Name: 原代小鼠 CD8+ T 细胞的实时体外迁移测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习原代小鼠CD8+T细胞实时体外迁移测定方法，利用延时显微成像和微流控设备精确控制微环境，定量分析T细胞动态行为。该方案简单可重复，适用于配备明场显微镜的研究实验室，为免疫学研究提供可靠技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢金实验室的历任和现任成员，他们为这些实验方案的逐步完善做出了贡献。代表性数据的获得得益于美国国立卫生研究院国家过敏与传染病研究所（NIAID NIH HHS）资助项目 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/美国，以及美国国立心肺血液研究所（NHLBI NIH HHS）资助项目 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/美国。本出版物的部分成果得益于机构露丝·L·卡什斯坦国家研究服务奖（Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）资助编号 T32 GM135134 的支持。

动物实验方案已获罗切斯特大学动物资源委员会批准。本研究中的小鼠饲养于罗切斯特大学动物设施的无病原体环境中。实验使用6至12周龄（15-30 g）的雄性/雌性C57BL/6小鼠。小鼠组织分离可在实验台面上进行，操作时需佩戴手套保护双手&#160;以及&#160;佩戴面罩遮盖口鼻，也可在生物安全柜内操作。所有细胞培养和培养板制备操作必须在生物安全柜内进行。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. CD8+ T细胞的纯化与激活
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>用于CD8+ T细胞的阴性筛选：从杂交瘤细胞系GK1.5和M5/114抗体的上清液中制备阴性筛选培养基，这两种抗体分别产生抗CD4和抗MHCII。将上清液按1:1比例混合，过滤后于4 °C保存以备后续使用（&#62;每百万总细胞含每种抗体>0.5 µg）。或者，也可使用市售的CD8+ T细胞分离试剂盒。</li>
		<li>用于T细胞活化：将500 µL CD3（10 µg/mL）和CD28（16 µg/mL）抗体加入1x DPBS（不含钙和镁）中，加入未经组织培养（TC）处理的24孔板中，并于4 °C过夜孵育，以确保抗体结合到板上。 
		注意：抗体和蛋白质在未经TC处理的培养板/培养皿上的包被效果优于常规TC处理的培养板，因此T细胞制备过程中使用未经TC处理的培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将70 µm细胞筛置于一个10 cm培养皿（或等效容器）中，并向筛内加入2 mL R9培养基（R9培养基：RPMI 1640&#160;，添加10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌剂、20 mM HEPES缓冲液、1% MEM非必需氨基酸、50 µM β-巯基乙醇）。</li>
	<li>根据实验设计要求，选取具有适当遗传背景、性别、年龄和体重的小鼠。</li>
	<li>采用CO2吸入法实施安乐死，随后进行颈椎脱位，或根据当地动物护理与使用规程并经机构批准的其他适当安乐死方法。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，四肢伸展并垂直于身体，使用小鼠解剖T型针或等效工具将足垫固定于解剖板上。使用小鼠外科解剖剪在腹部腹侧皮肤下部做一条浅表性、位于中线的切口，并沿中线直切至下颌（约8 cm）。分离皮肤与腹膜层，暴露淋巴结。将皮肤垂直于躯干方向拉伸并固定。5
	<ol>
		<li>使用钝头镊子（或标准小鼠外科解剖工具包中的其他合适工具）双侧轻柔地摘取颈、腋窝、臂部和腹股沟淋巴结。转移至第1.2步中已准备好的细胞筛中。</li>
		<li>切开腹膜，取出脾脏。转移至第1.2步中已准备好的细胞筛中。</li>
		<li>将小鼠尸体放入适当的生物危害废物容器中处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第1.2步准备的70 µm细胞筛上，使用2 mL R9培养基通过反复顺时针和逆时针旋转组织破碎工具半圈，对次级淋巴组织进行机械破碎，以制备单细胞悬液。 
	注意：使用3 mL或10 mL鲁尔锁式注射器的活塞端可有效压碎并均质化组织。用户可根据需要选择其他替代材料。</li>
	<li>用7 mL培养基冲洗细胞、注射器末端、细胞筛和培养皿，确保细胞筛保持直立，防止较大的组织碎片或细胞聚集体进入单细胞悬液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在室温（20 °C）下以270 x g&#160;离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。</li>
