Name: 使用基于链霉亲和素的生物膜干涉测量法分析 DNA-蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习使用基于链霉亲和素的生物膜干涉测量法分析DNA-蛋白质相互作用，实时监测复制蛋白A与单链DNA的结合亲和力。该方法为研究蛋白质动力学和基因组稳定性提供了简便高效的技术手段。

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本工作由美国国家科学基金会（1929346）和美国癌症协会（RSG-21-028-01）的资助项目支持。我们还要感谢 Balakrishnan 实验室成员提供的有益讨论。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 诱饵、分析物、缓冲液的制备及液滴支架的清洗
<ol>
	<li>仪器设置：在开始实验前至少1小时打开仪器，以便光源预热。</li>
	<li>洗脱缓冲液和清洗缓冲液的制备
	<ol>
		<li>洗脱缓冲液：配制50 mL 0.15 M磷酸溶液（pH 2.0）。</li>
		<li>清洗缓冲液：配制10 mL 0.5 N HCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BLI缓冲液的制备
	<ol>
		<li>配制50 mL 1× BLI缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.1 mg/mL BSA，1 mM DTT，0.05% Tween 20）。将该缓冲液储存于4 °C。在开始实验前，将其恢复至室温。 
		注意：强烈建议为实验新鲜配制缓冲液，因为存放过久的缓冲液可能发生pH变化或形成聚集体，并可能存在微生物污染，从而影响结果的可重复性和准确性。不建议使用储存超过两周的缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱饵/底物的制备
	<ol>
		<li>使用BLI缓冲液配制12.5 nM的3'Bio-ss-poly (dT)32底物（5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白浓度储备液的制备
	<ol>
		<li>使用BLI缓冲液配制四种浓度的RPA（5 nM、10 nM、20 nM、40 nM）。最高浓度蛋白（40 nM）通过将蛋白原液用BLI缓冲液稀释获得，后续浓度通过将40 nM工作液进行连续稀释制备。确保所有蛋白储备液在整个实验过程中保持在冰上，以维持其稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴液支架的清洗
	<ol>
		<li>加入4 µL去离子水，用无尘擦拭布清洁滴液支架（重复3次）。接着，用4 µL 70%乙醇重复此步骤，并用无尘擦拭布擦拭。此步骤可有效去除表面污染物和灰尘颗粒。</li>
		<li>加入4 µL 0.5 N HCl，静置1分钟，用无尘擦拭布擦拭，再重复一次。此步骤实现滴液支架的深度清洁，尤其适用于清除之前使用后残留的干涸液滴。</li>
		<li>重复步骤1，用去离子水和70%乙醇冲洗滴液支架，并用无尘擦拭布擦干。此时滴液支架已准备就绪，可供使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基本动力学
<ol>
	<li>仪器与软件的设置
	<ol>
		<li>打开软件，在左侧面板选择基本动力学（补充图1）。</li>
		<li>将生物传感器架从托盘中取出（购自商业来源），并在托盘中放置一块96孔板。向第一孔中加入200 µL BLI缓冲液。随后，将生物传感器架重新放回96孔板上方，确保每个生物传感器插入对应的孔中。此时第一个生物传感器应浸没在第一孔的BLI缓冲液中。</li>
		<li>在软件中点击水合，并将计时器设为10分钟，使单个生物传感器至少水合10分钟。此步骤使生物传感器充分水合，为BLI检测做好准备。</li>
		<li>在生物传感器水合过程中，用移液器将250 µL BLI缓冲液加入两个0.5 mL离心管中。将其中一个标记为&#34;A&#34;（结合）另一个标记为&#34;D&#34;（解离）。</li>
		<li>在软件中填写详细信息（名称：底物包被；检测描述：RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32：基本动力学）。</li>
		<li>调整每一步的运行参数：基线（30 s）、结合（120 s）、解离（120 s）（表1）。保持试管和液滴架的振荡器开启，振荡速度设为2200 rpm（范围：1000–2600 rpm），以防止因生物传感器表面附近扩散受限而引起的传质效应。 
		注：建议在建立结合动力学检测时优化每一步（基线、加载、结合、解离）的持续时间，以提高数据采集质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立基线曲线
