Name: 通过单步法和半自动肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解利用肝素亲和层析技术纯化腺相关病毒载体的单步法方案。该方法可在六天内获得高纯度、高生物活性的重组AAV，为基因治疗临床前研究提供可扩展且经济高效的病毒制备策略。

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我们感谢科英布拉临床与生物医学研究所（iCBR）及科英布拉创新生物医学与生物技术中心（CIBB）的Mónica Zuzarte博士在rAAV的透射电子显微镜（TEM）分析方面提供的合作、见解和技术支持。我们感谢科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心（CNC-UC）及科英布拉大学跨学科研究中心（IIIUC）的Dominique Fernandes博士在原代神经元培养实验中提供的宝贵技术支持和专业指导。本研究所必需的pRV1、pH21和pFdelta6质粒由阿伯丁大学生命科学与医学学院医学科学系的Christina McClure博士慷慨提供，特此致谢。本研究由欧洲区域发展基金（ERDF）通过Centro 2020区域运营计划、通过COMPETE 2020——竞争力与国际化运营计划，以及葡萄牙国家基金通过FCT（科学技术基金会）资助，项目编号为：UIDB/04539/2020、UIDP/04539/2020、LA/P/0058/2020、ViraVector（CENTRO-01-0145-FEDER-022095）、Imagene（PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807）、ReSet - IDT-COP（CENTRO-01-0247-FEDER-070162）、Fighting Sars-CoV-2（CENTRO-01-01D2-FEDER-000002）、BDforMJD（CENTRO-01-0145-FEDER-181240）、ModelPolyQ2.0（CENTRO-01-0145-FEDER-181258）、MJDEDIT（CENTRO-01-0145-FEDER-181266）；同时获得美国-葡萄牙生物医学研究基金（APBRF）和Richard Chin与Lily Lock Machado-Joseph病研究基金、ARDAT在欧盟与EFPIA支持下的IMI2联合承诺第945473号资助协议，以及由欧洲联盟“地平线欧洲”计划支持的GeneT-Teaming项目101059981的资助。M.M.L. 受资助于2021.05776.BD；C.H. 受资助于2021.06939.BD；A.C.S. 受资助于2020.07721.BD；D.D.L. 受资助于2020.09668.BD。图1使用BioRender.com制作。