	<li>加入500 µL裂解缓冲液，作用1分钟以去除红细胞。加入9.5 mL R9培养基稀释，于270 x g&#160;（20 °C）离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于10 mL先前制备的含抗MHCII和抗CD4抗体的阴性筛选培养基中（见步骤1.1.1）。室温（20 °C）摇动30分钟。</li>
	<li>以270 x g离心5分钟&#160;，弃去上清液。用10 mL R9培养基洗涤3次。</li>
	<li>同时，在15 mL锥形管中，用7 mL培养基洗涤200 µL羊抗大鼠IgG磁珠。将管置于磁力架上，吸除培养基，重复洗涤两次。最后将磁珠重悬于7 mL R9培养基中。</li>
	<li>以270 x g&#160;（20 °C）离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于第1.13步制备的7 mL磁珠悬液中。室温（20 °C）摇动45分钟。</li>
	<li>通过磁珠耗竭法富集CD8+ T细胞。将锥形管直接置于磁力架上（不加盖），静置3分钟以去除与抗体/磁珠结合的细胞。CD8+ T细胞应保留在上清中。保持管子仍在磁力架上，用移液管或等效工具收集细胞悬液，转移至新的15 mL管中。于270 x g&#160;（20 °C）离心5分钟，并用培养基洗涤3次。</li>
	<li>用1x DPBS洗涤预包被的活化板（步骤1.1.2）两次，注意不要直接将液体滴加至板底表面。</li>
	<li>可选步骤：进行活/死淋巴细胞分离以去除死细胞。
	<ol>
		<li>将细胞转移至15 mL锥形管中。轻柔地将2 mL淋巴细胞分离液加至细胞悬液底部。在室温下以900 x g低加速度和低减速度离心10分钟。 
		注意：活细胞将聚集在培养基与分离液的界面处（中间白色层），死细胞则沉淀于管底，可在最后弃去。</li>
		<li>将含有活淋巴细胞的中间层转移至新管中，在室温下以270 x g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于12 mL含10 U/mL重组小鼠IL-2的培养基中。每孔接种1 mL至未经TC处理的24孔板中，于37 °C孵育过夜。</li>
</ol>
2. 分离活化的 CD8+ T 细胞
<ol>
	<li>使用标准台式光学显微镜，采用 4x 或 10x 物镜观察细胞。 
	注意：活化的 T 细胞相较于未活化 T 细胞体积更大，呈圆形或长形，并在孔内形成密集的细胞簇。</li>
	<li>为收集活化细胞，使用 1 mL 移液器吹打细胞，确保充分混匀孔板边缘的细胞，然后将细胞转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。 
	注意：活化细胞黏附性更强，需更剧烈地进行吹打。</li>
	<li>用 1 mL R9 培养基洗涤孔内残留细胞，必要时重复一次。在 270 x g（20 °C）条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>按照步骤 1.17–1.18 的方法进行活/死淋巴细胞分离，以去除死细胞。</li>
	<li>在非 TC&#160;6 孔板中，使用含 IL-2 的 R9 培养基每 3–4 天通过去除死细胞的方式维持 T 细胞生长。 
	注意：在早期活化阶段，T 细胞在尺寸较小的孔中增殖效果更佳，可能与 T 细胞之间的相互接触或 T 细胞分泌的可溶性因子促进其活化有关。T 细胞快速增殖会导致培养基在培养后 24–48 小时内变黄。此时，应收集细胞并将其转移至更大的孔（未包被、非 TC 6 孔板）中，加入足量新鲜培养基以维持细胞生长（通常每孔 5 mL）。当培养基颜色变黄提示耗尽时，或每 3–4 天定期更换新鲜培养基。</li>
</ol>
3. 玻璃培养皿的准备
<ol>
	<li>使用 300 µL/cm2 的 Protein A（0.1&#160;mg/mL）在 4 °C 下过夜包被玻璃细胞迁移小室或培养板，然后通过向培养皿中加入 1× DPBS 并倾倒弃去的方式洗涤两次，再进行下一步操作。</li>
	<li>在室温下，使用 300 µL/cm2 的重组小鼠 ICAM-1 或 VCAM-1 Fc 融合蛋白（0.1–2.75 mg/mL）与一种重组小鼠趋化因子（0.1–10 µg/mL）共同包被迁移小室或培养板，孵育 2–3 小时。其他整合素配体（如纤连蛋白、小鼠 IV 型胶原和小鼠 E-钙黏蛋白）可在 4 °C 下以 2.5–10 µg/mL 的浓度直接包被小室过夜。
	<ol>
		<li>在加细胞前，立即通过向培养皿中加入 1× DPBS 并倾倒弃去的方式洗涤小室两次。 
