原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

本研究的目标是在高度明确的环境条件下理解T细胞的迁移模式，以实现合理的体外实验设计，并解析影响细胞迁移的分子相互作用。活体成像技术（如活体多光子显微镜）可用于研究免疫细胞在体内的动力学行为。然而，微流控装置是一种常用的体外工具，能够对微环境进行精确控制，这是在活体样本中无法实现的。

本方案使我们能够分析复杂的信号通路，并为靶向性的体外实验提供更深入的理解，从而进一步以细胞类型特异性的方式阐明各个信号的生物学功能。我们的方法简便、可重复，且易于在配备有带数字相机的明场显微镜的研究实验室中开展。因此，本方法为研究细胞动态迁移事件提供了一套可靠的实验手段。

本实验室将重点研究免疫细胞（包括T细胞和中性粒细胞）在多种疾病环境（如肿瘤和感染）中的迁移过程，从而理解调控免疫细胞迁移的重要机制。这将有助于开发治疗和预防疾病的疗法。首先，将已处死的小鼠仰卧置于解剖板上。

使用解剖T型针将小鼠的足垫固定在解剖板上。用外科解剖剪刀切开小鼠下腹部，并向上剪至下颌。分离皮肤与腹膜层后，将皮肤垂直于躯干方向拉开并用针固定。

使用钝头镊子小心取出颈部、轴向、臂部和腹股沟淋巴结以及脾脏，并将其置于含有 2 毫升 R9 培养基的 70 微米细胞筛中。为制备单细胞悬液，反复顺时针和逆时针旋转组织破碎工具半圈。用 5 毫升培养基冲洗细胞筛。

然后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中并离心。弃去上清液后，向管中加入500微升裂解缓冲液以去除红细胞。1分钟后，用9.5毫升R9培养基重悬细胞，离心管子并彻底弃去上清液。

接下来，将细胞沉淀重悬于含有抗MHC II和抗CD4抗体的10毫升阴性筛选培养基中，并将试管置于摇床上孵育30分钟。在270 ×g离心5分钟使细胞沉淀后，弃去上清液。同时，在一个15毫升锥形管中，用7毫升培养基洗涤200微升羊抗大鼠免疫球蛋白G磁珠。

将试管置于磁铁上，吸除培养基。再洗涤两次后，将磁珠重悬于7毫升R9培养基中。随后，将7毫升磁珠悬液与细胞沉淀混合，并将试管置于摇床上孵育。

为去除抗体磁珠结合的细胞，将锥形管直接置于磁铁上静置3分钟。在保持试管处于磁铁上的同时，将细胞悬液吸出至新的15毫升试管中。离心收集富集的CD8阳性细胞，并用培养基洗涤三次。

首先，从小鼠的继发性淋巴组织中分离活的淋巴细胞，并使用4倍或10倍物镜在光学显微镜下观察细胞。使用1毫升移液器吹打裂解活化细胞，将其转移至新的15毫升锥形管中。离心收集细胞沉淀，加入淋巴细胞分离液，以分离活细胞与死细胞。

进行延时显微成像时，将1 × 10⁵个CD8阳性T细胞接种于培养基中，并置于37 °C培养箱内。完成整合素阻断后，每10–60秒采集一次明场和荧光图像，持续10–60分钟。在延时成像过程中，与初始T细胞相比，活化的CD8阳性T细胞的平均速度、位移和迂回指数均有所增加。

首先，对从神经元次级淋巴组织中分离的活体T淋巴细胞进行延时成像。进行T细胞迁移分析时，打开Velocity软件并创建一个新的图像序列。将所有延时视频显微镜录像选中并移至Velocity中的蓝色区域。

利用对比度增强工具，调整亮度和对比度。然后将图像大小调整为：20倍放大时0.325微米，10倍放大时0.65微米。配置好时间点序列后，进入“测量”选项卡，并取消勾选所有时间点。

接下来，通过强度识别对象，并将滑块移至峰值右侧。为避免细胞碎片干扰，排除所有直径小于10 µm和大于100 µm的细胞。勾选“忽略静态对象”，然后勾选“自动连接断裂轨迹”。

要保存新方案，请转到“测量”部分，点击“保存方案”，然后选择“命名新方案”。在“测量”标签页中，点击“测量所有时间点”，并按时间跨度从高到低对轨迹进行排序。记录下具有良好轨迹的细胞的轨迹ID编号后，将文件导出为逗号分隔的文本格式，并将数据传输至所需的分析软件。

要进行手动追踪，请打开 ImageJ，进入插件（Plugins）菜单，选择追踪（Tracking）和手动追踪（Manual Tracking）。设置时间间隔、x/y 校准、像素大小和 z 轴校准。然后，单击添加轨迹（Add Track）以开始对单个细胞进行追踪。

在第一个时间点选择一个细胞，并持续追踪该细胞经过所有时间点。最后，点击“End Track”。软件辅助的细胞追踪可表征活化单个T细胞的迁移行为，如不同颜色的线条所示。