Purification of AAV Vectors by Single-Step Heparin Affinity Chromatography

作者声明无利益冲突。

腺相关病毒（AAV）载体工具箱的迅速扩展，已成为通过不同给药途径向多种细胞类型递送基因的最有前景的基因传递系统之一。在本研究中，我们旨在开发一种改进的嵌合rAAV载体的制备、纯化与表征方案，以验证其在临床前研究中的应用价值。本文以rAAV1/2和rAAV2/9嵌合载体的制备为例进行描述，但该方法同样适用于标准rAAV2载体的纯化（数据未展示）。
采用PEI作为转染试剂，通过优化的转染方法制备嵌合型rAAV。选择瞬时转染方法是因为其具有更高的灵活性和更快的速度，这在临床前研究的早期阶段具有显著优势。一旦特定的转基因和血清型得到验证，可通过建立稳定转染的细胞系来优化生产系统，从而提高可扩展性和成本效益；该细胞系可表达特定Rep/Cap基因的一部分，其余基因则通过感染过程提供24。与磷酸钙转染法相比，PEI具有多项优势：它是一种稳定且成本较低的转染试剂，可在更宽的pH范围内有效发挥作用；此外，转染后无需更换细胞培养基，从而显著降低了成本和工作量69。
为了克服CsCl或碘克沙醇梯度离心法带来的一些局限性，本研究采用亲和层析法收获并纯化所产生的重组腺相关病毒（rAAV）。该策略提供了一种简化且可放大的纯化方法，无需超速离心和梯度制备，即可获得高纯度和高滴度的病毒。事实上，使用FPLC系统的层析技术可通过在更高柱床的层析柱中装填更多树脂体积来实现自动化和放大。本文所述方案可轻松适配5 mL HiTrap Heparin HP层析柱（数据未显示）。此外，肝素层析柱可多次重复使用，从而提高了该方法的成本效益。
随后，对纯化的重组腺相关病毒（rAAV）在滴度、纯度、形态特征及生物学活性方面进行了表征。有趣的是，在考马斯亮蓝染色中，除三种典型的病毒衣壳蛋白外，在F8至F16组分中还检测到一条约17 kDa的条带。然而，该条带在rAAV浓缩步骤后不再存在。此外，在B1和A69标记后，还可检测到一些分子量低于VP3（&#60;62 kDa）的微弱条带，提示这些可能是VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的片段70。另一种可能是，这些实际上是其他共纯化的蛋白质，例如铁蛋白或某些细胞蛋白，其多肽具有与AAV衣壳蛋白相似的蛋白指纹图谱，并可能参与AAV的生物学过程，正如先前研究所提示的那样26,71,72。
透射电子显微镜（TEM）和强度分析也揭示了不同生产批次中存在不同程度的空颗粒。类似地，先前其他研究报道，通过转染或感染方法制备的重组腺相关病毒（rAAV）会产生可变且较高水平（&#62;65%）的空衣壳24,73。rAAV生成的机制始于新合成的VP蛋白快速形成空衣壳，随后由Rep蛋白介导，将基因组缓慢地包装进预先形成的衣壳中，这一过程为速率限制步骤74,75。因此，在rAAV的生产过程中会生成空衣壳，尽管空衣壳与完整衣壳的比例可能因目的转基因的大小和序列以及细胞培养条件的不同而有所变化58,73。空衣壳引发了一些关注，因为它们缺乏目标基因组，无法产生治疗效果，还可能潜在地增强先天性或适应性免疫反应。然而，也有研究报道，通过调节其比例，空的AAV衣壳可作为针对AAV特异性中和抗体的高效诱饵，从而提高转导效率60,76,77。如果空衣壳的存在具有严重不利影响，并且考虑到空颗粒相较于完整载体略低的阴离子特性，一种可能的解决方案是采用阴离子交换色谱技术进行第二步精细纯化64。
本研究还提供了有力证据，表明所生成的嵌合型rAAV能够高效转导不仅 体外 神经元培养物，以及通过颅内注射rAAV1/2后中枢神经系统（CNS）的转导。总体而言，这些结果表明，所描述的生产与纯化方案可在6天内获得高纯度且具有生物活性的rAAV，是一种适用于临床前研究中rAAV制备的通用且经济高效的方法。