		注意：T 细胞在不同浓度的整合素配体和趋化因子中的迁移行为可能因其活化、分化、致敏和启动状态的不同而有所差异。强烈建议在多种不同浓度下检测细胞迁移能力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需共培养 T 细胞与其他细胞（如癌细胞）以实时测量 T 细胞对癌细胞的杀伤作用，则应在成像开始前 24 小时将贴壁细胞接种于包被玻璃的培养板上。</li>
</ol>
4. 细胞的制备
<ol>
	<li>可选：根据制造商方案，或在 37 °C 条件下，用所选细胞示踪染料以每 1 x 107 个细胞 1 µg/mL 的浓度在 1x DPBS 中对 T 细胞和贴壁细胞染色 15 分钟。</li>
	<li>使用血细胞计数板或等效设备对细胞进行计数。</li>
	<li>在 37 °C 培养箱中，将 1 x 105 个 CD8+ T 细胞（或所需数量）接种于补充有 1–5 g/L 葡萄糖的 Leibovitz's L-15 培养基中。 
	注意：L-15 培养基的配方无需使用 CO2-碳酸氢钠系统，其通过游离碱性氨基酸、磷酸盐缓冲液和半乳糖维持 pH 水平。</li>
	<li>可选：进行整合素阻断。
	<ol>
		<li>将 T 细胞与针对整合素的阻断抗体（1–10 µg/mL，抗小鼠 CD11a (M17/4)、抗小鼠 CD18 (M18/2)、抗小鼠 VLA-4 (9C10)）预先孵育 10 分钟，并在相同抗体存在条件下进行爬行实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 时间序列显微成像
<ol>
	<li>进行视频显微镜观察。</li>
	<li>对于T细胞，每10-60秒采集一次明场和荧光图像，持续10-60分钟，或根据所需的采集参数进行设置。 
	注意：T细胞迁移对温度敏感，小鼠T细胞迁移的最佳温度为37 °C。本方案所用的温度控制系统包括一个封闭且隔热的显微镜载物台，配备有附加加热系统。成像室置于成像载物台上，该室周边设有充满蒸馏水的槽，可在成像过程中维持恒定的温度和湿度。微孔位于成像室的中央。</li>
</ol>
6. T细胞迁移的软件辅助分析
<ol>
	<li>使用 Volocity 软件评估 T 细胞迁移。
	<ol>
		<li>开放 Volocity 并创建一个 新的图像序列.</li>
		<li>选择 和 移动 将所有延时视频显微镜影片导入 Volocity 的蓝色区域。</li>
		<li>使用对比度增强工具调整亮度和对比度至研究者期望的设置。</li>
		<li>检查图像尺寸：20倍镜下为0.325 µm，10倍镜下为0.65 µm。</li>
		<li>序列：设置时间点&#160;（例如，若每15秒拍摄一张图像，持续20分钟，则共81张图像，即每分钟4张）。</li>
		<li>取消勾选 所有时间点 在 测量选项卡.</li>
		<li>使用强度查找对象——滑动滑块，使其恰好位于峰值右侧。</li>
		<li>根据大小排除对象：排除直径小于10 µm和大于100 µm的细胞，以去除细胞碎片或非细胞颗粒。排除迁移时间少于记录时间20%的T细胞（具体阈值可根据不同研究者的定义而调整）。</li>
		<li>忽略静态物体 （复选框）</li>
		<li>自动连接断裂的纤维束 （复选框）</li>
		<li>将最短路径设置为不超过 20 µm。</li>
		<li>细胞迁移轨迹是随时间连接同一细胞位置的连线。确保追踪算法通过检测每个帧中分割所识别的单个物体位置，并在各帧之间匹配这些物体，从而实现追踪。</li>
		<li>通过选择保存新方案 测量 &#62; 保存实验方案 &#62; 命名新方案</li>
		<li>点击 测量所有时间点 在 测量选项卡.</li>
		<li>按时间跨度从高到低排序轨迹。</li>
		<li>记录研究者定义为具有良好轨迹的所有细胞的轨迹 ID 编号。自动细胞追踪后，需对每个细胞轨迹进行手动评估，以排除错误识别或中断的轨迹。排除具有不良轨迹的细胞。</li>
		<li>将文件导出为逗号分隔的文本格式，并将数据传输至所需的分析软件。 
		注意：基本参数：速度（µm/min）、位移（净移动距离，µm）、轨迹长度（总路径长度，µm）和蜿蜒指数（MI；净位移/轨迹长度。MI = 1 表示完全直线的轨迹）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Image J 进行手动追踪。
	<ol>
		<li>打开插件并选择 追踪 和 手动追踪设置参数——时间间隔、x/y 轴校准（像素大小）和 z 轴校准（在手动追踪模式下）。通过点击开始单个细胞的追踪 添加轨迹，首先在第一个时间点选择一个细胞，并将其延续至所有时间点。接着，点击 末端轨迹对所有目标细胞重复此步骤。 
		注意：Trackmate 是另一种用于细胞追踪的工具，是一款可获取的自动追踪软件 通过 ImageJ 插件</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Elucidating T-Cell Kinetics: Methods for Real-Time Migration Analysis