	<ol>
		<li>将A管放入管架中，并将已水合的生物传感器连接至BLI系统。将管架滑至生物传感器下方（位置A，图2）。 
		注：实验过程中生物传感器绝不能完全干燥。若发生干燥，实验读数将显著偏移。</li>
		<li>点击运行，并按照提示信息中的说明操作。</li>
		<li>完成初始基线后，打开盖子，向液滴架中加入4 µL BLI缓冲液，然后将其滑至同一生物传感器下方（位置B，图2）。关闭盖子，并在软件中监测BLI曲线（图3，蓝色曲线）。</li>
		<li>完成后，打开盖子，将管'A'更换为'D'，并将其滑至生物传感器下方（位置A，图2）。关闭盖子，继续进行解离步骤。完成后打开盖子，取下生物传感器，放回托盘中，并确保其浸没在BLI缓冲液中。</li>
		<li>移除样品/缓冲液，用缓冲液清洗液滴架，再用无绒布擦干，并从管架中移除管'D'。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>底物包被
	<ol>
		<li>将A管放入管架中，并将已水合的生物传感器连接至BLI系统。将管架滑至生物传感器下方，点击运行。</li>
		<li>完成初始基线步骤后，向液滴架中加入4 µL 12.5 nM底物[3'Bio-ss-poly (dT)32]，并将其滑至生物传感器下方。关闭盖子，在软件中监测BLI曲线。确保该响应信号高于基线（图3）。 
		注：可通过使用不同浓度的底物（每个生物传感器仅使用一种浓度）进行包被并观察结合曲线来优化底物浓度。只要结合曲线信号明显高于基线，即可确认底物包被成功。过度包被可能导致表面空间位阻或拥挤效应。图3展示了生物素化3'Bio-ss-poly (dT)32底物五种浓度下的曲线。此外，在诱饵加载步骤完成后，可将生物传感器浸入链霉亲和素封闭缓冲液（生物胞素）中30秒，随后在BLI缓冲液中洗涤。这将封闭未结合的链霉亲和素表面，防止非特异性结合。</li>
		<li>完成结合步骤后，打开盖子，将管'A'更换为管'D'，将其滑至生物传感器下方并关闭盖子。</li>
		<li>解离步骤完成后，打开盖子，取下生物传感器，将其放回含有BLI缓冲液的生物传感器托盘中。确保生物传感器完全浸没在缓冲液中，并为后续步骤保持充分水合状态。用检测缓冲液清洗液滴架，用无绒布擦干，并从管架中移除管'D'。此时生物传感器已成功包被3'Bio-ss-poly (dT)32底物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质结合
	<ol>
		<li>用移液器将250 µL BLI缓冲液加入十个0.5 mL黑色微量离心管中。标记为A1至A5和D1至D5。</li>
		<li>在另一块96孔板中，向与已水合生物传感器位置对应的孔中加入200 µL洗脱缓冲液。</li>
		<li>开始检测前，用BLI缓冲液清洗液滴架3次。</li>
		<li>在软件中新建文件，并在左侧面板选择基本动力学。根据需要命名检测并添加描述（补充图2）。根据需要调整运行参数（表1）。</li>
		<li>将标记为A1的管放入管架中，并将包被有3'Bio-ss-poly (dT)32的生物传感器连接至BLI系统。将管滑至生物传感器下方，点击运行。</li>
		<li>完成初始基线步骤后，打开盖子，向液滴架中加入4 µL BLI缓冲液，并将其滑至生物传感器下方。此为0 nM蛋白浓度，作为参考曲线。</li>
		<li>完成结合步骤后，将A1管更换为D1管，并将其滑至生物传感器下方。</li>
		<li>解离步骤完成后，取下生物传感器并放回其托盘中。确保生物传感器完全浸没在缓冲液中，并为后续步骤保持充分水合状态。移除D1管，用检测缓冲液清洗液滴架，并用无绒布擦干。</li>
		<li>接下来获取5 nM RPA储备液的结合曲线。填写样品信息（浓度：5 nM，分子量：116 KDa），然后点击计算。系统将自动计算出蛋白浓度（µg/µL）。</li>
		<li>连接包被有3'Bio-ss-poly (dT)32的生物传感器，将A2管放入管架中。将其滑至生物传感器下方，点击运行。</li>
		<li>基线完成后，向液滴架中加入4 µL 5 nM RPA，滑至生物传感器下方。关闭盖子，监测结合曲线。当曲线高于基线时，可直观观察到蛋白质与诱饵的结合。结合步骤完成后，将A2更换为D2，滑至生物传感器下方，完成解离步骤。</li>
		<li>取下生物传感器，先在洗脱缓冲液中浸泡30秒，再在BLI缓冲液中浸泡3分钟。 
		注：再生效率取决于固定的诱饵和解离的分析物。某些固定的生物传感器可耐受十次或更多次再生循环。我们对生物素化的3'Bio-ss-poly (dT)32底物进行了超过三次的洗脱（补充图3），未观察到响应信号的明显变化。</li>
		<li>对RPA的其余三个浓度（10 nM、20 nM和40 nM）重复步骤2.4.9–2.4.12。每次更换浓度时务必对生物传感器进行洗脱。 
