Name: 破骨细胞与人诱导多能干细胞的分化和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解从人诱导多能干细胞分化破骨细胞的完整实验流程。本方法涵盖iPSC培养、胚状体诱导、造血分化和破骨细胞成熟等关键步骤，为骨疾病研究与组织工程提供可靠的细胞来源。

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作者感谢Giachelli实验室成员提供的技术支持与帮助。感谢W. M. Keck显微镜中心及该中心负责人Nathanial Peters博士在获取共聚焦显微镜和宽场显微镜图像方面提供的协助。同时感谢华盛顿大学流式细胞分析核心设施（UW Flow Core Facility）及该设施负责人Aurelio Silvestroni在技术方面提供的支持与帮助。最后，感谢Hannah Blümke在插图绘制与平面设计方面的支持。
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R35 HL139602-01。我们同时感谢 NIH S10 资助项目 S10 OD016240 对 W. M. Keck 中心仪器设备的资助，以及 NIH 资助项目 1S10OD024979-01A1 对华盛顿大学流式细胞分选核心设施（UW Flow Core Facility）仪器设备的资助。

注意：本方案中使用的所有试剂均可在材料表中找到。除非另有说明，所有培养基在使用前均预先平衡至 37 °C。所有离心步骤均在 37 °C 下进行，并采用最慢的加速度/减速度模式。除非另有说明，始终使用一次性巴斯德玻璃吸管移除上清液。
1. 人类iPSC的解冻与传代培养
<ol>
	<li>在解冻iPSCs的前一天，用1 mL基底膜提取物（浓度为200-300 µg/mL）包被6孔板中的一个孔，并将培养板置于4 °C过夜。</li>
	<li>次日，使用P1000移液器解冻并转移细胞至15 mL离心管中，逐滴加入5-7 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。</li>
	<li>以300 x g离心5分钟。轻柔地从离心机中取出细胞，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>使用巴斯德玻璃移液器小心吸除上清液，并用P1000加宽口吸头将细胞重悬于1 mL hiPSC无血清培养基（hiPSC-SFM，含10 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632）中。</li>
	<li>吸除前一天包被的孔中的基底膜提取物（步骤1.1），向孔中加入1 mL含10 µM Y-27632的hiPSC-SFM培养基，再将重悬的iPSCs加入孔中，使每孔终体积为2 mL。</li>
	<li>轻轻摇动培养板以均匀分布iPSC细胞团，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>每隔一天使用hiPSC-SFM（不添加ROCK抑制剂Y-27632）进行完全换液。iPSCs通常在传代培养3-4天后达到70-80%汇合度。</li>
</ol>
2. 传代iPSCs
<ol>
	<li>在传代诱导多能干细胞（iPSCs）前一天，使用浓度为200-300 µg/mL的基底膜提取物包被6孔板的孔。将6孔板置于4 °C过夜。
	 
	注意：确认细胞已达到约70-80%融合度。确保iPSCs不要过度融合（超过80%融合度），因为这会促进自发分化。</li>
	<li>开始传代iPSCs时，在体视显微镜下使用10 µL或20 µL移液枪头或细胞刮刀去除已分化的区域或含有大量死亡iPSC聚集体的区域。分化的区域颜色会显得更致密或更白。
	 
