Name: 具有光生物调节增强的水凝胶中脂肪来源干细胞的三维细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 了解利用水凝胶三维培养脂肪来源干细胞并结合光生物调节技术促进细胞增殖的方法。该方案为再生医学研究提供了有效的体外培养体系。

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本研究由南非国家研究基金会 Thuthuka 项目资助，资助号 TTK2205035996；非洲激光中心（ALC）由科学与创新部（DSI）资助，资助号 HLHA23X，任务编号 ALC-R007；约翰内斯堡大学研究委员会资助，资助号 2022URC00513；南非科技部南非研究讲席计划（DST-NRF/SARChI）资助，资助号 98337。资助机构在研究设计、数据收集、分析、解释以及论文撰写过程中均未发挥任何作用。作者感谢约翰内斯堡大学（UJ）和激光研究中心（LRC）提供设施与资源支持。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息，请参见材料表。本方案已在图1中以图示形式概括。
1. 二维（2D）细胞培养
注意：永生化ADSCs（1×106 个细胞）保存于含有1 mL细胞冻存液的冻存管中，置于-195.8 °C液氮中。
<ol>
	<li>准备二维细胞复苏培养基和二维培养瓶
	<ol>
		<li>将39 mL基础培养基转移至50 mL离心管中</li>
		<li>向基础培养基中添加20%胎牛血清（FBS；10 mL）和抗生素（1 mL）（0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL两性霉素B）进行富集。</li>
		<li>通过将6 mL细胞复苏培养基转移至T75培养瓶中进行预处理，并在37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育45分钟（可在进行细胞复苏操作的同时完成此步骤以节省时间）。 
		注意：使用前将完全培养基预热至37 °C，4 °C保存时间最长不超过1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维细胞复苏
	<ol>
		<li>从液氮储存罐中取出一支冻存管，在37 °C水浴中快速解冻，直至完全融化。</li>
		<li>将冻存管在离心机中以1006 × g离心5分钟（20 °C），随后弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL预热的细胞复苏培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将重悬的细胞均匀接种至已预处理的培养瓶中（终体积为7 mL），并在37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育。</li>
		<li>24小时后弃去并更换细胞复苏培养基。</li>
		<li>每2–3天更换一次培养基，直至培养瓶中的细胞达到汇合状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维培养瓶细胞收获为单细胞悬液及细胞计数
	<ol>
		<li>从培养箱中取出二维培养瓶，将培养基弃入适当的废液容器中。</li>
		<li>向培养瓶中加入10 mL冲洗液冲洗细胞，以去除残留物和蛋白沉积，随后弃去冲洗液。</li>
		<li>向培养瓶中加入6 mL消化液以使细胞脱落。将培养瓶置于37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育2分钟。 
		注意：在显微镜下观察培养瓶，确认所有细胞均已脱落。若未完全脱落，可轻轻敲击培养瓶并继续孵育1分钟。</li>
		<li>待所有细胞脱落后，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并向管中加入1 mL含20% FBS的细胞复苏培养基，以中和消化液的作用。</li>
		<li>在1711 × g条件下离心5分钟（20 °C）。</li>
		<li>弃去上清液，用1 mL完全培养基重悬细胞。</li>
		<li>取10 µL细胞悬液，置于500 µL微量离心管中，与10 µL台盼蓝按1:1比例混合。</li>
		<li>取10 µL台盼蓝-细胞混合液，重复加入细胞计数板中。</li>
		<li>将细胞计数板放入自动细胞计数仪中。仪器将显示每毫升的总细胞数以及活细胞和死细胞数量。计算平均活细胞密度，并确定需包埋于三维水凝胶中的活细胞数量（见步骤2.2.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维细胞培养
<ol>
	<li>配制3D完全培养基
	<ol>
		<li>将44 mL基础培养基转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>向培养基中添加10%胎牛血清（FBS，5 mL）以及抗生素（1 mL）（0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL两性霉素B）。 
		注意：使用前将完全培养基预热至37 °C，并在4 °C下保存，最长不超过一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制水凝胶