		注：对于BLI检测，专家建议使用四个浓度（不含参考曲线），浓度范围大致为预期KD值的0.1倍至10倍，以获得准确的动力学测量结果。此处的四个浓度通过连续稀释获得。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析与KD值计算
	<ol>
		<li>在计算KD值之前，需目视检查每种RPA浓度在3'Bio-ss-poly (dT)32底物上的传感图。确保BLI信号随RPA浓度增加而上升，直至固定化的DNA达到饱和（图4）。 
		注：为获得可靠结果，应确保至少有四种蛋白浓度成功结合到底物上（不包括0 nM分析物浓度）。如遇问题，请参阅讨论部分进行故障排查。</li>
		<li>在“运行列表”表格中，勾选0 nM分析物浓度对应的参考项，作为参考曲线。勾选所有分析物浓度对应的分析项。</li>
		<li>接下来，选择结合起始点和解离起始点进行步骤校正。这将使结合起始点与基线终点对齐，解离起始点与结合终点对齐，通常在液滴架与试管中的缓冲液匹配良好时由不同的反射模式引起。</li>
		<li>为此检测选择全局拟合（1:1）。全局分析可计算整组蛋白浓度的KD值，而局部分析仅适用于单一蛋白浓度。 
		注：仪器配套软件仅支持1:1拟合。当诱饵与分析物预期符合其他拟合模型时，这可能是一个潜在局限。该软件的数据可导出至其他绘图软件，并拟合至所需的模型。</li>
		<li>接下来，点击分析。系统将计算KD、ka/kd值（表2）。通常认为ka和kd的误差在数值的10%以内是可接受的。 
		注：确保这些值处于合理范围内。若误差小于10%，表明数据拟合可靠，适用于研究生物分子间的相互作用。此外，利用这些ka和kd值计算得到的KD（平衡解离常数）在大多数实际应用中已足够准确18。</li>
		<li>要导出拟合数据，右键点击由分析数据生成的图表，选择导出数据，然后选择文本/数据。点击文件和浏览，以“.dat”格式保存数据。该文件可在Microsoft Excel中打开，并用于其他软件进行图形绘制。 
		注：全局拟合考虑组内所有结合曲线数据，而局部拟合仅关注每个单独分析物浓度的动力学参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置仪器以运行高级动力学实验
<ol>
	<li>打开软件，然后在左侧面板上选择高级动力学（补充图1）。</li>
	<li>将一个96孔板放入承载生物传感器的托盘中。在五个孔中各加入200 µL BLI缓冲液。将生物传感器托盘放置在96孔板上，使五个生物传感器浸入含有缓冲液的孔中。</li>
	<li>在软件中点击水合，并将计时器设为10分钟，使单个生物传感器至少水合10分钟。</li>
	<li>在生物传感器水合的同时，用移液器将250 µL BLI缓冲液加入十个0.5 mL黑色离心管中。将其标记为A1至A5以及D1至D5。</li>
	<li>在软件中填写详细信息（名称：底物包被；实验描述：RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32：高级动力学）。</li>
	<li>输入每一步的持续时间（补充图4）。初始基线（30秒）、加载（120秒）、基线（30秒）、结合（120秒）、解离（120秒）。根据需要调整运行设置（表1）。
	<ol>
		<li>在软件中填写详细信息（浓度：0 nM，分子量：116 kDa），然后点击计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将A1管放入管架中并连接生物传感器。将管架滑至生物传感器下方，然后点击运行&#160;以获取初始基线。</li>
	<li>在液滴架中加入4 µL 12.5 nM底物，然后将其滑至生物传感器下方，关闭盖子。这将使底物加载到生物传感器上。将管架中的A1管更换为D1管，并将其滑至生物传感器下方。这将获得基线曲线。</li>
	<li>用无尘擦拭布清洁液滴架，然后加入4 µL BLI缓冲液。将其滑至生物传感器下方并关闭盖子。这将作为0 nM蛋白浓度，并作为参考曲线。</li>
	<li>完成结合步骤后，将D2管滑至生物传感器下方，进行解离步骤。让解离过程完成。</li>
	<li>取下生物传感器，从管架中取出D2管，并用无尘擦拭布清洁液滴架。</li>
	<li>输入下一次运行的详细信息（浓度：5 nM，分子量：116 kDa），然后点击计算。</li>
	<li>将第二个生物传感器连接到BLItz系统，将A2管放入管架中，然后将其滑至生物传感器下方。</li>
	<li>在建立初始基线后，向液滴架中加入4 µL 12.5 nM底物。将其滑至生物传感器下方并关闭盖子。将管架中的A2管更换为D3管，并将其滑至生物传感器下方。接着，在管架中加入4 µL 10 nM RPA储备液，并将其滑至生物传感器下方。</li>
	<li>结合完成后，将D4管滑至生物传感器下方进行解离。</li>
	<li>对后续三个RPA浓度（10 nM、20 nM、40 nM）重复步骤3.1.12–3.1.15。这些浓度的结合曲线如图5所示。</li>
	<li>数据分析和KD 值可按照与BLI基本动力学相同的流程进行拟合（步骤2.5，表2）。</li>
</ol>

