通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

本研究旨在建立一种改进的嵌合型腺相关病毒载体的制备、纯化与表征方案，以期在临床前研究中验证其应用价值。尽管已有尝试构建稳定的生产细胞系，目前腺相关病毒（AAV）的制备仍主要依赖于哺乳动物细胞的瞬时转染。随后，病毒颗粒通过超高速密度梯度离心法或基于病毒颗粒生化特性的层析技术进行纯化。

常用的纯化病毒载体（AVs）方法利用氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心。尽管这些方法具有优势，但也存在一些局限性：耗时较长、可扩展性有限，且常常导致某些载体的纯度较低。

目前，为了克服这些限制，许多研究人员已将注意力转向色谱技术。本文介绍了一种基于 AAV2 肝素结合能力的嵌合型重组腺相关病毒（rAAV）制备的逐步操作方案。该方法可在六天内获得高纯度且具有生物活性的 rAAV，可直接用于后续实验，是一种适用于临床前研究的半自动化、可扩展且成本效益高的 rAAV 制备策略。

在证明了该方法适用于嵌合型rAAV的制备后，现在可通过建立生产细胞系对生产系统进行优化，以实现更好的可扩展性和成本效益。此外，我们计划增加第二步精细纯化步骤，以去除空壳颗粒。首先，在10个直径为15厘米的经处理培养皿中，各加入22毫升添加了补充物的培养基，接种HEK 293T细胞。

将培养板孵育24小时，使细胞融合度达到70%至80%。进行细胞转染时，将试剂加入微量离心管中混合，并通过轻弹管壁混匀。将转染混合物加入含有4.56毫升未添加补充物的DMEM的50毫升离心管中，再通过轻弹管壁混匀。

然后逐滴加入1.37毫升无菌的聚乙烯亚胺溶液。轻轻敲击混匀，室温孵育10分钟，以形成DNA-聚乙烯亚胺复合物。将该混合物加入231毫升预热的含补充物的DMEM培养基中。

将每个培养皿中的培养基更换为22毫升该转染混合物，并将细胞孵育48小时。如果PITR编码荧光报告基因，可在荧光显微镜下观察转染后的细胞。接着，收集每块培养皿中的培养基，在800 G下离心10分钟，弃去上清液。

然后向培养板中加入 10 毫升预热的 PBS，用细胞刮刀刮下细胞。将细胞悬液收集至含有细胞沉淀的离心管中。每次用 10 毫升 PBS 清洗五个培养皿，确保所有细胞均被收集。

再次离心以沉淀细胞。对于rAAV提取，将转染后的细胞沉淀物解冻，并重悬于100毫升无菌缓冲液中，用移液器吹打以确保形成均一的悬浮液。然后加入12.5毫升新鲜配制的无菌10%脱氧胆酸钠溶液以诱导细胞裂解，并通过移液混匀。

加入 27 微升苯甲酸核酸酶，充分混匀，直至混合物不再黏稠。在 37 摄氏度孵育，每 10 分钟涡旋一次，持续 1 小时。在 25 摄氏度以 3000 G 离心 60 分钟。

使用0.45微米PVDF注射器滤膜将上清液过滤至新的无菌容器中。首先，准备FPLC系统以进行纯化。使用手动指令或自定义方法，用无菌超纯水彻底冲洗液体流路。

连接一个1毫升预装肝素柱。调节压力报警。以每分钟1毫升的流速，用5个柱体积的超纯水洗涤。

然后切换系统泵的溶液以准备上样。用缓冲液 B 清洗系统泵 B，并用缓冲液 A 填充其余的液体流路。将样品泵的样品管插入病毒制备液中。或者，可使用超大进样环进行上样。

将出口管路插入一个新的容器中。首次进行纯化操作时，需定义一个用于自动纯化的自定义方法。启用常规纯化设置后，该方法将使用样品溶液对从样品入口 S1 到进样阀的流路进行预冲洗。

然后以每分钟1毫升的流速，用缓冲液B的12.5%溶液平衡层析柱，总体积为5个柱体积。以每分钟0.5毫升的流速将样品上样至层析柱，并通过出口端收集穿流组分。再以每分钟1毫升的流速，用20个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱。

然后按照此方案以每分钟1毫升的速度洗脱样品。使用组分收集器，选择收集每1毫升的洗脱组分。随后，用12.5%的B缓冲液以每分钟1毫升的速度重新平衡色谱柱，体积为五个柱体积。

打开已创建的方法，等待洗脱步骤。使用馏分收集器收集各馏分。同时收集流穿液的等分试样，并将馏分于-20摄氏度保存。

评估所有纯化步骤（包括洗脱曲线）的自动保存色谱图。完成后，将入口从缓冲液切换至超纯水，并以每分钟1毫升的流速冲洗色谱柱，冲洗体积为五个柱体积。恢复色谱柱时，将入口从超纯水切换至20%乙醇，并以五个柱体积的量冲洗色谱柱。

为浓缩重组腺相关病毒（rAAV），将所需FPLC组分加入截留分子量为100千道尔顿的15毫升离心过滤装置中。在室温下以2000 × g离心2分钟，浓缩至终体积约500微升。随后进行缓冲液置换，向离心过滤装置中加入1毫升无菌PBS。

用移液器吹打并以一分钟为间隔离心，直至体积减少至500微升。进一步浓缩rAAV时，将此500微升样品转移至截留分子量为100千道尔顿的0.5毫升离心过滤装置中，以6000 ×g离心，每次一分钟，直至体积低于100微升。将过滤装置倒置插入新的微量离心管中，离心以回收浓缩的rAAV，使rAAV转移至管中。

将重组腺相关病毒（rAAV）分装至低吸附微量离心管中，于-80摄氏度保存。采用SDS-PAGE分析rAAV制备物的纯度，结果显示清晰的衣壳蛋白条带。通过透射电子显微镜（TEM）观察病毒颗粒，可见具有电子致密中心的空颗粒和完整颗粒。

使用Stunner平台评估rAAV的物理杂质特性，结果显示完整衣壳颗粒大小约为30纳米，可测定总体衣壳滴度、游离蛋白及聚集蛋白，以及单链DNA。在神经2A细胞中的感染性实验显示具有较高的感染水平。用该病毒制剂感染原代神经元培养物，证实其基因转导特性得以保持。

使用rAAV载体对小鼠小脑进行体内转导，结果实现了 prolonged GFP表达，表明在哺乳动物大脑中成功实现了外源基因的表达。