	<ol>
		<li>通过离心（20 °C下，1000 × g 离心30秒）快速葡聚糖小瓶，使材料浓缩。向快速葡聚糖小瓶中加入175 µL水，以获得终浓度为30 mmol/L反应性基团的溶液。</li>
		<li>涡旋含有快速葡聚糖溶液的离心管（中速涡旋30秒），直至材料完全溶解。将溶解后的溶液置于冰上孵育5分钟。离心管短暂离心后，再短暂涡旋，并在后续使用过程中保持在冰上。</li>
		<li>对交联剂进行离心（20 °C下，1000 × g 离心30秒）以浓缩材料。向交联剂小瓶中加入188 µL水，以获得终浓度为20 mmol/L巯基的溶液。</li>
		<li>涡旋含有交联剂溶液的离心管（中速涡旋30秒），直至所有材料完全溶解。将溶解后的交联剂在室温（RT）下孵育5分钟。离心管短暂离心后，再短暂涡旋，并在后续使用过程中保持在室温。</li>
		<li>为降低成本，将水凝胶方案从30 µL调整为10 µL（具体细节见表1）。</li>
		<li>制备细胞悬液，使每10 µL水凝胶中的接种密度达到2.5 × 103个细胞。</li>
		<li>根据表1中的组分配制主混合液。将9 µL主混合液转移至96孔条板的一个孔中。</li>
		<li>在主混合液转移3分钟后，加入1 µL可降解交联剂，使凝胶固化。</li>
		<li>在水凝胶上覆盖170 µL预热的完全培养基，孵育1小时。1小时后更换培养基。 
		注意：包埋于水凝胶中的细胞已在3D培养系统中准备好，可用于后续实验或分析。根据需要遵循相应的下游应用操作流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 光生物调节照射
<ol>
	<li>设置激光器
	<ol>
		<li>为二极管激光系统设置绿色（525 nm）或近红外（825 nm）波长。打开激光器，并按照推荐时长进行预热。</li>
		<li>让激光器达到稳定状态，以稳定其输出功率。这可确保照射的一致性和准确性。</li>
		<li>使用激光功率计测量激光器的输出功率。记录每种波长的功率值。</li>
		<li>使用公式1（激光照射时间）计算激光照射时间。将表2中的数值代入公式1，以确定每种能量密度下的适当照射时间。在公式1中，“r”表示激光照射区域的半径。 
		<img alt="计算功率密度公式，mW/cm² = mW/(π×r²)，用于光学测量。" src="/files/ftp_upload/66616/66616eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1"> 
		<img alt="功率密度换算公式 W/cm² 转 mW/cm²，用于科学计算。" src="/files/ftp_upload/66616/66616eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2"> 
		<img alt="时间计算公式，\( \text{时间 (s)} = \frac{J/\text{cm}^2}{W/\text{cm}^2} \)，用于光子学分析。" src="/files/ftp_upload/66616/66616eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 3"> 
		公式1</li>
		<li>参考表2获取计算所需的特定参数，包括能量密度（5 J/cm² 或 10 J/cm²）和激光输出功率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>照射三维细胞培养物
	<ol>
		<li>在更换完全培养基（步骤2.2.9）后，将含有水凝胶包埋细胞的96孔板置于二极管激光系统下。根据选定的能量密度（5 J/cm² 或 10 J/cm²）和选定波长（绿色或近红外），使用计算出的激光照射时间对水凝胶进行照射。因此，各培养样本仅接受一次剂量照射。</li>
		<li>确保每个实验组均设有对照组（n = 4），即包埋于水凝胶中但未接受光生物调节治疗（PBM）的ADSCs。 
		注意：务必佩戴适用于所用光波长的安全护目镜。激光在安全柜外使用，因此使用前必须对区域进行彻底消毒。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2、85%湿度条件下培养，持续整个实验过程。照射后，分别培养24小时用于第一次分析，或培养10天用于第二次分析阶段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 形态学
<ol>
	<li>倒置光学显微镜
	<ol>
		<li>打开倒置光学显微镜，预热几分钟。确保显微镜已正确对齐并完成校准。</li>
		<li>根据实验设置，将样品制备在显微镜载玻片或专用细胞培养皿上。校准显微镜以获得最佳成像条件。</li>
		<li>根据需要调节焦距、亮度和对比度。在显微镜上选择20x物镜，用于观察和记录细胞形态。</li>
		<li>将样品放置在显微镜载物台上，通过目镜对目标细胞进行调焦。通过目镜或相机视图观察并记录细胞形态，注意细胞的形状、大小及任何显著特征。</li>
		<li>将相机模块连接至显微镜，设置相机以进行数字成像。确保相机与显微镜之间连接正确且通信正常。</li>
		<li>使用20x物镜拍摄所观察细胞的数字图像。通过相机控制调节曝光、焦距及其他相关设置。 
