，细胞将均匀分散于溶液中。将96孔板以100 ×g离心3分钟。离心后，在显微镜下观察，细胞应开始呈现类球状结构。

将培养板放入 37°C 培养箱中。在第一天和第二天使用第一阶段培养基更换一半的培养液。使用多通道移液器将旧培养基弃至培养皿中。

弃去96孔板中的培养基后，检查是否有胚胎小体（EB）被意外移除。使用P-1000移液器将意外移出的EB转移回培养皿中。进行造血分化时，预先在6孔板的各孔中加入3毫升第二阶段培养基，其中添加2毫摩尔谷氨酰胺（ultraglutamine）、55微摩尔β-巯基乙醇、25纳克/毫升人白细胞介素-3和100纳克/毫升人巨噬细胞集落刺激因子。

使用 P-1000 和宽口吸头，将八个拟胚体转移至六孔板的每个孔中。转移后，在体视显微镜下肉眼观察，确认每个孔中均有八个拟胚体。5 至 7 天后，应可见到悬浮的细胞群体，其主要成分为造血细胞。

造血分化周期可从7天开始进行调整。分化10天后，可观察到包含大量CD45+CD14+和CD11b+亚群的造血细胞群体。经过第二阶段培养基处理5天后，通过小心移除旧培养基并将其 dispensing 至50毫升锥形管中，进行换液操作。

立即向孔中加入一毫升新的第二阶段培养基。为了保留可能已存在的任何悬浮造血细胞，将含有旧培养基的离心管在300 ×g下离心五分钟。向离心管中加入新的第二阶段培养基，并重悬细胞，以使可能随旧培养基转移的细胞脱落。

将含有保存细胞的两毫升新鲜第二阶段培养基加入每个孔中，此前每个孔已预加有一毫升第二阶段培养基。在造血分化第10天，通过收集悬浮的造血细胞至50毫升锥形管中进行收获，这些细胞可使用含10% DMSO、50% FBS和40%培养基的冻存液冷冻保存，或立即用于进一步向破骨细胞分化。M-CSF成熟及破骨细胞分化。

以每平方厘米200,000个细胞的密度接种细胞，并用添加了10%胎牛血清（FBS）和50纳克/毫升M-CSF的α-MEM培养基处理三天。为了进行功能检测或成像，使用带宽口吸头的P-1000移液器冲洗，使M-CSF成熟后的细胞脱落。将含有脱落细胞的旧培养基转移至离心管中，在300 × g下离心五分钟。

用新鲜的α-MEM培养基重悬并溶解细胞沉淀，培养基中需添加10%胎牛血清（FBS）、50纳克/毫升M-CSF和80纳克/毫升RANK配体。将细胞以每平方厘米200,000个细胞的密度重新接种，并培养7至9天以诱导分化。多核破骨细胞通常在第5至7天出现。

代表性结果。可通过流式细胞术分析所获得的造血细胞群体的组成。此处，造血细胞显示出大量 CD45+ 前体细胞群体。

与同型对照相比，表达单核细胞标志物CD14和CD11b的细胞群体通常占整个细胞群体的三分之一。在显微镜下可观察到终末分化的诱导多能干细胞来源的破骨细胞为TRAP阳性的多核细胞。共聚焦显微镜显示细胞表达组织蛋白酶K。功能实验（如骨组织或矿物质吸收实验）可用于进一步定量分析破骨细胞的活性。

在此，成像前使用10%次氯酸钠去除成熟破骨细胞后，可见吸收陷窝；而仅用M-CSF诱导成熟的破骨前体细胞在未添加RANK配体的情况下则不显示吸收陷窝。结论：本方案可实现人源破骨细胞稳定且可靠的分化，有望为骨疾病或伴有异常钙化疾病的治疗提供即用型解决方案。我们进一步利用破骨细胞构建RANK细胞，该细胞含有可被二聚化化学诱导剂激活的胞内信号结构域，从而实现可控且不依赖骨保护素的破骨细胞激活。