利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用
2025年1月17日
本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。
生物分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，在生物化学研究中至关重要。本研究中，我们采用生物层干涉技术（BLI），这是一种高效分析此类相互作用的技术。我们以复制蛋白A及其对单链DNA的结合亲和力为例，展示BLI技术的原理与应用能力。
生物膜干涉技术是一种简便且经济高效的研究蛋白质动力学的方法。该技术可对蛋白质相互作用进行快速的实时监测，并提供比其他方法更简单直接的操作流程。在本实验室中，我们研究翻译后修饰对维持基因组稳定性相关蛋白质的结构与功能的影响。
这些修饰可能在复制和修复通路中引发级联效应。通过研究蛋白质相互作用，我们旨在揭示维持基因组完整性的潜在机制。首先，使用BLI缓冲液配制12.5纳摩尔的3′生物素标记单链poly(dT)32诱饵底物以及四种不同浓度的RPA。
使用移液器，向两个0.5毫升的微量离心管中各加入250微升BLI缓冲液，并标记为AND。在另一个96孔板中，向其中一个孔加入200微升BLI缓冲液。将生物传感器托盘置于96孔板上，使其中一个生物传感器浸入BLI缓冲液中。
在软件中，点击水合选项并将计时器设置为10分钟。为每一步的基线、结合和解离阶段调整运行参数。在软件中点击运行，并按照提示信息中的说明进行操作。
将两个样品管放入管架中，并将水合后的生物传感器连接到BLI系统。将管架滑至生物传感器下方的A位置，监测生物传感器的基线信号。完成初始基线测定后，打开盖子，在液滴架中加入4 µL的BLI缓冲液。
将液滴架向右滑动至位置B处的同一生物传感器下方。关闭盖子后，在软件中监测BLI曲线。然后打开盖子，将A管更换为D管。在关闭盖子前，将新管滑至位置A的生物传感器下方，并在界面中分析解离步骤。将A管放入试管架中。
将水合后的生物传感器连接到BLI系统，并将管架滑至生物传感器下方，如前所示。然后在软件界面上点击运行以建立基线。随后，在液滴架中加入4 µL浓度为12.5 nM的单链DNA诱饵，将液滴架滑至生物传感器下方进行结合步骤，并在软件上监测BLI曲线。
然后打开盖子，将试管 A 更换为试管 D。将试管 D 滑至生物传感器下方，继续进行解离步骤。解离步骤完成后，打开盖子并取下生物传感器。随后将生物传感器放入盛有 BLI 缓冲液的托盘中。
使用移液器，向10个0.5毫升黑色微量离心管中各加入250微升BLI缓冲液。将这些离心管标记为A1至A5和D1至D5。在软件界面上填写实验细节，然后按下计算按钮以处理信息。在另一个96孔板中，使用移液器向与水合生物传感器位置相对应的孔中加入200微升洗脱缓冲液。
将试管 A1 放入试管架后，将包被诱饵的生物传感器连接到 BLI 系统，并将试管移至生物传感器下方，然后点击软件上的“运行”按钮。初始基线步骤完成后，打开盖子，向液滴架中加入 4 µL BLI 缓冲液。将液滴架移至生物传感器下方，并在 BLI 界面上监测结合步骤。
将A1管替换为D1管，将其滑至生物传感器下方并关闭盖子。随后在BLI界面上监测解离步骤。解离步骤完成后，打开盖子，取下生物传感器，并将其放回盛有BLI缓冲液的托盘中。
然后将涂有诱饵的生物传感器固定，并将A2管放入试管架中。将试管滑至生物传感器下方，点击软件上的“运行”按钮。基线步骤结束后，在液滴架上加入四微升（4 µL）五纳摩尔（5 nM）的RPA。
将液滴架滑至生物传感器下方并合上盖子。在软件界面上监测结合曲线。取出生物传感器并将其浸入洗脱缓冲液中30秒。
然后将生物传感器浸入BLI缓冲液中三分钟。在标记为“运行列表”的表格中，勾选零纳摩尔分析物浓度对应的参考框，以作为参考曲线；对分析物的所有浓度，勾选“分析”框。在步骤校正中同时选择结合期开始和解离期开始，选择全局拟合（global fitting）进行检测分析。
接下来，单击“分析”以处理数据。要导出拟合后的数据，可右键单击由分析数据生成的图表，选择“导出数据”，然后选择文本或数据，单击“文件”，再浏览并以 DAT 格式保存数据。
打开软件，从左侧面板选择高级动力学（advanced kinetics）。将96孔板放入生物传感器托盘中，并向其中五个孔加入200微升BLI缓冲液，然后将生物传感器托盘插入板中以水化传感器。在生物传感器水化的同时，用移液器向10个0.5毫升黑色离心管中各加入250微升BLI缓冲液。
在软件界面中填写实验参数，然后点击计算按钮以处理信息。将装有A1管的管架滑动至生物传感器下方后，点击运行以获取初始基线。向液滴架中加入4 µL的BLI缓冲液。