		注意：确保所采集的图像质量高，并能代表细胞形态的典型特征。</li>
		<li>在计算机上启动成像软件，采集图像，并使用软件内的分析工具对细胞形态进行分析。</li>
		<li>根据实验目标，测量细胞尺寸、计数细胞或执行其他相关分析。</li>
		<li>使用软件在图像上添加适当的比例尺。根据显微镜物镜的已知放大倍数，准确表示图像的比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 生物化学检测
<ol>
	<li>细胞回收 
	注意：需要将细胞从水凝胶中以单细胞悬液的形式回收，以便进行后续的下游生化检测。
	<ol>
		<li>准备酶解细胞回收溶液。在无菌环境下，按1:20（溶液：PBS）的比例，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释酶解细胞回收溶液，配制工作液。若需从特定数量的凝胶或孔中回收细胞，请根据每孔凝胶使用30 µL回收溶液计算所需总体积。</li>
		<li>向每个含有待回收细胞的凝胶或孔中加入30 µL工作液。通过轻轻摇动或旋转培养板，确保回收溶液均匀分布。根据推荐的孵育时间将培养板与回收溶液一起孵育。该信息通常可在供应商提供的产品说明书或实验方案中找到。</li>
		<li>孵育结束后，小心将培养板从孵育箱中取出。在1409 × g 条件下离心5分钟（20 °C），使细胞沉淀。请参考产品说明书或实验方案中推荐的离心条件。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
		<li>用220 µL无菌PBS轻柔重悬细胞沉淀。充分混匀，以获得均一的单细胞悬液。此时细胞已准备好用于后续生化检测。请根据目标检测的具体实验方案操作，并考虑回收细胞的特性及实验设置的要求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测
	<ol>
		<li>对于每个孔，小心移除50 µL完全培养基，尽量减少对细胞层的扰动。</li>
		<li>向每个仍含有50 µL培养基的孔中直接加入50 µL细胞毒性试剂。通过上下吹打轻轻混匀，确保样品与试剂充分混合。</li>
		<li>设置阳性对照。使用试剂盒中提供的阳性对照细胞，每50 µL细胞悬液中加入5 µL 10倍浓度裂解液，设置三个重复孔。</li>
		<li>将培养板在推荐的温度和时间条件下孵育。此步骤使细胞毒性试剂裂解细胞，并将LDH释放到培养基中。</li>
		<li>孵育结束后，向每个含有细胞毒性试剂和细胞裂解物的孔中直接加入50 µL终止液。通过上下吹打轻轻混匀，确保反应被有效终止。 
		注意：终止液可阻止LDH的进一步释放，并确保显色反应的稳定性。</li>
		<li>根据仪器制造商的说明设置分光光度计酶标仪。在490 nm波长下读取每个孔的吸光度。该波长专用于检测LDH反应生成的甲臜产物的比色信号。</li>
		<li>从处理组和对照孔的吸光度读数中减去背景值。背景值应来自仅含培养基和细胞毒性试剂但不含细胞的孔。</li>
		<li>分析各样本校正后的吸光度值，以确定细胞毒性水平。较高的吸光度值表明LDH释放增加，即细胞毒性更高。</li>
		<li>为确保统计准确性，每个实验组和对照组均应包含四个重复（见步骤3.2.2）。计算每组及对照的平均吸光度，并将其导入合适的统计分析软件中。</li>
		<li>比较处理组与相应对照组的结果，准确评估细胞毒性效应，并记录所有吸光度读数、计算过程和实验条件，以备后续参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP增殖检测
	<ol>
		<li>在无菌环境下，向每个孔中加入50 µL回收的细胞与50 µL ATP检测试剂混合液。 
		注意：根据孔数和实验设计调整细胞和试剂的体积。为获得准确结果，请保持一致的配比。</li>
		<li>将培养板置于摇床上，在避光条件下剧烈振荡5分钟，以确保细胞与试剂充分混匀。振荡结束后，在室温下额外孵育25分钟。此孵育过程可使试剂裂解细胞，并产生与ATP含量成正比的发光信号。</li>
		<li>根据制造商说明设置酶标仪用于发光检测。测量每个含有细胞裂解物和ATP检测试剂孔的发光值。确保酶标仪已设定为合适的发光检测参数。</li>
		<li>从处理组和对照孔的发光读数中减去背景值。背景值应来自仅含ATP检测试剂和PBS但不含细胞的孔。</li>
		<li>分析各样本校正后的发光值，以确定ATP水平，反映细胞增殖或活力状态。</li>
		<li>为确保统计准确性，每个实验组和对照组均应包含四个重复（见步骤3.2.2）。计算每组及对照的平均发光值，并将其导入合适的统计分析软件中。</li>
		<li>比较处理组与相关对照组的结果，准确评估ATP增殖情况。记录所有发光读数、计算过程和实验条件，以备后续参考。 
		注意：对于所有以试剂盒形式进行的生化分析，请遵循制造商提供的试剂盒说明书或实验方案中的具体细节，例如推荐的孵育时间、浓度以及任何额外步骤或注意事项。处理化学品和生物材料时，务必遵守实验室安全规范。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Photobiomodulation Growth Augmentation of Hydrogel Embedded Stem Cells 