<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Fowell, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+control+of+effector+T+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal control of effector T cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).</li>
<li>Tabdanov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+t+cells+to+enhance+3d+migration+through+structurally+and+mechanically+complex+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments.</a> Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).</li>
<li>Kameritsch, P., Renkawitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+leukocyte+migration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of leukocyte migration strategies.</a> Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+naive+CD4%2B+T+cell+isolation+and+in+vitro+differentiation+into+t+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739(2015).</li>
<li>Sailer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pd-1%28hi%29+CAR-T+cells+provide+superior+protection+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors.</a> Front Immunol. 14, 1187850(2023).</li>
<li>Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+integrin+mac-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of integrin mac-1 in vivo.</a> J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways.</a> Science. 349, 4352(2015).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+neutrophil+efferocytosis+shapes+T+cell+immunity+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection.</a> Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).</li>
<li>Reilly, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28rm%29+integrins+CD103+and+CD49a+differentially+support+adherence+and+motility+after+resolution+of+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).</li>
<li>Amitrano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+CD8%28%2B%29+T+cell+metabolism+and+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions.</a> Front Immunol. 12, 666231(2021).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+t-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).</li>
<li>Capece, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intracellular+pool+of+IFA-1+is+critical+for+asymmetric+CD8%28%2B%29+T+cell+activation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation.</a> J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).</li>
<li>Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+function+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin.</a> J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).</li>
<li>Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cytolytic+T+cell+differentiation+and+granule+exocytosis+with+T+cells+from+mice+expressing+active+fluorescent+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B.</a> PLoS One. 8 (6), e67239(2013).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).</li>
<li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).</li>
<li>Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL+sequence+in+the+LLKIL+motif+in+CXCR2+is+required+for+full+ligand-induced+activation+of+Erk%2C+Akt%2C+and+chemotaxis+in+HL60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells.</a> J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).</li>
<li>Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li>
<li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+crawling+in+capillaries%3A+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963(2014).</li>
<li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4%28%2B%29+T+cells+is+dependent+on+integrin+%CE%B1v%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li>
</ol>