Quantitative Analysis of RPA-ssDNA Binding Kinetics Using Label-Free Methods

作者声明无利益冲突。

利用生物层干涉技术（BLI）分析任何蛋白质与其底物结合动力学的能力，为分离和表征调控细胞内蛋白质-DNA相互作用的特定因素（如DNA的序列、结构或长度）提供了手段19。基于生物层干涉原理的Octet N1系统，可对蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用进行定量测定。此外，该方法还可用于测定脂质、抗体与小分子之间的相互作用42,43,44。尽管该系统使用起来相对简单直接，但在利用其测量结合动力学时仍需考虑一些细微之处。
本方案测定了蛋白质复合物RPA与单链DNA（ssDNA）结合动力学——这一相互作用在过去数十年中已被广泛研究。由于RPA具有多个DNA结合结构域，研究还聚焦于其在不同长度的单链DNA底物存在下，各个结构域的结合行为。模块化结合研究表明，RPA对8个核苷酸（nt）长度的单链DNA结合亲和力较低，而当与约28–30个核苷酸长度的单链DNA相互...

细胞蛋白质在调控生物体内复杂的生物学过程中发挥着关键作用。这些通路的正常功能依赖于细胞内蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，包括与伴侣蛋白质和核酸的相互作用1。因此，要理解细胞过程的复杂性，必须深入掌握蛋白质-核酸相互作用的动态特性。
传统上，蛋白质与核酸相互作用的研究通常采用电泳迁移率凝胶偏移分析法（EMSA）2。在该实验中，将蛋白质与合成的寡核苷酸（DNA或RNA，具有特定长度或序列）短暂孵育，随后在非变性聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶中进行电泳3,4,5。为了可视化蛋白质与寡核苷酸的相互作用，寡核苷酸通常被放射性同位素32P标记，或连接荧光分子。如果蛋白质与寡核苷酸发生相互作用并结合，则蛋白质的结合会减缓核酸在凝胶中的迁移速度6,7。因此，该方法也被称为凝胶偏移或凝胶阻滞实验。尽管该方法被广泛使用，但在利用其测定KD值时仍存在一些局限性，包括因结合较弱或动态结合导致的分辨率较低、需要较高浓度的蛋白质，以及操作较为繁琐。此外，EMSA并非实时检测方法，因此无法准确测量结合动力学参数7,8。
表面等离子体共振（SPR）和生物膜层干涉技术（BLI）等创新方法的出现克服了这些局限性9,10,11,12。这两种方法均可在无需标记的情况下，测量分子间的结合/解离速率常数及亲和常数。由于无需对蛋白质进行标记，这些技术避免了改变蛋白质性质或阻断结合位点的风险。在 SPR 技术中，偏振光与传感器（一种金属导电薄膜，通常为金）相互作用，产生一种称为等离子体的电子电荷密度波。该相互作用会减弱反射光束的强度，检测器可测量特定角度（即共振角）的变化13。为研究配体（核酸）与分析物（蛋白质）之间的相互作用，需将配体固定在传感器芯片的一个流动池中，并将分析物注入含有固定化配体的流动池。当分析物与配体结合时，传感器表面附近的折射率发生可检测的变化，从而实现对分子相互作用的测量14,15,16。
生物层干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）通过检测光穿过生物传感器尖端底部带有生物分子层的光纤时产生的光干涉图样来实现测量，该生物层由配体（诱饵）及其结合伙伴（分析物）组成。光在传感器尖端内传播，并因生物层的光学特性而在其上下界面发生反射。生物层的厚度与结合分子的数量成正比，进而影响反射光的干涉图样。通过比较相对光强曲线的变化 与由于参考界面和生物层/缓冲液界面反射光之间的干涉导致波长发生变化，因此可以确定生物层厚度的变化。当有更多分子结合时，波长偏移更大，这使得BLI成为实时研究生物分子相互作用的有力工具。干涉图样的变化被测量并以光谱偏移的形式呈现在传感器图中。17,18 (图1A）。通过使用适当的对照，例如缺少配体但含有结合伴侣不同浓度的设置，可以准确确定结合相互作用的性质。19,20,21与 SPR 相比，BLI 具有成本效益高和操作简便的优势，使其适用于广泛的科研人员。此外，若样品未发生降解或聚集，BLI 检测过程中所用的样品可保持完整，因此有可能被回收并重复使用，从而减少浪费。BLI 仪器无需使用微流控系统，避免了流体系统的诸多缺点，例如需要维护、管路堵塞或必须使用脱气缓冲液等问题。同时，该技术也降低了因使用未过滤或粗制蛋白样品而导致仪器污染的风险。