腺相关病毒（AAV）载体正成为当前基因治疗研究中最具有前景的递送系统之一。AAV最初于1965年被发现1，是一种小型无包膜病毒，具有直径约25 nm的二十面体蛋白衣壳，携带单链DNA基因组。由于AAV在完成其裂解周期时独特地依赖于辅助病毒（如单纯疱疹病毒，更常见的是腺病毒）的共感染，因此被归类于细小病毒科（Parvoviridae）的依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）2,3。
腺相关病毒（AAV）的基因组大小为4.7 kb，包含两个开放阅读框（ORF），两侧为两个反向末端重复序列（ITR），这些ITR可形成特征性的T形发夹结构末端4。ITR是AAV包装、复制和整合过程中唯一关键的cis作用元件，因此也是重组腺相关病毒（rAAV）载体中唯一保留的AAV序列。在此系统中，病毒载体生产所需的基因由trans方式单独提供，从而使目的基因能够被包装至病毒衣壳内5,6。
每个病毒基因通过选择性剪接和不同的起始密码子编码多种蛋白质。在Rep开放阅读框（ORF）内，编码四种非结构蛋白（Rep40、Rep52、Rep68和Rep78），这些蛋白在病毒DNA的复制、位点特异性整合以及衣壳化过程中发挥关键作用7,8。在Cap开放阅读框中，作为模板表达三种N末端不同的结构蛋白（VP1、VP2和VP3），它们以1:1:10的比例组装形成由60个亚基组成的病毒衣壳4,9。此外，在Cap基因内部存在一个使用非常规CUG起始密码子的重叠开放阅读框，编码一种组装激活蛋白（AAP）。研究表明，这种核蛋白可与新合成的衣壳蛋白VP1-3相互作用，并促进衣壳的组装10,11。
衣壳蛋白氨基酸序列的差异导致了11种天然存在的AAV血清型以及从人类和非人灵长类动物组织中分离出的100多种变体7,12,13。结构可变区域构象的差异决定了不同毒株衣壳的独特抗原特性和受体结合特异性，从而导致在不同哺乳动物器官中表现出不同的组织嗜性和转导效率14。
早期的rAAV生产方法依赖腺病毒感染提供辅助功能15,16,17,18,19。尽管该方法效率较高且通常易于大规模生产，但由此引发多个问题。即使经过纯化及加热变性灭活步骤后，腺病毒颗粒仍可能残留在AAV制剂中，构成不必要的安全隐患20。此外，变性的腺病毒蛋白残留对于临床应用而言是不可接受的。其他生产策略则利用经基因工程改造的重组单纯疱疹病毒株，将Rep/Cap和目的基因导入靶细胞21，或采用杆状病毒-昆虫细胞系统22。尽管这些系统在可扩展性和符合GMP要求方面具有优势，但仍面临类似的问题。
为生产重组腺相关病毒（rAAV），三质粒共转染方法已被广泛采用，以简便地克服上述问题。简而言之，rAAV的组装依赖于将三种质粒瞬时转染至细胞中，这三种质粒分别编码：1）位于野生型AAV2基因组ITR之间的目的基因表达盒（pITR）；2）病毒复制和衣壳组装所必需的Rep/Cap序列（pAAV-RC）；以及3）发挥辅助作用所需的最低限度的腺病毒蛋白（E1A、E1B、E4和E2A）以及腺病毒相关RNA（pHelper）6,20,23。尽管质粒转染方法在临床前研究中为rAAV的生产提供了简便性和灵活性，但当应用于大规模生产时，这些方法在可扩展性和可重复性方面存在局限性。作为替代方案，可通过使用AAV生产细胞系（包括贴壁和悬浮生长细胞系）来实现rAAV的生产，这些细胞系稳定表达AAV的Rep/Cap基因，或同时稳定表达Rep/Cap与载体构建体。在这些系统中，腺病毒辅助基因仍通过质粒转染方式导入。尽管该策略提高了细胞培养过程的可扩展性，但其技术操作复杂且耗时较长21,24,25。
在任一情况下，随后裂解生产细胞，并进行一步或多步纯化。目前，纯化重组腺相关病毒（rAAV）的主要方法包括使用氯化铯（CsCl）或碘克沙醇进行超高速密度梯度离心，随后可选择性地结合或不结合层析技术。26最初的病毒沉淀纯化方案采用硫酸铵沉淀，随后通过氯化铯密度梯度进行两到三轮超速离心。该方法的主要优势在于能够纯化所有血清型，并可根据完整病毒颗粒与空壳衣壳的密度差异实现其物理分离。然而，该方法操作繁琐、耗时较长，且可扩展性有限，常导致产率较低和样品质量不佳。27,28,29,30此外，通常需要在生理缓冲液中进行透析 体内 由于氯化铯对哺乳动物可能产生的毒性作用，相关研究受到限制。
碘克沙醇也被用作纯化重组腺相关病毒（rAAV）载体的等渗梯度介质，相较于氯化铯，在安全性和载体活性方面均具有优势。然而，与氯化铯法类似，碘克沙醇法在细胞裂解物上样容量方面仍存在一些局限性（从而影响rAAV纯化的可扩展性），且该方法仍耗时较长、成本较高30,31。