作者声明，所有研究和稿件撰写均在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

理解汇聚信号的生物学效应 体内 具有挑战性且不易解释。本文提供的方案为在高度明确且具有生物学相关性的条件下理解T细胞迁移提供了一种合理的方法。这些条件可根据研究者的判断进行设定，且该方案可针对不同T细胞群体、活化状态和细胞表型的需求进行调整。此外，通过明确的抗体阻断方法，可对多种配体与受体相互作用进行探究。7,8 配体包被玻璃的实验步骤8,9,10该技术还一直是开发工程化免疫细胞的关键平台11,12.
实验方案中的关键步骤包括次级淋巴组织的分离、T细胞的活化、玻璃成像培养皿的包被以及数据分析。对于缺乏经验的操作者而言，嵌在组织中的淋巴结&#160;可能难以识别和提取，但通过练习可以克服这一困难。一旦完成T细胞的分离与纯化，活化步骤会导致细胞黏附性增强，若操作不当，可能造成细胞收获率偏低。通过充分且轻柔地洗涤孔板可避免这一问题。玻璃培养皿必须使用目标配体正确包被，并在加细胞前进行洗涤，以确保细胞可接触足够稳固的蛋白层，同时防止过量试剂干扰生物学过程。在生理pH值和盐浓度条件下，Protein A与玻璃表面的结合以及Fc与Protein A的结合足够牢固，能够在轻柔倾倒缓冲液时抵抗脱落。培养基中残留的蛋白质（如有）不会产生细胞毒性，但若未结合的配体浓度过高，可能会干扰细胞与固定化配体的相互作用。我们通过将包被后的玻璃片清洗数次来排除这一可能性。最后，目前已有多种用户友好的商业及非商业软件，可帮助研究人员检测细胞行为和形态中的细微差异。必须强调的是，对分析结果进行人工复核以排除软件可能产生的错误至关重要。
T细胞纯化与活化的方法可根据研究人员的需求进行调整，以获得适当的细胞状态和表型，从而重现目标生物学过程 体内 观察。可利用多种细胞类型和状态来研究感染及免疫反应的不同机制7,8,9,10,11,13，包括在组织特异性条件下探讨初始T细胞和记忆T细胞的行为，以及记忆免疫应答的各个方面，如启动和招募过程14. 该方法可用于与不同类型的细胞进行共培养&#160;细胞类型，以进一步理解细胞间相互作用，包括细胞-细胞接触时间与持续时长7,9抗原呈递9,13和靶细胞杀伤6. 可使用其他报告基因和标记物来评估亚细胞结构7，颗粒15，细胞凋亡6，以及其他内容。
该方案是一种优秀的工具，可用于在简化且高度明确的条件下，基于观察结果指导进一步的体内实验。体外细胞迁移能力评估虽然具有高度简化性，但却是解析复杂生物学活动的重要步骤。通过这些实验结果，研究人员能够以更符合生理相关性和更具针对性的方式开展体内研究。
该方法的简便性也代表了其主要局限性；尽管具有代表性 体内 活动，所有结果均可通过例如活体多光子显微镜进一步验证。本文所述方法是目前研究实验室可采用的最简单方法之一，仅需配备明场显微镜和/或落射荧光显微镜，并搭配集成于显微镜系统或单独安装在物镜端的数字相机即可。另一方面，对于高级分析，还可选择更多技术手段 体外 免疫细胞迁移。首先，免疫细胞在生物系统中通常受到趋化因子梯度的驱动。可通过多种方式分析免疫细胞在趋化因子梯度下的行为。一种简单的方法是使用特制的载玻片（参见 材料表）。这种沟道化井系统，当&#160;其底部包被有整合素配体，可用于在静态趋化因子梯度条件下分析免疫细胞迁移。其他用于免疫细胞趋化性的简单检测方法包括&#160;使用释放趋化因子的微移液管尖端进行细胞迁移的延时显微成像16琼脂糖下迁移实验17，以及Zigmond小室18对于在可控趋化因子梯度下的更复杂的迁移实验，需要使用带有微流控梯度发生器的定制载玻片19,20其次，免疫细胞可以以独特的方式迁移&#160;利用不同机制在物理条件下实现，有时无需通过整合素依赖性配体黏附。 体外 一维迁移实验可采用或不采用整合素配体包被，能够模拟免疫细胞在毛细血管中的运动行为21,22另一种选择是在三维空间中进行细胞迁移实验23,24 研究细胞间质迁移的潜在机制25,26总体而言，我们已概述&#160;研究动态细胞迁移事件的简单、可重复且可靠的方法。