在BLI实验中，通过将诱饵分子固定在生物传感器上形成生物层。生物传感器的生物层可与多种标签相互作用，从而能够研究分子之间（包括核酸、蛋白质、抗体、病毒、小分子等）的相互作用22。可采用多种捕获策略建立这种固定化，包括生物素/链霉亲和素、6X-His标签/Ni-NTA、FLAG/抗-FLAG、GST/抗-GST以及抗体/抗-Fc等。选择生物传感器时，保持固定化配体的结构和活性至关重要。干涉图样的变化受结合分子的数量以及基质的影响23。蛋白质-核酸相互作用可通过生物素标记的寡核苷酸探针进行研究，该探针可固定在链霉亲和素包被的生物传感器上。预期与固定化诱饵（寡核苷酸）发生相互作用的蛋白质样品在结合缓冲液中与寡核苷酸接触一定时间以测量结合相，随后切换至空白结合缓冲液以测量解离相。分析物结合及其对应的结合曲线变化的示意图见图1B。此外，也可通过反向固定化途径研究蛋白质-核酸相互作用，即蛋白质（诱饵）被捕获在生物传感器上，并与核酸（分析物）相互作用。
目前，市面上有多种基于生物膜干涉技术原理的商用仪器。其中一种简单且经济高效的仪器称为Octet N1系统，该系统具有单通道数据通量，需手动操作，样品消耗量极低（4 µL），并在常温下进行样品分析9,23。该单通道仪器可检测分子量大于10 kDa的蛋白质的结合效率，测定亲和力的范围为微摩尔（µM）至纳摩尔（nM）11,12。此外，也有具备2、8、16和96通道的仪器，支持自动化数据读取，兼容96孔板和384孔板格式19,20。其中部分仪器可在4 °C至40 °C范围内运行，可检测分子量低至150 Da的生物分子，并测定毫摩尔至皮摩尔范围内的亲和力19,21。尽管上述系统成本较低，但价格较高的多通道仪器可实现高通量自动处理。这些先进系统通常被用于生物药物分子的表征与开发9,23。
本方案描述了使用单通道手动生物膜干涉系统测定复制蛋白A（RPA）与单链DNA（ss-DNA）结合参数的步骤。RPA是一种异源三聚体单链DNA结合蛋白复合物，在DNA复制、修复和重组等几乎所有DNA代谢过程中均发挥关键作用24由于其对单链DNA具有高亲和力（实测亲和力在亚纳摩尔范围内），RPA能够迅速结合在多种DNA代谢过程中产生的单链DNA，保护其免受核酸酶降解，并阻止下游其他蛋白的非特异性结合。RPA还在防止非经典二级和三级结构（如G-四链体）的形成中发挥关键作用。25人源RPA由三个亚基组成：RPA70（70 kDa）、RPA32（32 kDa）和RPA14（14 kDa），也分别称为RPA1、RPA2和RPA3。24,26,27这些亚基包含六个寡核苷酸/寡糖结合折叠结构域（OB折叠），分别标记为A至F。其中，DNA结合结构域（DBD）位于RPA1（DBD-A、DBD-B、DBD-C）和RPA2（DBD-D）亚基上。28最初认为，RPA会根据DNA长度的不同而表现出不同的结合模式，其中不同的DNA结合结构域（DBD）会与特定长度的DNA结合。29近期的结构研究和单分子研究表明，RPA 的不同 DNA 结合结构域（DBD）的结合比最初设想的更具动态性30,31,32,33,34,35,36这一动态结合特性对于RPA的功能至关重要，因为RPA在特定DNA反应过程中需要能够紧密地结合DNA底物；但在后续的生物学过程中，也必须能够从底物上解离，以便将底物传递给下一个蛋白质。利用不同的生物化学技术，可测定其KD RPA 的检测限已确定为约 0.4 nM（针对单链 poly(dT)）30 底物，以及 80 nM 和 200 nM 的 ss-(polydA)257 和 dG-(polydG)602 分别通过荧光偏振各向异性（FPA）测定底物37,38RPA 对富含嘧啶的序列的结合偏好性也比嘌呤序列高出约 50 倍。尽管不同的生物化学技术测得的 RPA 的 KD 值有所差异，但所有测量结果均处于纳摩尔（nanomolar）范围，表明 RPA 对单链 DNA 具有高结合亲和力。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究发现，根据 DNA 长度的不同，RPA 至少表现出两种结合模式：一种为快速解离（Kd，680 pM）和缓慢解离（Kd，60 pM）复合物33,39鉴于RPA几乎参与了所有DNA代谢通路的关键作用，研究者一直致力于开发能够抑制RPA与单链DNA（ssDNA）相互作用的抑制剂。这类小分子抑制剂在干扰DNA损伤应答过程中具有重要作用，可使癌细胞对临床上使用的DNA损伤类治疗药物更加敏感。利用BLI（生物层干涉技术）检测方法，可对抑制剂调控RPA结合功能的效力进行精确的定量评估。40,41.