<ol><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+improving+adipose-derived+stem+cells+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+Trauma%22%5BJournal%5D)">Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration.</a> Burns Trauma. 10, (2022).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+embedded+in+an+injectable+thermosensitive+hydrogel%3A+An+in+situ+drug+formation+platform+for+accelerated+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing.</a> ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensitive+injectable+chitosan%2Fcollagen%2F%CE%B2-glycerophosphate+composite+hydrogels+for+enhancing+wound+healing+by+encapsulating+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids.</a> ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).</li>
<li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+direct+regeneration+versus+paracrine+effects+of+human+cardiosphere-derived+cells+transplanted+into+infarcted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice.</a> Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).</li>
<li>Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+3d+culture+of+human+adipose-derived+stem+cells+in+an+in-situ+crosslinked+hybrid+hydrogel+composed+of+peg-based+hyperbranched+copolymer+and+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid.</a> Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32(2013).</li>
<li>Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+and+survival+in+the+ischemic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart.</a> The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).</li>
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<li>Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+hydrogels+for+in+vitro+3d+ovarian+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3265(2022).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

脂肪来源干细胞（ADSCs）是再生医学中理想的细胞类型，因其可促进多种过程以辅助伤口愈合3,4。然而，仍存在若干需要克服的挑战，例如细胞在损伤部位的存活率低以及移植效果不佳9。本研究采用永生化细胞作为商业化细胞系，因其相比原代细胞可进行更多代次的传代，无需反复分离获取，且具有明确的特性以及均一的细胞群体，从而确保实验结果的一致性31。本研究旨在利用三维细胞培养技术，评估光生物调节（PBM）对ADSCs增殖能力及细胞毒性的增强潜力。根据制造商提供的30 µL水凝胶操作方案，本研究将其调整为10 µL以降低成本32。然而，体积的减少使得凝胶的制备与操作更为困难。
ADSCs 已被证明可在三维环境中自我聚集33同样，在本研究中，细胞形成了具有葡萄状外观的细胞聚集体，但也观察到单层细胞的存在。细胞脱落是球状体已知的特性，表现为细胞从主要的球状体或聚集体上脱离并释放到培养环境中。细胞脱落可源于细胞增殖，即在有丝分裂过程中，活细胞被释放，从而实现迁移。34或者，脱落可能是由于细胞死亡以及类球体或聚集体形态的丧失所致35，尤其是在较大的类球体中，由于坏死核心的增大所致。与二维培养中的梭形形态相比，细胞在三维培养中呈现圆形形态。与类似研究的结果一致，这些现象是由于细胞缺乏附着位点或可附着的细胞外基质所致6,9此外，细胞在凝胶中未表现出显著迁移，进一步提示需要附着位点36建议添加黏附肽或其他细胞外基质蛋白，以促进细胞的贴附、黏附和迁移。本研究的局限性在于使用倒置光学显微镜观察ADSCs的三维形态，而非采用Z轴层扫成像。PBM照射及三维培养在照射后24小时和10天均未对ADSCs的细胞毒性产生显著影响，表明水凝胶培养和PBM具有安全性，对细胞无不良影响。6,26在三维细胞培养中，脂肪来源干细胞（ADSCs）的增殖速率较二维细胞培养更慢。本研究中正常对照组较低的增殖率为此提供了支持证据。6PBM（525 nm 和 825 nm）显著提高了三维培养条件下ADSCs的增殖速率。最初，5 J/cm²剂量的绿光（525 nm）在两个时间点均表现出促进作用。2 和 10 J/cm2 与近红外光（825 nm）相比，fluences 在早期诱导了最高的增殖率。然而，在第10天时，近红外光（825 nm）在两种 5 J/cm 条件下均表现出最高的增殖率2 和 10 J/cm2 增殖率。类似地，PBM（525 nm 和 825 nm）已被证明可提高二维培养中的细胞增殖速率37建议同时包含波长组合组，因为其他研究已报道绿光和近红外光具有协同效应。
综上所述，所使用的水凝胶是一种合成水凝胶，具有极强的可定制性，能够满足不同应用的需求。本研究已证实，该凝胶在10天培养期间对细胞无细胞毒性作用。此外，尽管处于三维培养环境中，PBM仍表现出显著促进间充质干细胞（ADSCs）增殖的正向增强潜力。因此，这种水凝胶可作为伤口移植的潜在生物材料载体。未来的研究应致力于通过动物实验评估该凝胶在促进伤口愈合方面的潜在能力。若动物试验结果理想，则有望在临床应用中采集患者来源的ADSCs，将其包封并与PBM联合处理后再移植至伤口，以促进伤口愈合。