T细胞是适应性、抗原特异性免疫应答的主要效应细胞。在群体水平上，T细胞具有异质性，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。其中，CD8+ T细胞是免疫系统主要的细胞毒性效应细胞，能够直接清除被感染或功能异常的细胞1。
成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴系统循环以寻找抗原。在感染过程中，T细胞在血液或组织中接触到抗原后，迅速迁移至脾脏或最近的引流淋巴结，以启动有效的免疫应答。无论哪种情况，T细胞都会被激活，经历克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液（如果尚未在血液中）。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体的下调，以及多种整合素和趋化因子受体的上调，这些受体对组织特异性迁移至关重要2。最终，T细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号在内的多种环境信号共同驱动的。
趋化因子 broadly 可分为两大类：（1）稳态信号，对细胞分化、存活和基础功能至关重要；（2）炎症信号，例如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，这些信号在趋化作用中起必需作用。通常情况下，趋化因子形成一种信号梯度，驱动细胞的定向迁移，即趋化作用，同时还能激活整合素的表达1。趋化作用受到精细调控且高度敏感，T 细胞能够响应微小的梯度变化，从而被引导至特定方向或位置。
除了这些与T细胞相关的因素外，迁移还受到细胞外基质（ECM）组成和密度的影响。细胞外基质由包括胶原蛋白和蛋白聚糖在内的多种蛋白质构成的致密网络组成，为T细胞表面的黏附性整合素受体提供了支架。整合素是一类多样化的跨膜蛋白家族，每种整合素都具有高度特异性的结合结构域以及下游信号传导效应。T细胞表面整合素受体的动态表达使其能够快速适应不断变化的环境3。重要的是，整合素连接了细胞外基质与细胞内细胞骨架肌动蛋白网络，二者协同作用产生T细胞移动所需的推进力。
总之，迁移模式因免疫细胞表型或环境信号的不同而有所差异。这些复杂的生物学过程受到T细胞表面、周围细胞以及局部感染组织中细胞因子、趋化因子和整合素表达的严格调控。体内的这些迁移机制可能&#160;十分复杂，并可能由多种叠加信号共同作用所致4。由于这种复杂性，可能难以在看似相互关联的变量之间建立因果关系。为克服这一难题，已有多种体外方法可用于研究T细胞迁移的特定方面，例如对特定趋化因子信号的响应，以及T细胞整合素与细胞外基质结合蛋白之间的相互作用。本实验方案介绍了分离和激活小鼠CD8+ T细胞的方法，以及在二维空间中进行体外迁移实验和用于分析特定T细胞迁移行为的计算分析工具。这些方法对使用者具有优势，因为它们不需要文献中所述其他某些细胞迁移实验所必需的复杂材料或设备。通过这些方法获得的细胞迁移数据可以&#160;以简明的方式提供免疫应答的证据，从而为进一步的体内深入研究奠定基础。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>康宁</td><td>353003</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339650</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>1× DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>不含钙和镁</td></tr><tr><td>6 孔板，非 TC 处理</td><td>Corning</td><td>3736</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>FisherScientific</td><td>352350</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>A1049201</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Allegra 6KR 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Sorvall 16R 配备 TX400 3655 转子及吊篮</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Sorvall ST 16R</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354233</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>DeltaT 培养皿，0.17 mm 厚玻璃，透明</td><td>Bioptechs</td><td>04200417C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 羊抗大鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 15 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12301D</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>EasySep小鼠T细胞分离试剂盒</td><td>干细胞</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>SigmaAldrich</td><td>F2442-500ML</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>SigmaAldrich</td><td>10838039001</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>http://fiji.sc/</td><td>网络链接</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>尼康或奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GK1.5</td><td>ATCC</td><td>TIB-207</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>HQ CCD相机</td><td>CoolSNAP</td><td></td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td><td>网络链接</td></tr><tr><td>ImageJ 自动追踪插件</td><td></td><td>http://imagej.net/TrackMate</td><td>网络链接</td></tr><tr><td>ImageJ 手动追踪插件</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td><td>网络链接</td></tr><tr><td>L-15</td><td>各种</td><td>参见材料部分</td><td>培养基配方：Leibovitz&amp;rsquo;不含酚红的 L-15 培养基（Gibco），添加 1–5 g/L 葡萄糖</td></tr><tr><td>L-15培养基（Leibovitz），无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁一次性注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>康宁</td><td>25-072-CI</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>M5/114</td><td>ATCC</td><td>TIB-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140050</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>显微镜加热系统</td><td>Okolab</td><td>okolab.com</td><td>可提供定制设计</td></tr><tr><td>Millicell EZ 载玻片</td><td>Millipore</td><td>C86024</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort 小鼠 CD8+ Na&amp;iuml;ve T细胞分离试剂盒</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 E-钙黏蛋白</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>8875-EC-050</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>小鼠外科解剖工具包</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-096</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>NIS 元件</td><td>尼康</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>非TC 24孔板</td><td>康宁</td><td>353047</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>蛋白A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>R9</td><td>各种</td><td>参见材料部分</td><td>培养基配方：RPMI 1640 培养基，添加 10% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂（Gibco）、20 mM HEPES 缓冲液（Gibco）、1% MEM 非必需氨基酸（Gibco）、50 &amp;mu;M &amp;beta;-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）</td></tr><tr><td>重组小鼠 ICAM-1 Fc 融合蛋白</td><td>R&amp;研发系统</td><td>796-IC-050</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>重组小鼠 IL2</td><td>Biolegend</td><td>575410</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>RPMI 1640x</td><td>ThermoFisher</td><td>11875093</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>T形针</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99385</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>TE2000-U 显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>多种重组小鼠趋化因子</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td></td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>VCAM-1 Fc 融合蛋白</td><td>R&amp;安培和D系统</td><td>643-VM-050</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>软件</td></tr></tbody></table>