	注意：刮除的细胞聚集体可能仍部分附着在孔底。</li>
	<li>使用宽口P1000移液器多次冲洗孔底，以去除可能仍部分附着在孔底的任何聚集体。</li>
	<li>弃去含有脱落iPSC聚集体的旧培养基。再用磷酸盐缓冲液（PBS）重复洗涤步骤两次。</li>
	<li>接下来，每孔加入1 mL浓度为5 U/mL的分散酶（Dispase）。iPSC克隆边缘将在室温孵育3-5分钟后从孔板上翘起，可在体视显微镜下观察到。</li>
	<li>小心移除分散酶，避免使轻微脱离的聚集体脱落，并每孔加入1 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。使用一次性细胞刮刀将聚集体切割成较小的片段。使用干细胞传代工具可提高iPSC聚集体大小的一致性。</li>
	<li>用孔中的培养基冲洗切碎的iPSC聚集体，并使用5 mL血清移液管或带宽口枪头的P1000将含聚集体的培养基转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>用DMEM/F-12冲洗孔，并将冲洗液转移至含有iPSC聚集体的15 mL管中。</li>
	<li>将切碎的iPSC聚集体在200 x g下离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管吸除上清液，并使用5 mL血清移液管或带宽口枪头的P1000加入2 mL hiPSC-SFM培养基，以解离并重悬iPSCs。</li>
	<li>吸除预包被孔板中残留的基底膜提取物，并向6孔板的每个孔中加入1 mL hiPSC-SFM培养基。</li>
	<li>使用带宽口枪头的P1000将iPSCs转移至6孔板的新孔中，使每孔终体积为2 mL hiPSC-SFM。根据不同的iPSC细胞系，传代比例需优化。此处使用1:6的传代比例。</li>
	<li>在体视显微镜下检查孔中漂浮的聚集体及其大小。理想情况下，聚集体大小应在50-200 µm之间。</li>
	<li>在聚集体转移完成后轻轻摇动孔板，使细胞均匀分布，并在37 °C、5% CO2条件下培养至70-80%融合度。</li>
</ol>
3. 冻存iPSC细胞
<ol>
	<li>为将iPSC细胞冻存，按上述方法传代细胞（参见操作步骤&#34;2. iPSCs的传代&#34;）。在将细胞切割成克隆并从孔底冲洗下来后（步骤2.10），于200 × g 离心3分钟，沉淀切割后的细胞团块。吸除上清液。</li>
	<li>按每6孔板孔加入1 mL无血清冻存培养基的比例，将其加入15 mL离心管中，并使用带宽口吸头的P1000移液器重悬细胞团块。</li>
	<li>将细胞转移至预先标记的冻存管中。盖紧管盖，并将冻存管立即放入预冷至4 °C的冻存盒中。于-80 °C保存24–48小时。</li>
	<li>将冻存管转移至液氮中进行长期保存。 
	注：OC分化过程的示意图见图1。</li>
</ol>
4. 胚状体诱导
<ol>
	<li>按照上述方法培养并扩增足够的iPSCs用于拟胚体（EB）诱导。 
	注意：通过增加拟胚体数量可扩大破骨细胞（OC）的生产规模，从而整体提高造血细胞的产量。一个6孔板中70–80%汇合度的iPSC孔可获得约8.4 × 105个细胞。形成一个拟胚体需要12,500个单细胞iPSCs。</li>
	<li>吸除iPSC培养物中的废弃培养基，并用D-PBS冲洗iPSC集落。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入0.5 mL预热至室温的单细胞解离试剂，轻轻旋转培养容器使试剂均匀覆盖整个孔底表面。将培养容器置于37 °C孵育5–8分钟。</li>
	<li>从孵育箱中取出培养容器，吸除单细胞解离试剂，然后向每孔中加入1 mL第1阶段分化培养基，该培养基由hiPSC无血清培养基组成，其中包含50 ng/mL人骨形态发生蛋白4（hBMP4）、50 ng/mL人血管内皮生长因子-165（hVEGF）、20 ng/mL人干细胞因子（hSCF）和10 µM Y-27632。</li>
	<li>用第1阶段分化培养基轻轻冲洗孔壁以解离细胞，将解离后的iPSCs收集至15 mL锥形管中。</li>
	<li>向孔中再加入1 mL第1阶段分化培养基，冲洗残留细胞；对于难以冲洗下来的集落，可使用细胞刮铲刮下。</li>
	<li>将所有细胞转移至离心管后，在室温下以200 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。吸除上清液，使用5 mL血清移液管或带宽口吸头的P1000移液器，将细胞重悬于总共2 mL预平衡的第1阶段分化培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。向含有单细胞悬液的15 mL离心管中添加培养基，使最终浓度为每100 µL第1阶段分化培养基中接种12,500个细胞，接种于圆底超低吸附96孔板的每孔中。 
	注意：在显微镜下观察，细胞应呈单细胞悬液状态，均匀分散于孔内。</li>
	<li>将96孔板以100 x g离心3分钟。离心后，在显微镜下应可见细胞开始形成类球状结构。将板置于37 °C孵育箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第1天和第2天更换一半培养基，使用第1阶段分化培养基。为提高操作效率，可使用多通道移液器将每孔50 µL废弃的第1阶段分化培养基移至培养皿中弃去。</li>
	<li>从96孔板中移除培养基后，使用体视显微镜检查是否有拟胚体被意外移出。若发现被意外移出的拟胚体，使用带宽口吸头的P1000移液器将其转移回96孔板中。</li>
	<li>使用多通道移液器向圆底超低吸附96孔板的每孔中加入50 µL新鲜的第1阶段分化培养基。</li>
</ol>
5. 造血分化
<ol>
	<li>开始造血分化前一天，用1 mL基底膜提取物（浓度为200–300 µg/mL）包被6孔板中的一个孔，并将6孔板置于4 °C过夜。
	 
	注意：每个孔后续将加入8个EB。根据所准备的EB数量，相应地包被相应数量的孔。</li>
	<li>吸除多余的基底膜提取物，并向6孔板的每个孔中预先加入3 mL第2阶段分化培养基，该培养基由造血基础培养基添加2 mM Ultraglutamine、55 µM 2-巯基乙醇、25 ng/mL人白细胞介素3（hIL-3）和100 ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）组成。</li>
	<li>使用带宽口吸头的P1000移液器，将8个EB转移至6孔板的每个孔中。转移后，通过肉眼或体视显微镜确认每个孔中均有8个EB。
	 