为了克服这些限制，研究人员将注意力转向了色谱技术。在这方面，已开发出多种纯化方法，这些方法结合了亲和层析、疏水相互作用层析或离子交换层析技术。这些方法依赖于特定血清型的生化特性，包括其天然受体或病毒颗粒的电荷特征32。例如，研究发现AAV2、AAV3、AAV6和AAV13优先结合肝素硫酸蛋白聚糖（HSPG），这使得使用结构相近的肝素进行亲和层析纯化成为可能。然而，不同血清型与HSPG的结合位点可能存在差异，从而以不同方式介导AAV与靶细胞的附着和感染2,33,34,35,36。另一方面，AAV1、AAV5和AAV6结合N-连接的唾液酸（SA），而AAV4则利用O-连接的SA2,14,34。基于相同的原理，已开发出一种基于黏蛋白的单步亲和层析方案用于纯化rAAV5，黏蛋白是一种富含SA的哺乳动物蛋白37。与基于肝素的技术类似，该纯化方法也依赖于所生成的特定血清型。除了肝素和黏蛋白外，其他配体也被探索用于亲和层析，例如A20单克隆抗体和骆驼科单域抗体（AVB Sepharose和POROS CaptureSelect）22,23,38,39,40,41。其他改进现有纯化方法的创新策略包括对rAAV衣壳进行小幅度修饰，以展示特定的结合表位。例如，带有六组氨酸标签或生物素化的rAAV可通过靶向这些表位的配体（分别为镍-亚氨二乙酸树脂和亲和素树脂）进行纯化42,43,44。
为了拓展重组腺相关病毒（rAAV）所需的特性，研究人员通过混合不同血清型的衣壳对病毒颗粒进行了“交叉包被”。该方法在病毒制备过程中以等摩尔或不同比例提供两种不同AAV血清型的衣壳基因，从而产生由不同血清型衣壳亚基混合组成的衣壳结构34,45,46,47,48,49,50。先前的研究提供了物理证据，表明以1:1比例共表达AAV2与AAV1，或AAV2与AAV9的衣壳蛋白，可分别生成嵌合型rAAV1/2和rAAV2/9载体45,46,48。生成嵌合型rAAV的主要优势在于能够整合不同AAV血清型的有利特性，从而在转导效率和嗜性方面实现协同提升，同时保留rAAV生产过程中其他有益的特性。有趣的是，某些嵌合变体甚至表现出与任一亲本病毒不同的新特性46,47,49。利用AAV2结合肝素的能力，可通过将AAV2与通过定向进化和/或理性设计获得的其他天然或新型AAV衣壳混合，从而生成并纯化嵌合型rAAV载体。然而，先前的研究强调了在组装嵌合载体时衣壳亚基相容性的重要性。例如，Rabinowitz及其同事证明，尽管AAV1、AAV2和AAV3的转衣壳化可有效共组装形成嵌合衣壳，但这些血清型与AAV4交叉包被时却阻碍了稳定病毒颗粒的生成34,45,47。此外，AAV1、AAV2和AAV3与AAV5的相容性较低，因为在不同比例混合这些衣壳时获得的病毒滴度显著降低。有趣的是，嵌合型rAAV2/5表现出减弱的肝素结合能力，但仍保留了与亲本AAV5相似的黏蛋白结合能力；而以3:1比例构建的rAAV3/5则保留了对肝素和黏蛋白的双重结合能力。总体而言，通过深入理解衣壳组装机制及受体相互作用，有望设计出具有增强转导能力、特异性嗜性或低免疫原性的新型嵌合rAAV，但特定组合仍需系统研究与优化。
在本研究中，我们描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法生产与纯化重组腺相关病毒（rAAV）的逐步实验方案。rAAVs通过瞬时转染法产生，并采用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统进行纯化。在浓缩选定的纯化组分后，对所得病毒原液进行滴度、纯度、内在物理特性及生物学活性的表征。 体外 和 体内作为概念验证，我们展示了该方案在生成嵌合型rAAV1/2和rAAV2/9载体中的改进之处与适用性。每种血清型的选择基于其截然不同的嗜性，这些特性可能同样赋予嵌合型载体独特的性质。腺相关病毒血清型1（AAV1）对中枢神经系统（CNS）具有总体中等程度的嗜性，能够转导神经元以及一定程度上的胶质细胞，并可在轴突中进行顺向和逆向运输。 体内2,7,8此外，选择腺相关病毒血清型9（AAV serotype 9）是因其具有天然穿越血脑屏障并靶向新生及成年小鼠中枢神经系统的能力51,52最后，选择了AAV2血清型，因其能够与肝素结合，从而实现亲和层析。33纯化的rAAV1/2和rAAV2/9颗粒结合了两种亲本AAV血清型的特性，因此是中枢神经系统转导的合适载体45,46,48,49.