原代小鼠cd8+ t细胞的实时体外迁移实验

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

适应性免疫反应依赖于T细胞在病原体和异物刺激下通过血液、淋巴和组织迁移的能力&#160;。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要整合来自环境和局部免疫细胞的多种信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和黏附分子。此外，T细胞的运动性还受到动态变化的微环境信号的影响，这些信号可改变T细胞的活化状态、转录图谱以及黏附分子的表达等。体内环境中，这些相互交织的因素使得难以区分对T细胞迁移起独立作用的信号。本实验方案提供了一整套从T细胞分离到计算机辅助分析的方法，用于在高度特异的环境条件下实时评估T细胞迁移&#160;。&#160;这些条件&#160;可能有助于&#160;阐明调控T细胞迁移的分子机制，加深我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制性证据&#160;&#160;。&#160;深入理解影响细胞&#160;迁移的分子相互作用，对于开发更有效的治疗手段具有重要意义&#160;。

通过流式细胞术检测CD69和CD44表达水平的升高，可确认T细胞的活化状态，这两种分子是小鼠T细胞活化的典型标志物。6此外，可通过流式细胞术检测CD3以确定T细胞群体的纯度+ CD8+ T细胞。该方法可获得 &gt;90 % CD8+ T细胞群
T细胞迁移可通过软件辅助的细胞追踪程序进行评估，这些程序既具有可重复性，又可根据研究者的需求进行调整。用于确定实验效应的一些基本参数包括：细胞速度（单位时间内迁移的长度，用于确定细胞移动的快慢）、位移（迁移距离，即从起点到终点的直线距离，用于确定细胞迁移的远近）、轨迹长度（迁移距离，即迁移路径的总长度，用于确定细胞迁移的总路程）以及迂曲指数（MI，取值范围为0至1，用于衡量迁移路径的直线程度，1表示完全直线）。这些参数被用于评估初始态和活化态CD8+ T细胞在CXCL12存在下沿ICAM-1包被的玻璃表面爬行时的迁移差异（图1）。与初始态T细胞相比，活化态CD8+ T细胞表现出更高的平均速度、更大的位移和更高的迂曲指数，表明活化T细胞的迁移能力增强。类似地，这些方法也可用于阐明不同趋化因子对细胞迁移模式的影响。例如，活化态CD8+ T细胞在CXCL12存在时迁移增强，而在CCL2或CCL22存在时则无此效应，且迁移增强呈剂量依赖性，直至达到饱和浓度（图2）。此外，软件辅助的细胞追踪技术能够对单个细胞的迁移行为进行表征，从而有助于理解单个配体对T细胞行为的影响。典型的细胞迁移轨迹如图3所示。
综上所述，这些数据证实了现有方法的有效性，表明我们能够：（1）在单细胞水平上追踪细胞迁移；（2）区分CD8⁺ T细胞迁移行为的差异。+ 根据激活状态以及在不同趋化因子和黏附分子存在条件下的T细胞。该实验是解析复杂信号转导机制并指导深入研究的关键步骤 体内 可进一步以细胞类型特异性方式探究特定信号在生物学功能中作用的实验。
<img alt="比较初始与活化 CD8+ T 细胞的箱线图：速度、位移、迂回指数" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1: 体外 用于检测初始和活化CD8的实验方法+ T细胞迁移 幼稚型或经CD3/CD28激活的小鼠CD8+ T细胞在ICAM-1和CXCL12上迁移10分钟。使用延时显微镜和Volocity软件分析细胞迁移的速度、位移和蜿蜒指数。每组包含36个独立的T细胞（均值±标准误）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="趋化因子诱导的细胞迁移；图表；显示CXCL12、CCL2、CCL22对细胞迁移速率的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2: 体外 活化CD8+ T细胞趋化因子依赖性迁移的检测方法+ T细胞 CD3/CD28激活的小鼠CD8+ T细胞在ICAM-1及指定趋化因子上迁移。爬行距离超过一定阈值的细胞数量之比 50 µm 20分钟内（占总数的百分比）在视野范围内进行测定。单次检测分析 &gt;10个细胞（每组n = 3次实验，均值±标准误）。非配对 t检验, *p&lt; 与对照组相比，P < 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌运动性检测、显微镜图像、轨迹彩色路径、20 μm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：活化 CD8+ T 细胞在 ICAM-1 和 CXCL12 上迁移 20 分钟的轨迹。 每条彩色线条表示每个 T 细胞从细胞起始点向相反方向移动的迁移路径。在此特定实验中，38 个细胞中有 24 个细胞迁移了显著的距离（根据我们的定义，至少达到其细胞直径的长度）。T 细胞迁移的距离各不相同，表明每个细胞处于不同的活化或启动状态。在表面均匀包被的条件下，所有迁移的细胞均朝不同方向移动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