	注意：1天后，悬浮的EB将贴附于孔底。在接下来的5–7天内，应可见到由造血细胞组成的悬浮细胞群。造血分化时间可调整，起始可为7天。分化10天后可观察到包含大量CD45+、CD14+和CD11b+亚群的造血细胞群体。</li>
	<li>使用第2阶段分化培养基处理5天后，通过移除旧培养基并将其转移至50 mL锥形管中进行换液。移液时应缓慢操作，尽量减少悬浮细胞的损失，并尽可能降低剪切力。在体视显微镜下进行移液有助于避免意外移除细胞。</li>
	<li>立即向每个孔中加入1 mL新鲜的第2阶段分化培养基。为了回收在此分化阶段可能已出现的悬浮造血细胞，请勿丢弃已移出的培养基。相反，将含有旧培养基的管子在300 x g下离心5分钟，然后吸除上清液。</li>
	<li>向该管中加入新鲜的第2阶段分化培养基，并重悬细胞，以使可能随旧培养基转移的细胞脱离。</li>
	<li>将含有回收细胞的2 mL新鲜第2阶段分化培养基加入每个孔中，这些孔此前已含有1 mL第2阶段分化培养基。</li>
	<li>在造血分化的第10天，检查是否存在大量悬浮的造血细胞。通过收集这些细胞至50 mL离心管中进行收获。这些细胞可立即用于向破骨细胞（OCs）分化，或使用含10% DMSO、50% FBS和40%培养基的冻存液冷冻保存。</li>
</ol>
6. M-CSF 成熟与破骨细胞分化
<ol>
	<li>以 200,000 个细胞/cm2 的浓度将细胞接种于经组织培养处理的孔板中，并使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 50 ng/mL 人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）的 α-MEM 培养基进行培养。</li>
	<li>为进行功能检测或成像，于接种后第 3 天用预热至 37 °C 的 PBS 通过 P1000 加样器配合宽口吸头轻轻洗涤，使经 M-CSF 成熟的细胞脱落。可能需要重复洗涤步骤以完全脱离细胞。</li>
	<li>使用 P1000 加样器配合宽口吸头将脱落的细胞转移至 15 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用破骨细胞（OC）分化培养基重悬并溶解细胞沉淀，该分化培养基为添加了 10% FBS、50 ng/mL hM-CSF 和 80 ng/mL 人核因子κB受体活化因子配体（hRANKL）的 α-MEM。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并以 200,000–250,000 个细胞/cm2 的密度将经 M-CSF 成熟的细胞重新接种至适合功能检测或成像的培养器皿中（例如骨吸收实验用板、成像用盖玻片等）。</li>
	<li>使用 OC 分化培养基继续培养 7–9 天，每 2–3 天更换一次新鲜的 OC 分化培养基。 
	注意：多核破骨细胞通常在培养 5–7 天后出现。</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案提供了一种可靠且稳健的方法，用于将iPSCs分化为OCs。然而，在整个分化过程中可能会遇到若干潜在问题。来源于不同组织来源细胞的人iPSC细胞系已成功通过本方案实现分化33。在冻存iPSCs时（见方案步骤&#34;3. 冻存iPSCs&#34;），传代时的一个孔细胞被冻存至一个冻存管中。在解冻时（见方案步骤&#34;1. 人iPSCs的解冻与扩增&#34;），一个冻存管的细胞被接种至6孔板中的单个孔内。不同的iPSC细胞系行为可能略有差异，其增殖速率也会有所不同，因此需要相应调整传代比例。
在传代诱导多能干细胞（iPSCs）或将iPSCs解离为单细胞悬液以进行拟胚体（EB）诱导时，去除自发分化的克隆或死亡细胞的聚集体至关重要，这有助于提高中胚层和造血分化的效率与效果。该操作可在体视显微镜下进行，使用细胞刮刀、P10或P20移液器枪头，或由巴斯德吸管自制的刮取工具完成35。
如上所述，本方案涉及将iPSC集落解离为单细胞悬液以诱导形成胚状体（EB），而其他方案则是将iPSC以细胞团聚体形式保留，并通过离心诱导EB形成36。已有报道指出，EB的大小、细胞数量、形状和形态均会影响其分化能力37,38,39。因此，我们推测将细胞解离为单细胞悬液有助于在离心后获得大小和形状更为均一的EB，从而实现更稳定的造血细胞生成结果31。
已有文献报道了其他用于拟胚体诱导的方法。据报道，将单细胞悬液与ROCK抑制剂联用以提高细胞存活率的方法在控制拟胚体大小和分化结果方面具有优势31。
本方案中所述的圆底96孔板EB诱导法适用于大规模生产胚状体（EB），并可实现成骨细胞（OC）生产的扩增。最近已有研究报道了一些无需胚状体诱导步骤的新型造血分化方法，这些方法有可能促进分化过程32。然而，这些方案尚未建立用于成骨细胞分化33。
在上述方案中，我们描述了造血分化第5天的换液操作。在分化第4至5天左右，可能已有少量悬浮细胞出现。为避免丢弃任何悬浮细胞，应先将培养基收集至离心管中，离心后再行弃去。随后必须用新鲜培养基重悬管底的细胞沉淀，并将其转移回6孔板的孔中。然而，早期悬浮细胞群体在OC分化中的意义仍有待明确。
可使用流式细胞术评估造血细胞的生成。对于破骨细胞分化而言，获得高产量的 CD45+、CD14+ 和 CD11b+ 细胞是理想的33。已有报道称，收获的悬浮造血细胞在冻存过程中具有挑战性，通常回收率有限且细胞活力较低40,41。通过将造血细胞冻存在由50%无血清造血细胞扩增培养基（见材料表）、40% FBS 和 10% DMSO 组成的冻存液中，我们在解冻后能够回收到细胞活力约为 90.3% ± 2.62 SD（n = 7）的细胞。
破骨细胞生成需要多个单核破骨细胞前体融合，形成具有矿质和骨吸收能力的多核破骨细胞。虽然小鼠破骨细胞前体细胞系仅需添加RANKL即可诱导破骨细胞形成42，人类前体细胞需要额外的M-CSF以维持细胞存活和增殖43OSCAR 最近被发现是参与破骨细胞分化的另一种受体，尽管迄今为止仅发现 I 型胶原是其配体。尽管利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的破骨细胞对 OSCAR 的研究仍然有限，但超生理条件下的研究 体外 小鼠细胞系中RANKL和M-CSF的浓度似乎可绕过对OSCAR激活的需求44，OSCAR的激活 体内 似乎是破骨细胞生成所必需的共刺激信号45还需要考虑的一个因素是培养板表面。化学46&#160;和物理的47 表面特性已知会影响破骨细胞的分化，可能促进或抑制其成功分化。前体细胞群体内的一定异质性似乎对破骨细胞的成功融合也至关重要，因为与融合相关的不同因子（如CD47和DC-STAMP）在破骨细胞融合的不同阶段发挥作用。48.
综上所述，该方案能够实现人iPSCs向OC的分化，从而促进并加速OC相关研究。

