脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

激光研究数据正推动着对生物组织光疗或激光辐射的探索，重点关注干细胞的光生物调节在再生治疗中的应用。本研究采用三维细胞培养技术，探究脂肪来源干细胞中的光生物调节作用。近期研究主要集中于将光生物调节与脂肪来源干细胞相结合，用于干细胞再生治疗。

研究表明，光生物调节可增强干细胞的存活率、增殖能力及分化潜能。三维细胞培养技术推动了光生物调节研究的发展，因为三维细胞培养为我们提供了生理上更相关的环境，用于研究细胞行为。本研究证实，在为期10天的培养期间，水凝胶对细胞无细胞毒性作用；尽管处于三维细胞培养环境中，光生物调节仍具有显著的正向增强潜力，并可显著上调脂肪来源间充质干细胞的增殖速率。

本研究的结果将为脂肪来源的间充质干细胞向各种特化细胞类型（尤其是合胞体细胞）分化过程中，标准化光生物调节参数和培养条件的建立奠定基础。首先，将44毫升基础培养基转移至50毫升离心管中。向培养基中加入5毫升10%FBS，然后分别加入0.5毫升青霉素-链霉素和两性霉素B抗生素溶液。

将含有快速葡聚糖溶液的小管在20摄氏度下以1000 G离心30秒。向小管中加入175微升水，以获得30毫摩尔每升的终浓度。以中等速度涡旋振荡试管30秒，直至物质完全溶解。

将溶解的样品置于冰上孵育五分钟。在再次涡旋振荡管内物质之前，先对离心管进行离心。然后将离心管放回冰上，待后续使用。

接下来离心交联剂以浓缩材料。向交联剂小瓶中加入188微升水，使巯基的终浓度为20毫摩尔每升。涡旋混匀交联剂溶液，直至所有物质完全溶解。

孵育后离心管子，然后短暂涡旋振荡，室温放置备用。接着，根据表格中提供的配比，为10微升水凝胶制备脂肪来源干细胞悬液，以配制主混合液。将9微升主混合液转移至96孔联排板的孔中。

三分钟后，向混合物中加入一微升可降解交联剂，以固化凝胶。用移液器将170微升预热的完全培养基加入水凝胶上方。孵育后更换培养基。

首先，设置用于绿色波长的二极管激光器系统。打开激光器电源，并按照建议时长进行预热。待激光器达到稳定状态后，使用激光功率计测量激光器的输出功率。

记录每个波长的功率值。更换完全培养基后，将含有包埋在水凝胶中的脂肪源性干细胞的培养板置于二极管激光系统下。根据所选波长和设定的能量密度，用计算出的激光照射时间对水凝胶进行照射。

确保每个实验组均设有未照射的对照组。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及85%湿度条件下孵育。随后，按1:20的比例将酶法细胞回收液用PBS稀释，以制备工作液。

向每个含有待回收细胞的凝胶或孔中加入 30 µL 工作液。轻轻摇动或旋转培养板，使回收液均匀分布。将培养板与回收液一起孵育 45 分钟。

孵育结束后，小心地将培养板从孵育箱中取出。在20°C条件下，以1,409 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。随后，小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。

将220微升无菌PBS加入沉淀中。充分混匀以获得均一的单细胞悬液。脂肪来源干细胞在接种并接受光生物调节处理后24小时仍保持圆形形态。

细胞以单细胞形式或葡萄串样簇状结构分散于凝胶中。在三维培养中培养10天后，细胞形态保持不变。