适应性免疫反应依赖于T细胞在病原体和外来抗原刺激下，通过血液、淋巴和组织迁移的能力……

本研究的目标是在高度明确的环境条件下理解T细胞的迁移模式，以实现合理的体外实验设计，并解析影响细胞迁移的分子相互作用。活体成像技术（如活体多光子显微镜）可用于研究免疫细胞在体内的动力学行为。然而，微流控装置是一种常用的体外工具，能够对微环境进行精确控制，这是在活体样本中无法实现的。本方案使我们能够分析复杂的信号通路，并为靶向性的体外实验提供更深入的理解，从而进一步以细胞类型特异性的方式阐明各个信号的生物学功能。我们的方法简便、可重复，且易于在配备有带数字相机的明场显微镜的研究实验室中开展。因此，本方法为研究细胞动态迁移事件提供了一套可靠的实验手段。本实验室将重点研究免疫细胞（包括T细胞和中性粒细胞）在多种疾病环境（如肿瘤和感染）中的迁移过程，从而理解调控免疫细胞迁移的重要机制。这将有助于开发治疗和预防疾病的疗法。首先，将已处死的小鼠仰卧置于解剖板上。使用解剖T型针将小鼠的足垫固定在解剖板上。用外科解剖剪刀切开小鼠下腹部，并向上剪至下颌。分离皮肤与腹膜层后，将皮肤垂直于躯干方向拉开并用针固定。使用钝头镊子小心取出颈部、轴向、臂部和腹股沟淋巴结以及脾脏，并将其置于含有 2 毫升 R9 培养基的 70 微米细胞筛中。为制备单细胞悬液，反复顺时针和逆时针旋转组织破碎工具半圈。用 5 毫升培养基冲洗细胞筛。然后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中并离心。弃去上清液后，向管中加入500微升裂解缓冲液以去除红细胞。1分钟后，用9.5毫升R9培养基重悬细胞，离心管子并彻底弃去上清液。接下来，将细胞沉淀重悬于含有抗MHC II和抗CD4抗体的10毫升阴性筛选培养基中，并将试管置于摇床上孵育30分钟。在270 ×g离心5分钟使细胞沉淀后，弃去上清液。同时，在一个15毫升锥形管中，用7毫升培养基洗涤200微升羊抗大鼠免疫球蛋白G磁珠。将试管置于磁铁上，吸除培养基。再洗涤两次后，将磁珠重悬于7毫升R9培养基中。随后，将7毫升磁珠悬液与细胞沉淀混合，并将试管置于摇床上孵育。为去除抗体磁珠结合的细胞，将锥形管直接置于磁铁上静置3分钟。在保持试管处于磁铁上的同时，将细胞悬液吸出至新的15毫升试管中。离心收集富集的CD8阳性细胞，并用培养基洗涤三次。首先，从小鼠的继发性淋巴组织中分离活的淋巴细胞，并使用4倍或10倍物镜在光学显微镜下观察细胞。使用1毫升移液器吹打裂解活化细胞，将其转移至新的15毫升锥形管中。离心收集细胞沉淀，加入淋巴细胞分离液，以分离活细胞与死细胞。进行延时显微成像时，将1 × 10⁵个CD8阳性T细胞接种于培养基中，并置于37 °C培养箱内。完成整合素阻断后，每10–60秒采集一次明场和荧光图像，持续10–60分钟。在延时成像过程中，与初始T细胞相比，活化的CD8阳性T细胞的平均速度、位移和迂回指数均有所增加。首先，对从神经元次级淋巴组织中分离的活体T淋巴细胞进行延时成像。进行T细胞迁移分析时，打开Velocity软件并创建一个新的图像序列。将所有延时视频显微镜录像选中并移至Velocity中的蓝色区域。利用对比度增强工具，调整亮度和对比度。然后将图像大小调整为：20倍放大时0.325微米，10倍放大时0.65微米。配置好时间点序列后，进入“测量”选项卡，并取消勾选所有时间点。接下来，通过强度识别对象，并将滑块移至峰值右侧。为避免细胞碎片干扰，排除所有直径小于10 µm和大于100 µm的细胞。勾选“忽略静态对象”，然后勾选“自动连接断裂轨迹”。要保存新方案，请转到“测量”部分，点击“保存方案”，然后选择“命名新方案”。在“测量”标签页中，点击“测量所有时间点”，并按时间跨度从高到低对轨迹进行排序。记录下具有良好轨迹的细胞的轨迹ID编号后，将文件导出为逗号分隔的文本格式，并将数据传输至所需的分析软件。要进行手动追踪，请打开 ImageJ，进入插件（Plugins）菜单，选择追踪（Tracking）和手动追踪（Manual Tracking）。设置时间间隔、x/y 校准、像素大小和 z 轴校准。然后，单击添加轨迹（Add Track）以开始对单个细胞进行追踪。在第一个时间点选择一个细胞，并持续追踪该细胞经过所有时间点。最后，点击“End Track”。软件辅助的细胞追踪可表征活化单个T细胞的迁移行为，如不同颜色的线条所示。

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

原代小鼠 CD8+ T 细胞的实时体外迁移测定

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

竞争性归巢实验可直接在单个小鼠体内评估两种不同细胞群体的迁移特性。本文通过比较体外生成的肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移能力，说明该实验方法。...

研究肠道趋向性T细胞迁移的竞争性归巢实验

本视频介绍了在人类肺癌组织切片中，利用荧光标记抗体对驻留的肿瘤浸润性CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可通过共聚焦显微镜对CD8...

利用共聚焦显微镜实时分析不同肿瘤区域中驻留T细胞的迁移

本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro...

体外 细胞迁移与侵袭实验

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

我们在此描述一种用于研究预先激活的CD8细胞毒性的实验方案+ 通过检测凋亡的癌细胞来识别针对癌细胞的T细胞 通过 实时显微镜技术。该方案可用于研究髓系细胞诱导的T细胞抑制机制，并评估旨在恢复T细胞功能的化合物 通过...

实时检测CD8+ T细胞诱导的体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能

在本实验方案中，将淋巴细胞置于跨膜迁移系统的上室，上室与下室之间由多孔膜隔开。在下室中加入趋化因子，以诱导淋巴细胞沿趋化因子浓度梯度进行主动迁移。48小时后，分别计数两个室中的淋巴细胞，以定量分析跨膜迁移情况。...

离体跨膜迁移系统中淋巴细胞迁移能力的评估

本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。...

小鼠肿瘤浸润性CD8+ T细胞动态评估的肿瘤移植方法

本文详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术联合肿瘤芯片辅助的实验方案，用于监测和表征构成癌症-免疫循环的各个步骤。事实上，深入理解癌症细胞与免疫细胞之间的相互作用，对于破解肿瘤免疫机制、指导临床诊疗具有重要意义。...

体外共培养系统重现癌症-免疫循环

学习原代小鼠CD8+T细胞实时体外迁移测定方法，利用延时显微成像和微流控设备精确控制微环境，定量分析T细胞动态行为。该方案简单可重复，适用于配备明场显微镜的研究实验室，为免疫学研究提供可靠技术支持。

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

探索更多视频