破骨细胞（OC）是一类来源于造血系统的1,2多功能细胞类型，广泛应用于骨病研究3,4、癌症研究5,6、组织工程7,8以及内假体研究9,10等领域。然而，OC的分化过程具有挑战性，因为单核前体细胞融合形成多核破骨细胞是获得功能性OC的必要步骤11。OC分化需要多种生物学因子参与，例如核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。已有研究报道，M-CSF对细胞增殖、细胞存活以及RANK表达具有促进作用12,13,14。另一方面，RANKL与RANK结合后可激活下游信号级联反应，从而诱导破骨细胞生成。该激活过程通过肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）介导，导致B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制蛋白α（IκB-α）降解，IκB-α是一种可结合NF-κB二聚体的抑制蛋白16,17。因此，IκB-α的降解释放出NF-κB二聚体，后者转入细胞核并诱导转录因子c-Fos和活化T细胞核因子1（NFATc1）的表达。这进一步触发了大量与OC分化相关蛋白的转录15,18。上调的蛋白如DC-Stamp和Atp6v0d2介导OC前体细胞之间的细胞融合，最终形成合胞体结构19,20,21。
在人类原代细胞中，CD34+ 和 CD14+ PBMC 是目前最广泛用于分化为成骨细胞（OCs）的细胞类型22。然而，该方法受限于供者来源细胞中 CD34+ 群体的异质性23以及其扩增能力有限。人诱导多能干细胞（iPSCs）为成骨细胞提供了另一种来源。由于 iPSCs 可无限增殖24，因此能够实现成骨细胞生产的扩增和规模化，从而支持大量成骨细胞的分化，推动成骨细胞相关研究的开展。
已有多种将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为成骨细胞（OCs）的实验方案发表25,26,27。整个分化过程可分为iPSC扩增阶段、中胚层及造血分化阶段，以及成骨细胞分化阶段。在分化前对iPSC进行扩增，有助于在分化开始前实现成骨细胞的大规模生产。目前存在多种中胚层和造血分化的策略。传统上采用拟胚体（embryoid body, EB）形成的方法来诱导造血细胞分化，但基于单层培养的方法是另一种无需诱导EB形成的造血分化策略。然而，基于单层培养的体系可能仍需进一步优化，因为包括我们在内的多项研究发现，基于EB的方法在成骨细胞分化过程中更为稳定可靠。
本文描述了利用基于拟胚体（EB）的方法将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为破骨细胞（OCs）的实验流程。该方案改编自 Rössler 等人26，并进行了优化以提高实验的稳定性，并允许在分化过程中进行冷冻保存。首先，在分化第10天时仅进行一次造血细胞的收集。随后将造血细胞冷冻保存，以增加分化过程中的操作灵活性。此外，我们将用于OC分化的造血细胞接种密度从1 × 105 提高至2 × 105 个细胞/cm2。实验中采用了较新的人iPSC无血清培养基（hiPSC-SFM，参见材料表），并且使用200–300 µg/mL的基底膜提取物（参见材料表）替代0.1%明胶进行培养孔包被。培养基中未添加青霉素/链霉素。
Rössler 等人26 的实验方案最初是从一种将诱导多能干细胞（iPSC）分化为巨噬细胞的方案28 改进而来的，该方案利用拟胚体（EB）形成来实现造血分化。尽管研究人员长期以来一直采用拟胚体形成方法进行造血分化29,30，但文献中已报道了多种诱导拟胚体形成的方法，包括自发聚集、在圆底孔板中离心、悬滴培养、生物反应器培养、锥形管培养、缓慢旋转侧向容器以及微模具凝胶培养31。本方案采用将解离后的 iPSC 在圆底孔板中离心，使单个 iPSC 相互靠近，从而促进球状体（EB）的形成，具体操作如下所述。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - 抗组织蛋白酶K&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - APC标记的抗人CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - APC标记的小鼠IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - BV711标记的抗人CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - BV711标记的小鼠IgG2b，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - 羊抗兔IgG H&amp;L Alexa Fluor&amp;reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE标记的抗人CD14</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE标记的抗人整合素α M/CD11b</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE-Cy7标记的抗人CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE-Cy7标记的小鼠IgG1 &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE/氰基5标记的抗人CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PE/氰基5标记的小鼠IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PerCP-Cy5.5标记的小鼠IgG1 &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - PerCP-Cy5.5标记的抗人CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>骨吸收检测试剂盒</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 自动细胞计数仪</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 干细胞认证低生长因子基底膜提取物</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3434-010-02</td><td>基底膜提取物</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase（5 U/mL）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>含15 mM HEPES的DMEM/F-12</td><td>Stem Cell</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>人骨形态发生蛋白4（hBMP4）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>人IL-3</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>人巨噬细胞集落刺激因子（hM-CSF）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>人可溶性核因子-&amp;kappa;B受体激活剂配体（hsRANKL）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>人干细胞因子（hSCF）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>人TruStain FcX（Fc受体阻断溶液）</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>人血管内皮生长因子-165（hVEGF165）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 罗丹明鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &amp;alpha;，含核苷，无酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>无血清冷冻保存培养基</td></tr><tr><td>mTeSR Plus 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>人诱导多能干细胞无血清培养基（hiPSC-SFM）</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96孔，Nunclon Sphera处理，U型底微孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>圆底超低吸附96孔板</td></tr><tr><td>P1000 宽口吸头</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂 Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>造血细胞培养基</td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（1X），无酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>12563011</td><td>单细胞解离试剂</td></tr><tr><td>Ultraglutamine</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>造血基础培养基</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 8孔高壁板</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