<table><tbody><tr><td>10% 聚维酮碘</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11889684</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>96孔Stunner板</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2025</td><td>用于rAAV样品连续紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的96孔定量板</td></tr><tr><td>AAVpro 滴定试剂盒（用于实时 PCR）Ver.2</td><td>Takara</td><td>6233</td><td>用于通过RT-qPCR测定AAV滴度。该试剂盒包含DNase I、裂解缓冲液、稀释缓冲液、阳性对照、Taq II mix、上游引物、下游引物和水</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0360/PB17</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA pure 25</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>由 UNICORN 软件（版本 6.3）控制的 FPLC 系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>31328</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultra-0.5 离心滤过装置</td><td>默克密理博</td><td>UFC5100</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultra-15 离心滤过装置</td><td>默克密理博</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>默克密理博</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>184-5096</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touch 成像系统</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>鸡多克隆抗GFP一抗</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G250</td><td>Fisher Chemical</td><td>C/P541/46</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP17225</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>用于蛋白质印迹的 ECF 底物</td><td>Cytiva</td><td>RPN5785</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest SmaI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD0663</td><td></td></tr><tr><td>FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin</td><td>FEI</td><td>Biotwin</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>200目Formvar-碳膜载网</td><td>&amp;nbsp;TAAB 实验室设备</td><td>F077/025</td><td></td></tr><tr><td>气体抽排装置</td><td>真实世界数据</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10021083</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡多克隆抗体，Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 针头 30G，小柄 RN 针，25 mm，PST3</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器（10 &amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL</td><td>Cytiva</td><td>17040701</td><td>预装肝素柱</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17040601</td><td>预装肝素柱</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 膜</td><td>默克密理博</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>布劳恩</td><td>469860</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮&amp;nbsp;</td><td>德克拉制药公司</td><td>N/A</td><td>Nimatek</td></tr><tr><td>低吸附微量离心管（2 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11906965</td><td></td></tr><tr><td>疯子 &amp;amp; Stunner 客户端软件</td><td>Unchained Labs</td><td>N/A</td><td>客户端分析软件版本 8.0.1.235。用于对重组腺相关病毒（rAAV）样本进行连续的紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的软件</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4000/FP21</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗AAV VP1、VP2抗体（A69）</td><td>American Research Products</td><td>03-61057</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗AAV VP1、VP2、VP3抗体（B1）</td><td>American Research Products</td><td>03-61058</td><td></td></tr><tr><td>Neuro2a</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>12738422</td><td></td></tr><tr><td>NZYColour蛋白分子量标准II</td><td>NZYtech</td><td>MB09002</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-scGFP</td><td>Addgene</td><td>32396</td><td>Addgene 质粒 # 32396；http://n2t.net/addgene:32396；RRID:Addgene_32396</td></tr><tr><td>pAAV-CMV-ssGFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td>Addgene 质粒 # 105530；http://n2t.net/addgene:105530；RRID:Addgene_105530</td></tr><tr><td>pAAV2/9n</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Addgene 质粒 # 112865；http://n2t.net/addgene:112865；RRID:Addgene_112865</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Acros Organics</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2438</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 非离子型表面活性剂（100 倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 MAX，分子量 40,000</td><td>Polysciences 欧洲</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>R500 系列紧凑型小动物麻醉机 - 异氟烷</td><td>真实世界数据</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>样品进口阀 V9-IS</td><td>Cytiva</td><td>29027746</td><td></td></tr><tr><td>样品泵 P9-S</td><td>Cytiva</td><td>29027745</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>无菌PVDF注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>15191499</td><td></td></tr><tr><td>Stunner 平台</td><td>Unchained Labs</td><td>700-2002</td><td>用于rAAV样品连续紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的设备</td></tr><tr><td>Superloop 150 mL</td><td>Cytiva</td><td>18-1023-85</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 50 mL</td><td>Cytiva</td><td>18-1113-82</td><td></td></tr><tr><td>SURE 2 超级感受态细胞</td><td>Stratagene，Agilent Technologies</td><td>HPA200152</td><td></td></tr><tr><td>经处理的培养皿</td><td>康宁</td><td>734-1711</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa Fluor 633偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）</td><td>Invitrogen</td><td>W21404</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>德克拉制药公司</td><td>N/A</td><td>Sedaxylan</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>卡尔·蔡司显微镜有限公司</td><td>N/A</td><td>配备 EC Plan-Neofluar 10x/0.30 物镜和 Plan-Apochromat 40x/0.95 物镜的倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>蔡司 Axio Scan.Z1</td><td>卡尔·蔡司显微镜有限公司</td><td>N/A</td><td>配备 Plan-Apochromat 20x/0.8 物镜的载玻片扫描荧光显微镜</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>卡尔蔡司显微技术有限公司</td><td>N/A</td><td>配备 Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC 物镜的倒置共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>&amp;micro;-滑动8孔Ibidi</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>8孔板腔室载玻片</td></tr></tbody></table>

