基于CRISPR的模块化组装法用于高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库

功能基因组筛选为研究基因功能提供了一种强大的方法，其依赖于全基因组范围质粒文库的构建。传统的质粒文库构建方法耗时且繁琐。为解决这一问题，我们开发了一种简单高效的方案。

基于CRISPR的模块化组装即CRISPR大规模组装。该方法利用CRISPR-Cas9对cDNA或OFSIB中共有的关键序列进行靶向，随后通过组装方式插入UAS模块。此为构建基因组Y质粒文库的操作流程。

根据晶体质量，该方法被标准化为大规模并行的两步反应检测，用于细菌转化前的筛选。晶体质量法能够简单、快速、高效且具有成本效益地构建多种质粒文库。该方法也可广泛应用于各种基因组范围内的质粒文库编辑，是高通量质粒文库编辑中 gateway 技术的一种替代方案，为生物网络的全局性研究奠定了基础。

为了进行基于CRISPR的模块化组装（CRISPR mass）的平行两步试管反应，首先在第一步试管反应中利用CAS9 sgRNA切割cDNA ORF质粒中相同的载体骨架。具体操作如下：将正确标记的0.2毫升离心管置于冰上的铝制冷却块中。通过混合适量的CAS9、sgRNA、CAS9缓冲液和DEPC处理水，为N个反应配制总反应混合液。

将主混合液的各组分加入后，涡旋混匀以确保充分混合。然后离心收集混合液，并将2 µL主混合液分装至每个0.2 mL离心管中。接着，向每管中加入0.4 µL的0.019 µmol/L cDNA或ORF质粒。

将切割反应在 37 摄氏度孵育 1 小时。在以下试管反应的第二步中，将特异性载体 UAS 模块插入到 Cas9 线性化的 cDNA ORF 质粒中。为每个样本设置 1.4 µL 单步反应，请将标记好的 0.2 mL 管置于冰上的铝制冷却块中。

通过混合适量的UAS模块和单步反应组装预混液，为N个反应配制主混合液。充分涡旋振荡混合液后离心，然后将0.77 µL主混合液分装至各管中。向每管中的分装液加入0.7 µL经CAS9线性化处理的cDNA ORF质粒，并在50 °C下孵育反应体系1小时。

为了将通过基于CRISPR的模块化组装获得的UAS cDNA ORF质粒产物转化至大肠杆菌（escherichia coli）中，需将10微升（µL）枪头预先在4摄氏度（°C）冷却。同时，将1.5毫升（mL）离心管置于冰上的铝制冷却块中预冷。将感受态大肠杆菌细胞在冰上解冻5分钟后，取10微升（µL）细胞等分试样加入每个预冷的1.5毫升（mL）离心管中。

然后向每支含有10 µL感受态细胞的离心管中加入1 µL的UAS cDNA ORF质粒产物。轻轻涡旋混匀后，将离心管置于冰上30分钟。随后将离心管放入42 °C水浴中孵育1分钟。

然后立即在冰上冷却两分钟。向每根试管中加入100微升预热至37摄氏度的SOC培养基（在室温下操作），并将试管置于摇床培养箱中，在37摄氏度、250转/分钟的条件下孵育一小时。接下来，将含有抗生素的LB平板（该抗生素对应UAS模块的抗生素抗性基因）预热至37摄氏度。

将细胞均匀涂布于预热的平板上，并在37摄氏度下过夜培养。