BLI 实验设置包含两种不同的模式：基本动力学和高级动力学。在基本动力学模式下，实验包括三个主要阶段：基线建立、结合和解离。然而，在进行该实验之前，需要使用仪器或在实验台手动对生物传感器进行分别包被。相比之下，高级动力学模式在基本三步法的基础上进一步扩展，允许加入额外的实验步骤。这些附加步骤可用于多种目的，例如使生物传感器适应缓冲液的变化，或促进后续蛋白质相互作用的检测。高级动力学还允许通过有效的再生方法将分析物从生物传感器上剥离，从而实现生物传感器的潜在重复使用，前提是捕获分子（bait）和生物传感器本身保持完整。通常，当实验涉及多个步骤或需要以更复杂的格式进行时，会选择使用高级动力学而非基本动力学。
本方案概述了使用相同诱饵[3'Bio-ss-poly(dT)32]和分析物（RPA）的两种方法。将使用链霉亲和素包被的生物传感器固定诱饵，并测定分析物的KD值。本方案详细描述了利用单通道仪器进行生物层干涉技术（BLI）检测的完整流程，涵盖生物传感器-诱饵的制备、缓冲液的选择以及实验操作的逐步说明。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 微型离心管</td><td>Globe Scientific</td><td>111554A</td><td></td></tr><tr><td>96 孔标准黑色微孔板</td><td>Dot Scientific</td><td>4ti-0223</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 poly dT 寡核苷酸</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSD11000-10</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57020-500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtec Science Kimwipes&amp;nbsp;</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Octet N1 软件</td><td>Sartorius&amp;nbsp;</td><td>1.4.0.13</td><td></td></tr><tr><td>Octet SA 生物传感器&amp;nbsp;</td><td>Sartorius&amp;nbsp;</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (10x)</td><td>Gibco</td><td>1666711</td><td></td></tr><tr><td>Personal Assay Octet N1 系统</td><td>Sartorius&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸&amp;nbsp;</td><td>Ward's Science</td><td>470302-024</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020-5000</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Dot Scientific</td><td>DST60040-5000</td><td></td></tr><tr><td>Tween20&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析dna-蛋白质相互作用