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

腺相关病毒（AAV）已成为一种日益重要的基因递送载体 体内 基因递送，并正在开展人体临床试验。然而，目前常用的腺相关病毒（AAV）纯化方法依赖于氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心。尽管这些方法具有一定的优势，但耗时较长、可扩展性有限，且常常获得纯度较低的病毒载体。为克服这些局限，研究人员正将注意力转向层析技术。本文介绍一种优化的基于肝素的亲和层析方案，可作为AAV纯化的通用捕获步骤。
该方法基于腺相关病毒2型（AAV2）对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的内在亲和力。具体而言，该方案包括将编码目标AAV衣壳蛋白的质粒与AAV2的质粒共转染，从而产生嵌合型AAV载体，兼具两种亲本血清型的特性。简言之，在裂解生产细胞后，含有AAV颗粒的混合物通过优化的单步肝素亲和层析法直接进行纯化，该过程使用标准的快速蛋白液相色谱（FPLC）系统。纯化后的AAV颗粒随后被浓缩，并在纯度和生物活性方面进行全面表征。该方案提供了一种简化且可放大的方法，无需超速离心和梯度分离步骤，即可获得高纯度和高病毒滴度的产物。

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。

腺相关病毒（AAV）已成为体内基因递送的一种日益重要的载体，目前正在进行人体临床试验。

本研究旨在建立一种改进的嵌合型腺相关病毒载体的制备、纯化与表征方案，以期在临床前研究中验证其应用价值。尽管已有尝试构建稳定的生产细胞系，目前腺相关病毒（AAV）的制备仍主要依赖于哺乳动物细胞的瞬时转染。随后，病毒颗粒通过超高速密度梯度离心法或基于病毒颗粒生化特性的层析技术进行纯化。常用的纯化病毒载体（AVs）方法利用氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心。尽管这些方法具有优势，但也存在一些局限性：耗时较长、可扩展性有限，且常常导致某些载体的纯度较低。目前，为了克服这些限制，许多研究人员已将注意力转向色谱技术。本文介绍了一种基于 AAV2 肝素结合能力的嵌合型重组腺相关病毒（rAAV）制备的逐步操作方案。该方法可在六天内获得高纯度且具有生物活性的 rAAV，可直接用于后续实验，是一种适用于临床前研究的半自动化、可扩展且成本效益高的 rAAV 制备策略。在证明了该方法适用于嵌合型rAAV的制备后，现在可通过建立生产细胞系对生产系统进行优化，以实现更好的可扩展性和成本效益。此外，我们计划增加第二步精细纯化步骤，以去除空壳颗粒。首先，在10个直径为15厘米的经处理培养皿中，各加入22毫升添加了补充物的培养基，接种HEK 293T细胞。将培养板孵育24小时，使细胞融合度达到70%至80%。进行细胞转染时，将试剂加入微量离心管中混合，并通过轻弹管壁混匀。将转染混合物加入含有4.56毫升未添加补充物的DMEM的50毫升离心管中，再通过轻弹管壁混匀。然后逐滴加入1.37毫升无菌的聚乙烯亚胺溶液。轻轻敲击混匀，室温孵育10分钟，以形成DNA-聚乙烯亚胺复合物。将该混合物加入231毫升预热的含补充物的DMEM培养基中。将每个培养皿中的培养基更换为22毫升该转染混合物，并将细胞孵育48小时。如果PITR编码荧光报告基因，可在荧光显微镜下观察转染后的细胞。接着，收集每块培养皿中的培养基，在800 G下离心10分钟，弃去上清液。然后向培养板中加入 10 毫升预热的 PBS，用细胞刮刀刮下细胞。将细胞悬液收集至含有细胞沉淀的离心管中。每次用 10 毫升 PBS 清洗五个培养皿，确保所有细胞均被收集。再次离心以沉淀细胞。对于rAAV提取，将转染后的细胞沉淀物解冻，并重悬于100毫升无菌缓冲液中，用移液器吹打以确保形成均一的悬浮液。然后加入12.5毫升新鲜配制的无菌10%脱氧胆酸钠溶液以诱导细胞裂解，并通过移液混匀。加入 27 微升苯甲酸核酸酶，充分混匀，直至混合物不再黏稠。在 37 摄氏度孵育，每 10 分钟涡旋一次，持续 1 小时。在 25 摄氏度以 3000 G 离心 60 分钟。使用0.45微米PVDF注射器滤膜将上清液过滤至新的无菌容器中。首先，准备FPLC系统以进行纯化。