本方案详细描述了人诱导多能干细胞（iPSCs）的扩增与传代，以及其向破骨细胞的分化过程。首先，将iPSCs解离为单细胞悬液，用于后续的拟胚体诱导。经过中胚层诱导后，拟胚体进一步进行造血分化，产生悬浮的造血细胞群体。随后，收集的造血细胞经历巨噬细胞集落刺激因子介导的成熟阶段，最终分化为破骨细胞。破骨细胞分化完成后，通过TRAP染色结合甲基绿核染色对其进行鉴定。破骨细胞表现为多核、TRAP阳性的多核巨细胞。其鉴定结果可通过组织蛋白酶K（Cathepsin K）染色进一步验证。通过骨组织和矿物质吸收实验可实现功能表征，确认其为真正具有功能的破骨细胞。本方案展示了一种高效且灵活的方法，可用于从人iPSCs分化获得破骨细胞，并易于在需要大量功能性人破骨细胞的应用中推广。该方法在骨生物学研究、癌症研究、组织工程及内植入假体研究等领域具有广泛的应用前景。

在整个分化过程中监测细胞形态 
以下所述的所有结果均使用 MCND-TENS2 iPSC 细胞系进行视杯（OC）分化实验获得。该iPSC细胞系此前已在多项研究中使用32,33。尽管如此，其他iPSC细胞系也已成功应用于本分化方案。
常规的形态学观察显示，iPSCs在向OCs分化的过程中呈现出不同且明显的形态学特征（图2）。iPSC细胞集落（图2A）被解离为单细胞悬液，在离心前可见细胞均匀分散于圆底孔板中（图2B）。离心后（方案第4.9步），细胞将聚集于圆底超低吸附孔板的中央，并逐渐形成球状结构（类胚体，EBs，图2C）。在中胚层分化过程中，EBs的体积可增大至原来的2至3倍（图2D），并在为期4天的分化结束时肉眼清晰可见（图2E）。将EBs转移至6孔板中进行造血分化后（方案第5.3步），可见EBs贴附于孔板底部并发生融合（图2F）。培养7–8天后，大量悬浮的造血细胞在培养基中可见（图2G）。收集并重新接种造血细胞后，进入M-CSF成熟阶段，启动OC分化（方案第6.4步）。在随后的5–6天内，可首次观察到具有大而透明胞体的多核细胞（图2H），但此阶段仍可见大量单核细胞。再经过2–3天的OC分化，OCs将进一步与邻近细胞融合，形成含有更多细胞核的大型多核巨细胞（图2I）。
评估EB来源的造血细胞群体 
造血分化可进行不同时间长度的培养。文献中描述的时间范围从7天至9周不等。在本方案中，造血分化持续10天。我们发现，经过10天的造血分化后，早期CD34+细胞比例较低（0.53%，图3A），而中期阶段的CD43+造血祖细胞比例较高（48.5%，图3B）。更重要的是，在10天的培养后，能够产生足够数量的CD45+（96.2%，图3C）、CD14+（33%，图3D）和CD11b+（35.9%，图3E）造血祖细胞（HPCs），从而可进一步成功分化为破骨细胞（OCs）。然而，根据不同的iPSC细胞系，可能需要调整和优化造血分化过程中的细胞因子处理时间（方案中第5.4步），以获得足量的CD45+、CD14+和CD11b+细胞。
经过10天的分化后，每个含有8个拟胚体的孔平均收获600万个造血细胞。
评估破骨细胞的形态与活性 
破骨细胞（OC）分化完成后，可对其形态和功能进行评估。在M-CSF成熟步骤后，将OC前体细胞重新接种至培养皿载玻片或盖玻片上，以提高TRAP或组织蛋白酶K染色时的成像质量。OC分化后的酶联TRAP染色显示，存在体积较大、多核且TRAP阳性的破骨细胞（图4A）。此外，在多核破骨细胞之间还可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞。未添加RANKL的阴性对照组未出现融合的多核破骨细胞，但仍可观察到少量TRAP弱阳性的单核细胞（图4B）。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示了经组织蛋白酶K（青绿色）、F-肌动蛋白（红色）染色，并结合DAPI核染色（蓝色）的破骨细胞（图4C、4D）。根据本方案使用RANKL处理后，可见大型多核破骨细胞，表现出广泛的F-肌动蛋白细胞骨架结构，并对组织蛋白酶K呈阳性染色（图4C）。而未添加RANKL的阴性对照组则未见融合的多核细胞。
可通过检测破骨细胞的吸收活性进一步进行功能评估。可采用骨或矿物质吸收实验来测定其吸收活性。在此，将破骨细胞前体细胞接种于涂有磷酸钙的孔板中并诱导其终末分化。在呈蓝灰色的区域中，可见矿物涂层被大量吸收（图4E）。可观察到不同大小的吸收陷窝。未被吸收的残留磷酸钙涂层呈棕色。吸收陷窝的存在证实了所获得的多核细胞即为破骨细胞。此外，还可对吸收陷窝进行定量分析，以评估和比较其吸收活性。可通过计算被吸收的矿物总面积占整个孔板表面积的百分比来进行量化。此外，还可进一步量化吸收陷窝的大小和数量。未经处理的阴性对照组未出现吸收陷窝（图4F）。