Analyzing DNA-Protein Interactions with Streptavidin-Based Biolayer Interferometry

蛋白质与DNA的相互作用是多种基本细胞过程的基础。理解这些相互作用对于阐明各种生物学通路的分子机制至关重要。DNA分子的结构、序列和长度等关键因素可显著影响蛋白质的结合能力。生物膜干涉技术（BLI）是一种无标记技术，可测量分子间的结合动力学，为定量研究蛋白质-DNA相互作用提供了一种简便而精确的方法。与传统的基于凝胶的方法相比，BLI的主要优势在于能够实时获取结合动力学数据，从而准确测定动态蛋白质-DNA相互作用的平衡解离常数（KD）。本文介绍了一种基本实验方案，用于测定DNA复制蛋白——复制蛋白A（RPA）与单链DNA（ssDNA）底物之间相互作用的KD值。RPA对ssDNA具有高亲和力，但为了在生物通路中促进后续蛋白质的相互作用，它又必须能够被轻易置换。在所述的BLI实验中，将生物素标记的ssDNA固定在链霉亲和素包被的生物传感器上，随后检测RPA与传感器上结合的DNA之间的结合动力学（包括结合与解离过程）。利用系统软件对所得数据进行分析，以获得结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）以及平衡结合常数（KD）的精确数值。

在BLI中，白光从生物层/缓冲液界面和内部参考界面向光谱仪反射。记录由此产生的干涉图样，并在一段时间内测量光谱位移，以纳米（nm）为单位表示为结合曲线响应。下图展示了生物传感器探针在有无分析物结合情况下的示意图及其相应的光谱波长位移（nm）。 图1结合曲线对应于基线、诱饵分子固定、分析物结合以及随后的分析物解离过程，如图所示。 图2.
在本实验中，按照方案所述配制BLI动力学缓冲液，并用于制备3'Bio-ss-poly (dT)32 储液和RPA蛋白储液。建议在整个实验过程中所有稀释步骤均使用相同的缓冲液。链霉亲和素生物传感器在室温下用BLI动力学缓冲液水化后，包被3'Bio-ss-poly (dT)32 底物以进行基础动力学检测。为优化底物浓度，共评估了四个不同浓度，并设置阴性对照（0 nM）（图4）。0 nM底物的传感图将作为参考曲线。进行动力学实验时，建议...