使用手动指令或自定义方法，用无菌超纯水彻底冲洗液体流路。连接一个1毫升预装肝素柱。调节压力报警。以每分钟1毫升的流速，用5个柱体积的超纯水洗涤。然后切换系统泵的溶液以准备上样。用缓冲液 B 清洗系统泵 B，并用缓冲液 A 填充其余的液体流路。将样品泵的样品管插入病毒制备液中。或者，可使用超大进样环进行上样。将出口管路插入一个新的容器中。首次进行纯化操作时，需定义一个用于自动纯化的自定义方法。启用常规纯化设置后，该方法将使用样品溶液对从样品入口 S1 到进样阀的流路进行预冲洗。然后以每分钟1毫升的流速，用缓冲液B的12.5%溶液平衡层析柱，总体积为5个柱体积。以每分钟0.5毫升的流速将样品上样至层析柱，并通过出口端收集穿流组分。再以每分钟1毫升的流速，用20个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱。然后按照此方案以每分钟1毫升的速度洗脱样品。使用组分收集器，选择收集每1毫升的洗脱组分。随后，用12.5%的B缓冲液以每分钟1毫升的速度重新平衡色谱柱，体积为五个柱体积。打开已创建的方法，等待洗脱步骤。使用馏分收集器收集各馏分。同时收集流穿液的等分试样，并将馏分于-20摄氏度保存。评估所有纯化步骤（包括洗脱曲线）的自动保存色谱图。完成后，将入口从缓冲液切换至超纯水，并以每分钟1毫升的流速冲洗色谱柱，冲洗体积为五个柱体积。恢复色谱柱时，将入口从超纯水切换至20%乙醇，并以五个柱体积的量冲洗色谱柱。为浓缩重组腺相关病毒（rAAV），将所需FPLC组分加入截留分子量为100千道尔顿的15毫升离心过滤装置中。在室温下以2000 × g离心2分钟，浓缩至终体积约500微升。随后进行缓冲液置换，向离心过滤装置中加入1毫升无菌PBS。用移液器吹打并以一分钟为间隔离心，直至体积减少至500微升。进一步浓缩rAAV时，将此500微升样品转移至截留分子量为100千道尔顿的0.5毫升离心过滤装置中，以6000 ×g离心，每次一分钟，直至体积低于100微升。将过滤装置倒置插入新的微量离心管中，离心以回收浓缩的rAAV，使rAAV转移至管中。将重组腺相关病毒（rAAV）分装至低吸附微量离心管中，于-80摄氏度保存。采用SDS-PAGE分析rAAV制备物的纯度，结果显示清晰的衣壳蛋白条带。通过透射电子显微镜（TEM）观察病毒颗粒，可见具有电子致密中心的空颗粒和完整颗粒。使用Stunner平台评估rAAV的物理杂质特性，结果显示完整衣壳颗粒大小约为30纳米，可测定总体衣壳滴度、游离蛋白及聚集蛋白，以及单链DNA。在神经2A细胞中的感染性实验显示具有较高的感染水平。用该病毒制剂感染原代神经元培养物，证实其基因转导特性得以保持。使用rAAV载体对小鼠小脑进行体内转导，结果实现了 prolonged GFP表达，表明在哺乳动物大脑中成功实现了外源基因的表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过单步法和半自动肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo...

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内...

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

我们开发了一种利用激光诱导超声检测循环黑色素瘤细胞的流式细胞仪，用于作为转移性疾病早期的指示指标。...

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植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

开发可生物素化的融合蛋白在各个研究领域具有广泛的应用前景。重组蛋白工程技术是一种简单直接且成本效益高的方法，能够高效地获得按特定设计定制的蛋白质。...

可溶性与不可溶性生物素化蛋白的表达、分离与纯化在神经组织再生中的应用

了解利用肝素亲和层析技术纯化腺相关病毒载体的单步法方案。该方法可在六天内获得高纯度、高生物活性的重组AAV，为基因治疗临床前研究提供可扩展且经济高效的病毒制备策略。

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