ADSCs 是具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的间充质多能祖细胞。这些细胞可在脂肪抽吸术过程中从脂肪组织的基质血管组分（SVF）中分离获得。1脂肪源性干细胞（ADSCs）因其来源丰富、获取过程微创、易于获取且特性明确，已成为再生医学中理想的干细胞类型。2干细胞治疗通过促进细胞迁移、增殖和新生血管形成，并减轻伤口内的炎症反应，为伤口愈合提供了一种可能的途径。3,4大约80%的ADSCs再生能力归因于其分泌组介导的旁分泌信号传导5此前有研究提出，将干细胞或生长因子直接局部注射到受损组织中，可引发足够的反应 体内 修复机制6,7,8然而，这种方法面临若干挑战，例如由于炎症环境导致干细胞在受损组织中的存活率低下以及移植效率降低 9此外，其中一个被提及的原因是缺乏细胞外基质来支持移植细胞的存活与功能10为应对这些挑战，目前的研究重点已转向开发生物材料载体，以支持干细胞的存活与功能。
三维（3D）细胞培养增强细胞间及细胞与基质间的相互作用 体外 提供一个更接近真实情况的环境 体内 环境11水凝胶作为一类生物材料载体已被广泛研究，可为干细胞培养提供三维环境。这些结构由水和交联聚合物构成。12水凝胶包封ADSCs在培养过程中对细胞几乎无细胞毒性，同时可维持细胞活力6三维培养的干细胞表现出更强的干性维持能力和更优的分化潜能13类似地，在动物模型中，接种于水凝胶的脂肪来源间充质干细胞表现出更高的存活率和更快的伤口闭合速度14此外，水凝胶包封显著提高了ADSCs在伤口中的定植和滞留15,16TrueGel3D 由一种聚合物（聚乙烯醇或葡聚糖）制成，并通过交联剂（环糊精或聚乙二醇）固化。17该凝胶是一种合成水凝胶，不含任何可能干扰实验或在将凝胶移植到患者体内时引发免疫反应的动物源成分，同时能有效模拟细胞外基质18通过调整凝胶的成分和各个组分，可实现高度定制化。该凝胶可容纳不同类型的干细胞，并通过调节凝胶刚度支持多种细胞类型的分化19. 可通过添加多肽来创建附着位点20该凝胶可被金属蛋白酶的分泌降解，从而允许细胞迁移21最后，该材料透明，可适用于成像技术。
PBM 是一种微创且易于操作的低强度激光疗法，用于刺激细胞内发色团。不同波长对细胞产生不同的效应。22红光至近红外光范围内的光照通过增强电子传递链的通量，刺激三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）生成增加。23蓝光和绿光范围内的光照可激活光敏离子通道，促使钙、镁等阳离子非特异性地进入细胞，已知这一过程可促进细胞分化。24其净效应是产生第二信使，进而促进转录因子的表达，触发细胞迁移、增殖和分化等下游细胞过程。25PBM可用于在将细胞移植到不利环境（如受损组织）之前，对细胞进行预处理以促进其增殖或分化26移植前后对ADSCs进行PBM（630 nm和810 nm）照射显著增强了这些细胞的存活率和功能 体内 在糖尿病大鼠模型中27再生医学需要足够数量的细胞以有效修复组织28在三维细胞培养中，与二维细胞培养相比，脂肪源性干细胞（ADSCs）的增殖速率较慢。6然而，PBM 可通过增强细胞活力、增殖、迁移和分化能力，用于优化 ADSCs 的三维细胞培养过程。29,30.