<img alt="iPSC 分化示意图；造血细胞和破骨细胞发育的过程流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：人iPSCs向破骨细胞分化的示意图。 插图由Hannah Blümke使用Affinity Designer 2.1.1绘制，部分沿用了先前的绘图33。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养生长序列；显微镜图像显示细胞聚集阶段及形态变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：人iPSC向破骨细胞分化过程中各阶段的显微镜图像。（A）传代过程中未分化的iPSC集落。（B）iPSC经消化形成单细胞悬液后，置于圆底孔板中，离心前状态。（C）离心后，单细胞iPSC在孔底中央聚集。（D）在为期4天的中胚层分化期间，类胚体（EBs）体积逐渐增大。（E）中胚层分化完成后可见的类胚体。（F）将类胚体转移至包被有基底膜提取物的6孔板后，可见类胚体贴附并融合于孔底。（G）造血分化5-7天后，培养基中可见大量悬浮的造血细胞。（H）经M-CSF成熟培养后，在RANKL诱导分化5-7天后，首次出现含有3-4个细胞核的破骨细胞。（I）破骨细胞分化结束时，可观察到大型的多核细胞。比例尺：A、D、F、G = 200 µm，B、C、H、I = 50 µm，E = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图显示CD标志物（CD34、CD43、CD45、CD14、CD11b）的表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：利用流式细胞术分析类胚体来源的造血细胞表面标志物。 在圈选单细胞和活细胞后，通过标志物表达可对造血细胞进行分析并鉴定亚群。(A) 根据本实验方案，发育早期的CD34+造血祖细胞群体极小甚至缺失。(B) CD43+细胞约占总细胞群体的50%。(C) 发育较晚阶段的CD45+造血祖细胞构成了造血细胞群体的最主要部分，占96.2%。(D, E) 更为成熟的CD14+和CD11b+破骨细胞前体细胞分别占33%和36%。红色曲线：未染色阴性对照；蓝色曲线：同型对照；黄色曲线：用相应标志物抗体染色的细胞。图中数据采用先前发表的数据33。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RANKL M-CSF 处理显微镜观察；破骨细胞形成、荧光分析、细胞形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：iPSC 分化的人源破骨细胞的形态学与功能评估。（A）破骨细胞分化后的 TRAP 染色显示形成体积较大、多核且 TRAP 阳性的破骨细胞。在多核破骨细胞之间可观察到散在的弱 TRAP 阳性单核细胞。（B）未添加 RANKL 的阴性对照组进行 TRAP 染色后，未见融合形成的多核破骨细胞。然而，仍可见少量弱 TRAP 阳性的单核细胞。（C）在盖玻片上分化的造血细胞经共聚焦激光扫描显微镜观察，F-actin 染色为红色，组织蛋白酶 K（Cathepsin K）染色为青绿色，DAPI 核染色为蓝色，图像显示形成体积较大的多核且 Cathepsin K 阳性的破骨细胞。（D）未添加 RANKL 的阴性对照组与（B）类似，细胞密度较低，仅见单核细胞。（E）可通过评估破骨细胞的吸收活性进行功能分析。为此，将破骨细胞分化过程在骨或矿物吸收检测试剂板上进行。使用倒置宽场显微镜在相差模式下获取拼接图像，可见磷酸钙矿物层上存在较大的吸收区域。吸收活性可通过测量吸收面积占总面积的比例进一步量化。（F）未添加 RANKL 的阴性对照组未见吸收区域。比例尺：A、B = 100 µm，C、D = 50 µm，E、F = 1 mm。图像经由已发表数据编辑而来33。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。