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

蛋白质-DNA 相互作用是细胞基本生命活动的基础。深入理解这些相互作用对于阐明其分子机制至关重要。

生物分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，在生物化学研究中至关重要。本研究中，我们采用生物层干涉技术（BLI），这是一种高效分析此类相互作用的技术。我们以复制蛋白A及其对单链DNA的结合亲和力为例，展示BLI技术的原理与应用能力。生物膜干涉技术是一种简便且经济高效的研究蛋白质动力学的方法。该技术可对蛋白质相互作用进行快速的实时监测，并提供比其他方法更简单直接的操作流程。在本实验室中，我们研究翻译后修饰对维持基因组稳定性相关蛋白质的结构与功能的影响。这些修饰可能在复制和修复通路中引发级联效应。通过研究蛋白质相互作用，我们旨在揭示维持基因组完整性的潜在机制。首先，使用BLI缓冲液配制12.5纳摩尔的3′生物素标记单链poly(dT)32诱饵底物以及四种不同浓度的RPA。使用移液器，向两个0.5毫升的微量离心管中各加入250微升BLI缓冲液，并标记为AND。在另一个96孔板中，向其中一个孔加入200微升BLI缓冲液。将生物传感器托盘置于96孔板上，使其中一个生物传感器浸入BLI缓冲液中。在软件中，点击水合选项并将计时器设置为10分钟。为每一步的基线、结合和解离阶段调整运行参数。在软件中点击运行，并按照提示信息中的说明进行操作。将两个样品管放入管架中，并将水合后的生物传感器连接到BLI系统。将管架滑至生物传感器下方的A位置，监测生物传感器的基线信号。完成初始基线测定后，打开盖子，在液滴架中加入4 µL的BLI缓冲液。将液滴架向右滑动至位置B处的同一生物传感器下方。关闭盖子后，在软件中监测BLI曲线。然后打开盖子，将A管更换为D管。在关闭盖子前，将新管滑至位置A的生物传感器下方，并在界面中分析解离步骤。将A管放入试管架中。将水合后的生物传感器连接到BLI系统，并将管架滑至生物传感器下方，如前所示。然后在软件界面上点击运行以建立基线。随后，在液滴架中加入4 µL浓度为12.5 nM的单链DNA诱饵，将液滴架滑至生物传感器下方进行结合步骤，并在软件上监测BLI曲线。然后打开盖子，将试管 A 更换为试管 D。将试管 D 滑至生物传感器下方，继续进行解离步骤。解离步骤完成后，打开盖子并取下生物传感器。随后将生物传感器放入盛有 BLI 缓冲液的托盘中。使用移液器，向10个0.5毫升黑色微量离心管中各加入250微升BLI缓冲液。将这些离心管标记为A1至A5和D1至D5。在软件界面上填写实验细节，然后按下计算按钮以处理信息。在另一个96孔板中，使用移液器向与水合生物传感器位置相对应的孔中加入200微升洗脱缓冲液。将试管 A1 放入试管架后，将包被诱饵的生物传感器连接到 BLI 系统，并将试管移至生物传感器下方，然后点击软件上的“运行”按钮。初始基线步骤完成后，打开盖子，向液滴架中加入 4 µL BLI 缓冲液。将液滴架移至生物传感器下方，并在 BLI 界面上监测结合步骤。将A1管替换为D1管，将其滑至生物传感器下方并关闭盖子。随后在BLI界面上监测解离步骤。解离步骤完成后，打开盖子，取下生物传感器，并将其放回盛有BLI缓冲液的托盘中。然后将涂有诱饵的生物传感器固定，并将A2管放入试管架中。将试管滑至生物传感器下方，点击软件上的“运行”按钮。基线步骤结束后，在液滴架上加入四微升（4 µL）五纳摩尔（5 nM）的RPA。将液滴架滑至生物传感器下方并合上盖子。在软件界面上监测结合曲线。取出生物传感器并将其浸入洗脱缓冲液中30秒。然后将生物传感器浸入BLI缓冲液中三分钟。在标记为“运行列表”的表格中，勾选零纳摩尔分析物浓度对应的参考框，以作为参考曲线；对分析物的所有浓度，勾选“分析”框。在步骤校正中同时选择结合期开始和解离期开始，选择全局拟合（global fitting）进行检测分析。接下来，单击“分析”以处理数据。要导出拟合后的数据，可右键单击由分析数据生成的图表，选择“导出数据”，然后选择文本或数据，单击“文件”，再浏览并以 DAT 格式保存数据。打开软件，从左侧面板选择高级动力学（advanced kinetics）。将96孔板放入生物传感器托盘中，并向其中五个孔加入200微升BLI缓冲液，然后将生物传感器托盘插入板中以水化传感器。在生物传感器水化的同时，用移液器向10个0.5毫升黑色离心管中各加入250微升BLI缓冲液。在软件界面中填写实验参数，然后点击计算按钮以处理信息。将装有A1管的管架滑动至生物传感器下方后，点击运行以获取初始基线。向液滴架中加入4 µL的BLI缓冲液。将液滴架滑至生物传感器下方，盖上盖子，并在软件中监测加载过程的曲线。使用基础动力学进行RPA结合时，光谱位移显示出结合强度随浓度增加而增强，并在40纳摩尔时达到饱和。使用高级动力学进行RPA结合时，光谱位移同样显示出剂量依赖性结合，但每个浓度使用独立的生物传感器以提高准确性。

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使用基于链霉亲和素的生物膜干涉测量法分析 DNA-蛋白质相互作用

在本视频中，我们演示了生物层干涉技术（BLI），用于实时检测配体与目标分析物之间的分子间相互作用。BLI通过测量白光从生物传感器表面固定化配体层反射后产生的干涉图样变化，来监测溶液中分析物与配体相互作用时所引起的变化。...

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转录因子（TF）与RNA聚合酶的相互作用通常通过下拉实验进行研究。我们采用生物层干涉技术（BLI）来表征GrgA与衣原体RNA聚合酶之间的相互作用。与下拉实验相比，BLI能够检测实时的结合与解离过程，具有更高的灵敏度，并且定量能力更强。...

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通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。...

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

学习使用基于链霉亲和素的生物膜干涉测量法分析DNA-蛋白质相互作用，实时监测复制蛋白A与单链DNA的结合亲和力。该方法为研究蛋白质动力学和基因组稳定性提供了简便高效的技术手段。

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

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