<table><tbody><tr><td>525 nm 二极管激光器</td><td>National Laser Centre of South Africa</td><td>EN 60825-1:2007</td><td></td></tr><tr><td>825 nm 二极管激光器</td><td>National Laser Centre of South Africa</td><td>SN 101080908ADR-1800</td><td></td></tr><tr><td>96 孔条板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR782301</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>抗生素（0.5%；0.5 mL）</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>ATP 试剂，增殖检测试剂盒</td></tr><tr><td>Corning 2 mL 外螺纹聚丙烯冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>冻存管</td></tr><tr><td>CryoSOfree</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9249</td><td>细胞冻存培养基</td></tr><tr><td>CytoTox96 非放射性细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td>细胞毒性试剂</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>基础培养基（39 mL/44 mL）</td></tr><tr><td>FieldMate 激光功率计</td><td>Coherent</td><td>1098297</td><td></td></tr><tr><td>Corning 平底 96 孔透明聚苯乙烯板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td>培养基添加剂（5 mL；10% / 10 mL；20%）</td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td>冲洗液</td></tr><tr><td>Heracell 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026280</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Labofuge 400</td><td>Thermo Scientific</td><td>75008371</td><td>用于 96 孔板的板式离心机</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R 离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75004270</td><td></td></tr><tr><td>永生化 ADSCs</td><td>ATCC</td><td>ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000</td><td>第 37 代</td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX2000</td><td>台盼蓝自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>Julabo TW20 水浴锅</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615501</td><td>用于将培养基加热至 37 &amp;deg;C 的水浴锅</td></tr><tr><td>Olympus CellSens Entry</td><td>Olympus</td><td>Version 3.2 (23706)&amp;nbsp;</td><td>成像软件：数字图像采集</td></tr><tr><td>Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>SN9B02019</td><td>倒置光学显微镜</td></tr><tr><td>Olympus SC30 相机</td><td>Olympus</td><td>SN57000530</td><td>连接至倒置光学显微镜的相机</td></tr><tr><td>Corning 不透光 96 孔实心聚苯乙烯微孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3912</td><td>用于 ATP 发光检测的不透光孔</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>抗生素（0.5%；0.5 mL）</td></tr><tr><td>SigmaPlot 12.0</td><td>Systat Software Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrueGel3D &amp;ndash; True3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRUE3-1KT</td><td>10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>TrueGel3D 酶法细胞回收溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRUEENZ</td><td>01:20</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>Thermo Fisher - Invitrogen</td><td>T10282</td><td>0.4% 溶液</td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（1x）</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>Victor Nivo 酶标仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH3522019094</td><td>分光光度酶标仪</td></tr></tbody></table>

脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

Three&#45;Dimensional Cell Culture of Adipose-Derived Stem Cells in a Hydrogel with Photobiomodulation Augmentation

脂肪来源的干细胞（ADSCs）具有类似于干细胞的多能间充质特性，因其能够向多种细胞类型分化，并促进细胞迁移、增殖以及减轻炎症反应，故常被用于再生医学。然而，ADSCs在伤口中的存活和定植常面临挑战，主要原因是局部存在不利的炎症环境。为解决这一问题，已开发出可维持ADSC在伤口中活性的水凝胶，以加速伤口愈合过程。本研究旨在评估光生物调节疗法（PBM）在三维细胞培养体系中对ADSC增殖及细胞毒性的协同影响。将永生化ADSC以2.5 × 103个细胞的密度接种于10 µL水凝胶中，并使用波长为525 nm和825 nm的二极管光源，以5 J/cm2和10 J/cm2的能量密度进行照射。在PBM处理后24小时和10天分别评估细胞形态变化、细胞毒性和增殖情况。结果显示，ADSC呈现圆形形态，以单个细胞或球状聚集体的形式均匀分布于凝胶中。重要的是，PBM与三维培养体系均未对细胞产生细胞毒性作用，且PBM显著提高了ADSC的增殖速率。综上所述，本研究证实水凝胶可作为ADSC三维培养的适宜环境，并提出PBM是一种有效的增强策略，尤其可缓解三维细胞培养中常见的增殖缓慢问题。