本方案详细描述了人iPSC的扩增与传代，以及将其分化为破骨细胞的过程。首先，将iPSC解离为单个细胞……

引言。破骨细胞是一种多核细胞类型，常被用于骨病研究、癌症研究、组织工程和内假体研究等领域的科研工作中。然而，破骨细胞的分化具有挑战性，因为其前体细胞的融合是必要过程。此外，由人诱导多能干细胞（IPSCs）分化为破骨细胞需要在适当的时间使用多种生物因子。在人类原代细胞中，CD34+外周血单个核细胞是目前最广泛用于分化为破骨细胞的细胞类型。然而，该方法受限于CD34+细胞群体内的异质性及其增殖能力有限。人诱导多能干细胞（iPSCs）为破骨细胞提供了另一种来源。由于这类细胞可无限增殖，因而能够扩增并放大破骨细胞的生产规模。这使得大量破骨细胞的分化成为可能，从而促进破骨细胞相关研究的开展。在此，我们的博士后 Alexander Blumke 和博士生 Jessica Simon 演示了如何从人诱导多能干细胞（iPSCs）中分化破骨细胞。开始传代 iPSCs 时，在体视显微镜下使用 P-10 或 P-20 移液器吸头或细胞刮刀去除已分化的区域或含有大量死亡 iPSC 团聚物的区域。已分化的区域会显得更致密，颜色更白。用旧培养基冲洗松散的脱落细胞，然后用 PBS 洗去残留的脱落细胞，重复两次。接着，每孔加入 1 毫升含 5 单位/毫升分散酶的溶液。3 到 5 分钟后可在体视显微镜下观察到菌落边缘从培养皿上抬起的现象。小心移除dispase，并加入1毫升含15毫摩尔HEPES的DMEM/F-12培养基。使用干细胞传代工具或一次性细胞刮刀将细胞团块切割成小块。用5毫升血清移液管或带宽口吸头的P-1000将含有细胞团块的培养基转移至15毫升锥形管中。用DMEM/F-12冲洗孔板，并将培养基转移至15毫升离心管中。将切碎的iPSC聚集体在200 ×g下离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管吸除上清液，加入2毫升人iPSC无血清培养基，使用5毫升血清移液管或带宽口吸头的P-1000移液器吹打，使iPSC解离并重悬。吸出预包被孔板中残留的基底膜提取物，向六孔板的每个孔中加入一毫升无血清人源iPSC培养基。使用P-1000加样枪配合宽口枪头，将iPSC转移至六孔板的新孔中，使每孔终体积为两毫升无血清人源iPSC培养基。根据不同的iPSC细胞系，需优化传代比例。此处采用1:6的传代比例。在类胚体转移后，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布于板内。类胚体诱导。吸弃iPSC培养物中的旧培养基，用DPBS冲洗孔板。向六孔板的每个孔中加入0.5 mL预热至室温的溶液，轻轻晃动培养容器，使溶液覆盖整个孔表面。将培养容器置于37°C孵育5至8分钟。从培养箱中取出容器，吸除溶液，向孔中加入第一阶段培养基，该培养基包含每毫升50纳克人骨形态发生蛋白4（human bone morphogenic protein 4）、每毫升50纳克人血管内皮生长因子165（human vascular endothelial growth factor 165）、每毫升20纳克人干细胞因子（human stem cell factor）以及10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632。用第一阶段培养基冲洗孔内细胞，轻柔地使其脱离，然后将细胞吸入锥形管中。向孔中加入新的第一阶段培养基，并使用细胞刮刀刮下任何残留的细胞。将所有细胞转移至离心管后，在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞重悬于总共2 mL预平衡的第一阶段培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞，将12,500个细胞接种至含有100微升第一阶段培养基的圆底超低吸附96孔板中，每孔接种12,500个细胞。在显微镜下观察，细胞将均匀分散于溶液中。将96孔板以100 ×g离心3分钟。离心后，在显微镜下观察，细胞应开始呈现类球状结构。将培养板放入 37°C 培养箱中。