为透射电子显微镜制备视网膜类器官样本

我们的研究主要聚焦于分析成熟视网膜类器官中的突触超微结构。我们的目标是建立一种可重复且简便的透射电子显微镜（TEM）样品制备方法，用于视网膜类器官，该方法将极大推动视网膜类器官研究领域的发展。与光学显微镜等技术相比，透射电子显微镜能够在纳米尺度上对视网膜类器官中完整突触的超微结构以及亚细胞结构进行表征和分析。

本方案提供了优化视网膜类器官透射电子显微镜样品制备条件的流程，步骤简洁且易于操作。我们的研究结果清晰地展示了视网膜类器官内突触的超微结构形态，包括常规突触和带状突触。这为后续视网膜类器官的功能研究奠定了坚实基础，并提供了一种可重复的方法。

除了评估临床应用（如跳跃筛查）外，开始对诱导多能干细胞来源的视网膜类器官（ROs）进行前向固定时，使用移液器将培养皿中的一个RO轻轻转移至1.5毫升微量离心管中。借助移液器，从微量离心管中移除培养基，并加入1.5毫升含2%多聚甲醛和2%戊二醛的固定液。

固定类器官后，在进行类器官清洗前，需先去除多聚甲醛-戊二醛固定液。向微量离心管中加入1毫升0.01摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻悬浮类器官，以确保充分洗涤。随后用移液器吸出残留的PBS，并加入约150微升1%的四氧化锇溶液，使组织块完全浸没。

将微量离心管放入暗盒中。开始对固定后的视网膜类器官（retinal organoids 或 ROs）进行透射电子显微镜染色时，使用移液器移除在后固定过程中先前添加到微量离心管中类器官的锇酸。然后，用 pH 7.4 的 0.01 摩尔 PBS 洗涤 ROs 三次，每次 10 分钟，接着用去离子水洗涤三次，每次 10 分钟。

去除最后一次去离子水清洗步骤，加入约150微升醋酸铀，于室温下染色1至2小时。随后，在通风橱中移除醋酸铀，加入1毫升50%丙酮，使样品脱水10分钟。

然后依次使用70%、80%、90%和两次100%丙酮进行梯度脱水，每次10分钟。梯度脱水完成后，弃去残余丙酮，加入约150微升丙酮与Epon-812树脂的混合液。将试管置于37°C烘箱中孵育1小时。

去除先前的丙酮-树脂混合液后，更换为另一种配比的丙酮与Epon-812树脂混合液。此次将试管置于37摄氏度下孵育过夜。最后，小心地将视网膜类器官转移至含有约500微升纯环氧树脂的新试管中。

在进行类器官包埋前，于45摄氏度孵育一小时。开始时，将纯环氧树脂加入包埋模具的凹槽中，至其体积的三分之二处。用牙签挑取视网膜类器官，并将其转移至装有纯环氧树脂的包埋模具中。

然后，用纯环氧树脂填充凹槽，直至其略微突出或隆起。调整类器官在包埋模具两端的位置，以实现定向包埋。将包埋块安装到样品台座上，并使用L型螺丝刀拧紧螺栓。

然后将玻璃刀安装到刀架上，并用手拧紧螺母。修剪掉多余的树脂，直至暴露出目标区域。用清水注满玻璃刀的槽部。

使用半薄切片机切割厚度为一微米的半薄切片，并用针将其置于显微镜载玻片上。加入50微升1%甲苯胺蓝对半薄切片进行染色，然后在加热板上95摄氏度孵育一分钟。用蒸馏水冲洗两分钟。

使用20倍普通光学显微镜观察切片的结构。