为评估水凝胶的形态并直观检查细胞密度，采用倒置显微镜进行观察（图2）。接种并接受PBM照射后24小时，ADSCs仍保持圆形形态。细胞以单细胞或葡萄串样簇状结构分散分布于凝胶中。在三维培养10天后，细胞形态未发生明显改变。实验组与对照组之间，以及不同实验组之间，均未观察到形态学上的显著差异。
为评估光生物调节（PBM）照射及使用水凝胶进行三维培养的细胞毒性效应，检测了乳酸脱氢酶（LDH）的释放量（图3）。在24小时或10天时，实验组与对照组之间均无显著差异，表明PBM照射和水凝胶培养对细胞无不良影响。
通过测定ADSCs的ATP含量来测量细胞增殖速率（图4PBM照射导致所有实验组的细胞增殖率均高于对照组。在PBM照射后24小时，525 nm波长刺激产生的增殖率最高；然而，在照射后10天时，825 nm波长的增殖率优于525 nm波长。. 在10天培养期结束时，825 nm、10 J/cm²2 该组表现出最高的增殖率。
<img alt="水凝胶制备、PBM照射、检测；聚合物、显微镜、细胞毒性、增殖。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验方案概览。 本图概括了实验流程，重点展示在96孔板中制备水凝胶、PBM照射，以及在PBM照射后24小时和10天进行细胞形态学和生化检测的步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态、显微镜图像、60 μm 比例尺、用于分析细胞结构变化的实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：接种后 ADSCs 自发聚集。 细胞保持圆形至椭圆形形态，在水凝胶中以单个细胞或呈葡萄串样簇状聚集的形式分布，在接种并接受 PBM 照射后（A）24 小时和（B）10 天时均可观察到。培养 10 天后未见明显变化。对照组分别为（1 和 4）、525 nm 波长下 5 J/cm2（2）和 10 J/cm2（5），或 825 nm 波长下 5 J/cm2（3）和 10 J/cm2（6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="LDH酶活性，显示不同光照处理随时间变化在490 nm处吸光度的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用水凝胶中525 nm和825 nm二极管（5 J/cm2 和 10 J/cm2）照射后24小时及10天的细胞LDH泄漏量作为细胞毒性的测量指标。 与实验对照组相比，未观察到细胞毒性显著增加。阳性对照代表完全的细胞死亡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ATP 发光柱状图；525 nm 和 825 nm 随时间的影响；光子数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用水凝胶中 525 nm 和 825 nm 激光二极管（5 J/cm2 和 10 J/cm2）照射后 24 小时及 10 天，以细胞内 ATP 水平作为增殖程度的检测指标。 在两个时间点和两种能量密度下，所有实验组经 PBM 照射后均表现出增殖率升高。显著性差异（P &lt; 0.001）以 *** 表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每孔体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLO-Dextran 聚合物 (30 mmol/L)</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞悬液</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>交联剂</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：水凝胶（10 µL）试剂体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>激光参数</td>
			<td>绿色 (G)</td>
			<td>近红外 (NIR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光源</td>
			<td>二极管激光器</td>
			<td>二极管激光器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>波长 (nm)</td>
			<td>525</td>
			<td>825</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>输出功率 (mW)</td>
			<td>553</td>
			<td>515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>功率密度 (mW/cm2)</td>
			<td>57.48</td>
			<td>53.53</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：激光参数。