在第一天和第二天使用第一阶段培养基更换一半的培养液。使用多通道移液器将旧培养基弃至培养皿中。弃去96孔板中的培养基后，检查是否有胚胎小体（EB）被意外移除。使用P-1000移液器将意外移出的EB转移回培养皿中。进行造血分化时，预先在6孔板的各孔中加入3毫升第二阶段培养基，其中添加2毫摩尔谷氨酰胺（ultraglutamine）、55微摩尔β-巯基乙醇、25纳克/毫升人白细胞介素-3和100纳克/毫升人巨噬细胞集落刺激因子。使用 P-1000 和宽口吸头，将八个拟胚体转移至六孔板的每个孔中。转移后，在体视显微镜下肉眼观察，确认每个孔中均有八个拟胚体。5 至 7 天后，应可见到悬浮的细胞群体，其主要成分为造血细胞。造血分化周期可从7天开始进行调整。分化10天后，可观察到包含大量CD45+CD14+和CD11b+亚群的造血细胞群体。经过第二阶段培养基处理5天后，通过小心移除旧培养基并将其 dispensing 至50毫升锥形管中，进行换液操作。立即向孔中加入一毫升新的第二阶段培养基。为了保留可能已存在的任何悬浮造血细胞，将含有旧培养基的离心管在300 ×g下离心五分钟。向离心管中加入新的第二阶段培养基，并重悬细胞，以使可能随旧培养基转移的细胞脱落。将含有保存细胞的两毫升新鲜第二阶段培养基加入每个孔中，此前每个孔已预加有一毫升第二阶段培养基。在造血分化第10天，通过收集悬浮的造血细胞至50毫升锥形管中进行收获，这些细胞可使用含10% DMSO、50% FBS和40%培养基的冻存液冷冻保存，或立即用于进一步向破骨细胞分化。M-CSF成熟及破骨细胞分化。以每平方厘米200,000个细胞的密度接种细胞，并用添加了10%胎牛血清（FBS）和50纳克/毫升M-CSF的α-MEM培养基处理三天。为了进行功能检测或成像，使用带宽口吸头的P-1000移液器冲洗，使M-CSF成熟后的细胞脱落。将含有脱落细胞的旧培养基转移至离心管中，在300 × g下离心五分钟。用新鲜的α-MEM培养基重悬并溶解细胞沉淀，培养基中需添加10%胎牛血清（FBS）、50纳克/毫升M-CSF和80纳克/毫升RANK配体。将细胞以每平方厘米200,000个细胞的密度重新接种，并培养7至9天以诱导分化。多核破骨细胞通常在第5至7天出现。代表性结果。可通过流式细胞术分析所获得的造血细胞群体的组成。此处，造血细胞显示出大量 CD45+ 前体细胞群体。与同型对照相比，表达单核细胞标志物CD14和CD11b的细胞群体通常占整个细胞群体的三分之一。在显微镜下可观察到终末分化的诱导多能干细胞来源的破骨细胞为TRAP阳性的多核细胞。共聚焦显微镜显示细胞表达组织蛋白酶K。功能实验（如骨组织或矿物质吸收实验）可用于进一步定量分析破骨细胞的活性。在此，成像前使用10%次氯酸钠去除成熟破骨细胞后，可见吸收陷窝；而仅用M-CSF诱导成熟的破骨前体细胞在未添加RANK配体的情况下则不显示吸收陷窝。结论：本方案可实现人源破骨细胞稳定且可靠的分化，有望为骨疾病或伴有异常钙化疾病的治疗提供即用型解决方案。我们进一步利用破骨细胞构建RANK细胞，该细胞含有可被二聚化化学诱导剂激活的胞内信号结构域，从而实现可控且不依赖骨保护素的破骨细胞激活。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

破骨细胞与人诱导多能干细胞的分化和表征

破骨细胞是体内主要的骨吸收细胞。能够大量分离破骨细胞，已显著推动了对破骨细胞生物学特性的理解。在本方案中，我们描述了一种分离、培养及定量破骨细胞活性的方法 体外.

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利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

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源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

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