将液滴架滑至生物传感器下方，盖上盖子，并在软件中监测加载过程的曲线。使用基础动力学进行RPA结合时，光谱位移显示出结合强度随浓度增加而增强，并在40纳摩尔时达到饱和。使用高级动力学进行RPA结合时，光谱位移同样显示出剂量依赖性结合，但每个浓度使用独立的生物传感器以提高准确性。
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概述
本文介绍了一种利用生物层干涉技术（BLI）研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。该方法突出了BLI在分析结合亲和力以及翻译后修饰对蛋白质功能影响方面的高效性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质-DNA 相互作用
- 结合动力学
背景
- 生物分子相互作用在生物化学研究中至关重要。
- BLI 是一种研究蛋白质动力学的经济有效方法。
- 该技术可实现对相互作用的实时监测。
- 翻译后修饰可能影响蛋白质的结构和功能。
研究目的
- 演示生物膜层干涉技术（BLI）的基本原理。
- 分析复制蛋白A与单链DNA之间的结合亲和力。
- 提供一种简便的工作流程用于研究蛋白质相互作用。
使用的方法
- 基于链霉亲和素的生物膜干涉系统。
- 基础与高级结合动力学分析。
- 蛋白质-DNA 相互作用的实时监测。
- 平衡结合亲和力（K D）的评估。
主要结果
- 成功示范了使用BLI研究DNA-蛋白质相互作用。
- 确定了复制蛋白A的结合亲和力。
- 揭示了翻译后修饰的影响。
- 验证了BLI作为蛋白质动力学分析的可靠方法。
结论
- BLI 是研究生物分子相互作用的有效工具。
- 该方法简化了结合动力学的分析。
- 理解蛋白质-DNA 相互作用对基因组稳定性研究至关重要。
常见问题
行业高层相关性
DNA-蛋白质相互作用的定量分析是早期药物发现中靶点验证和机制去风险化的基础。基于链霉亲和素的生物膜干涉技术（BLI）可实现结合动力学的实时、无标记检测，有助于提高通路解析和项目筛选的预测可靠性。精确获取动力学常数的能力，能够加速生物制药研发关键节点的决策进程。&D.
生物制药领域的战略应用&D
早期发现与靶点验证
- 能够对与通路功能相关的蛋白质-DNA 结合假说进行定量验证。
- 通过提供实时的结合与解离动力学数据，支持作用机制的风险评估。
- 通过精确测定 KD 值，促进功能靶点的验证。
- 提高在发现流程中推进靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的DNA-蛋白质结合实验。
- 提供可重复的定量动力学数据，用于实验标准化。
- 可在多种条件下快速、规模化地评估结合相互作用。
- 通过降低实验复杂性和变异性，支持对化合物进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过阐明蛋白质-DNA相互作用动态，将机制性研究结果与疾病相关通路关联起来。
- 支持生物标志物和通路研究，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过实现对分子相互作用的可靠、定量评估，降低转化风险。
流程与工作流整合
基于BLI的DNA-蛋白质相互作用分析可融入从早期假设验证到先导物发现及临床前验证的整个发现流程。
- 发现生物学：支持对蛋白质-DNA 结合及通路机制的假设驱动型研究。
- 筛选：提供标准化、定量的动力学数据，用于检测就绪性与可重复性。
- 分析：提供不同条件下的结合、解离和平衡常数，用于比较分析。
- 转化研究：将机制性见解与疾病相关系统及生物标志物策略相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于开展多样化的蛋白质-DNA 和蛋白质-蛋白质相互作用研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化、可重复且可扩展的动力学检测方法，简化工作流程。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合推进。
- 组合影响：支持对发现阶段资产进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备动力学检测实验设计和数据分析的专业知识。
- 需要具备BLI仪器设备及兼容分析软件的使用条件。
- 要求跨团队在检测方案和数据分析方面实现标准化。
- 针对不同的蛋白质或DNA底物及模型系统，可能需要进行方法优化和调整。
- 实验结果的可重复性依赖于生物传感器的质量以及缓冲体系的优化。