本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。

脂肪来源的干细胞（ADSCs）具有类似于干细胞的多能间充质特性，常被用于再生医学……

激光研究数据正推动着对生物组织光疗或激光辐射的探索，重点关注干细胞的光生物调节在再生治疗中的应用。本研究采用三维细胞培养技术，探究脂肪来源干细胞中的光生物调节作用。近期研究主要集中于将光生物调节与脂肪来源干细胞相结合，用于干细胞再生治疗。研究表明，光生物调节可增强干细胞的存活率、增殖能力及分化潜能。三维细胞培养技术推动了光生物调节研究的发展，因为三维细胞培养为我们提供了生理上更相关的环境，用于研究细胞行为。本研究证实，在为期10天的培养期间，水凝胶对细胞无细胞毒性作用；尽管处于三维细胞培养环境中，光生物调节仍具有显著的正向增强潜力，并可显著上调脂肪来源间充质干细胞的增殖速率。本研究的结果将为脂肪来源的间充质干细胞向各种特化细胞类型（尤其是合胞体细胞）分化过程中，标准化光生物调节参数和培养条件的建立奠定基础。首先，将44毫升基础培养基转移至50毫升离心管中。向培养基中加入5毫升10%FBS，然后分别加入0.5毫升青霉素-链霉素和两性霉素B抗生素溶液。将含有快速葡聚糖溶液的小管在20摄氏度下以1000 G离心30秒。向小管中加入175微升水，以获得30毫摩尔每升的终浓度。以中等速度涡旋振荡试管30秒，直至物质完全溶解。将溶解的样品置于冰上孵育五分钟。在再次涡旋振荡管内物质之前，先对离心管进行离心。然后将离心管放回冰上，待后续使用。接下来离心交联剂以浓缩材料。向交联剂小瓶中加入188微升水，使巯基的终浓度为20毫摩尔每升。涡旋混匀交联剂溶液，直至所有物质完全溶解。孵育后离心管子，然后短暂涡旋振荡，室温放置备用。接着，根据表格中提供的配比，为10微升水凝胶制备脂肪来源干细胞悬液，以配制主混合液。将9微升主混合液转移至96孔联排板的孔中。三分钟后，向混合物中加入一微升可降解交联剂，以固化凝胶。用移液器将170微升预热的完全培养基加入水凝胶上方。孵育后更换培养基。首先，设置用于绿色波长的二极管激光器系统。打开激光器电源，并按照建议时长进行预热。待激光器达到稳定状态后，使用激光功率计测量激光器的输出功率。记录每个波长的功率值。更换完全培养基后，将含有包埋在水凝胶中的脂肪源性干细胞的培养板置于二极管激光系统下。根据所选波长和设定的能量密度，用计算出的激光照射时间对水凝胶进行照射。确保每个实验组均设有未照射的对照组。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及85%湿度条件下孵育。随后，按1:20的比例将酶法细胞回收液用PBS稀释，以制备工作液。向每个含有待回收细胞的凝胶或孔中加入 30 µL 工作液。轻轻摇动或旋转培养板，使回收液均匀分布。将培养板与回收液一起孵育 45 分钟。孵育结束后，小心地将培养板从孵育箱中取出。在20°C条件下，以1,409 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。随后，小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将220微升无菌PBS加入沉淀中。充分混匀以获得均一的单细胞悬液。脂肪来源干细胞在接种并接受光生物调节处理后24小时仍保持圆形形态。细胞以单细胞形式或葡萄串样簇状结构分散于凝胶中。在三维培养中培养10天后，细胞形态保持不变。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

具有光生物调节增强的水凝胶中脂肪来源干细胞的三维细胞培养

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构建双层水凝胶以调控ASC分化

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使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

本文介绍了一种用于包封消耗脂肪以产生热量的分解代谢细胞的实验方案，这些细胞存在于腹腔内脂肪组织中，并可在肥胖小鼠中增加能量消耗。...

包封产热型前脂肪细胞并移植至脂肪组织库

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。...

光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。...

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本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。...

大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

异源性（化学或动物来源）产品在细胞治疗制备/操作步骤中的引入，与宿主患者免疫反应性增加及病原体传播风险升高相关。本文介绍一种完全无异源成分的细胞分离与 体外...

一种用于人类治疗的无异种来源创新方法分离与培养人脂肪源性干细胞

机械分离的基质血管组分（SVF）与纤维蛋白水凝胶联用，可为具有多种适应症的活性脂肪来源基质细胞提供一种简便且高效的载体，适用于组织工程或伤口愈合等用途。本文介绍了一种用于转化研究和临床应用的机械法SVF（mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建物的制备方法。...

机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

了解利用水凝胶三维培养脂肪来源干细胞并结合光生物调节技术促进细胞增殖的方法。该方案为再生医学研究提供了有效的体外培养体系。

脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

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