幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑

我的研究涉及探索胶质细胞在依赖经验的关键期突触重塑中的作用。我正在明确胶质细胞在突触修剪中的功能，特别是在关键期内，以及介导经验驱动突触修剪的神经元-胶质细胞间通讯机制。我们的实验方案利用了果蝇遗传学的强大能力，以解析其中的分子机制。

为了研究基因与环境的相互作用，我们可以在一个短暂且定义明确的关键期中，精确调控气味的浓度、持续时间和作用时机。该方案在诱导突触重塑方面具有极高的灵活性。我们的研究结果建立了一个优良的模型，适用于遗传和药物干预，有望在成年期重新开启类似关键期的可塑性，这一方向对于损伤、创伤及神经系统疾病的治疗具有重大研究价值。

首先，取一支装有果蝇幼虫的小瓶。使用细小的画笔，将40至50只颜色非常深的蛹挑选至含有标准玉米粉-糖蜜培养基的聚苯乙烯果蝇小瓶中。在果蝇小瓶的开口端覆盖一层细的不锈钢丝网，以防止果蝇逸出，同时保证良好的空气流通。

用透明胶带将金属网盖固定在小瓶侧面。然后在1.5毫升离心管中加入1毫升100%矿物油或溶于矿物油中的EB。将这些离心管直立放置于一个3,700毫升的Glasslock容器中。

使用胶带将试管与果蝇小瓶一起固定在气味室中央。将密封的对照载体和含有蛹小瓶的EB气味室置于湿润培养箱中，保持12小时光照与12小时黑暗的循环条件。在气味室暴露4小时后，迅速将20至25只新羽化的果蝇转移到含有新配制气味剂的培养室中的新鲜果蝇小瓶内。

将果蝇置于密封的气味室中，在培养箱内共孵育24小时。首先，取经矿物油和EB处理24小时的黑腹果蝇（Drosophila）。将试管标记为溶剂对照组或EB暴露组，并在后续的脑组织解剖和处理过程中始终保持这些标识。

用镊子将一只麻醉的果蝇转移至盛有新鲜配制 PBS 的小培养皿中。将果蝇完全浸入 PBS 中，以进行完整的脑解剖。然后将果蝇腹面朝上放置。

用两把精细打磨的镊子，一把夹住胸部上部，另一把夹住吻下方的头部。向相反方向拉动头部与身体其余部分，以分离头部。确保头部顺利与胸部脱离，并保留分离的头部用于解剖。

将先前用于夹住胸部的镊子滑至喙的另一侧下方。轻轻向相反方向拉动外骨骼角质层，使其在两眼之间撕裂，从而暴露脑组织。继续清除头部的外骨骼角质层，确保完全去除所有部分。

现在用 PBS 和 0.2% Triton X-100 冲洗 P20 移液器吸头。解剖后立即将脑组织转移至带盖试管中的固定液中。首先，取一张载玻片，并在其上粘贴两条细的双面胶带，以准备成像。

在用于脑组织固定的两片胶带之间加入约10至15微升封片介质。使用预先用PBS和0.2%Triton X-100冲洗过的P20移液枪头，将标记好的黑腹果蝇（Drosophila）脑组织转移至显微镜载玻片上。脑组织转移完成后，用细毛刷调整其位置，确保触角叶朝上。

将脑组织定位后，盖上玻璃盖玻片，然后在盖玻片四周补充封片介质。用透明指甲油密封盖玻片边缘。

彻底干燥载玻片后，将其存放于冰箱中以备后续成像。使用配备63倍油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。采用氩离子488和氦氖543激光器对触角叶突触小球及Or42a嗅觉感觉神经元进行成像。

确定两个通道的最佳增益和偏移。将成像位置调整至脑部中心，并聚焦于位于脑部中央孔洞附近的大约位置的VM7嗅小球。选择1024×1024的成像分辨率。

捕获贯穿触角叶的完整共聚焦Z轴层扫投影，以确保完全覆盖VM7嗅小球中Or42a神经元的全部神经支配。将基因型或条件设盲的图像载入Fiji。为分离激光通道，请前往图像菜单，点击颜色，然后选择拆分通道。

在 Or42a 嗅觉感觉通道中，滚动 Z 层切片以确定哪些切片包含 Or42a 神经元的神经支配，识别荧光的起始和终止位置。要创建仅包含 Or42a 神经元神经支配切片的最大密度投影，请点击图像，进入堆栈，然后点击 Z 投影，选择部分切片，并输入所需的范围。

使用 Fiji 中的套索工具勾勒 VM7 小球中 Or42a 神经元支配的轮廓。将所勾勒区域的周长乘以 Z 轴堆栈切片的数量以及每个切片的厚度，以计算 VM7 突触小球的支配体积。在暴露于对照气味和溶剂 24 小时后，双侧天线叶的 VM7 小球中仍持续存在密集的 Or42a mCD8-GFP 支配。

相比之下，暴露于25% EB气味剂24小时会导致明显的突触小球修剪及突触小球体积的显著减少。增加EB气味剂浓度会逐步加剧突触小球的修剪程度。针对该EB气味剂浓度范围的代表性定量分析在荧光强度和神经支配体积方面显示出类似结果。