Name: 早期关键时期少年脑嗅觉感觉神经元突触连接的经验依赖性重塑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 探索胶质细胞在果蝇关键期嗅觉经验依赖性突触重塑中的作用机制。本研究利用Drosophila模型，通过精确控制气味暴露诱导突触修剪，为成年期重新开启关键期样可塑性提供潜在治疗策略。

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感谢Broadie实验室其他成员的宝贵意见。图示使用BioRender.com制作。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为MH084989和NS131557，授予K.B.。

1. 气味物质暴露
<ol>
	<li>使用细毛刷将40–50只发育至预蛹期深色蛹阶段的动物（25 °C条件下化蛹后90小时以上）挑选至25 mm × 95 mm的聚苯乙烯培养皿中 果蝇 含有标准玉米粉糖蜜培养基的离心管（图1A).</li>
	<li>将细的不锈钢丝网放置在末端 果蝇 小瓶用于盛放果蝇，同时确保良好的空气流通。用透明胶带将金属网盖固定在小瓶侧面。 黑腹果蝇 小瓶</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 100%矿物油（溶剂对照），或在另一管中将丁酸乙酯（EB）气味剂溶于矿物油，配制成所需浓度（例如15%（150 µL）或25%（250 µL））。</li>
	<li>将溶剂对照或气味剂微量离心管直立放置于一个密封的3700 mL Glasslock玻璃容器内。使用胶带将管子与气味室中心处的 果蝇 小瓶（图1B).</li>
	<li>将密封的对照载体和含有不同发育阶段的EB气味物质的容器放置 果蝇 将蛹前期小瓶置于湿度控制（70%）、温度控制（25 °C）的培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件。</li>
	<li>在气味室暴露4小时后移除新羽化的果蝇，并迅速将20–25只果蝇转移至新鲜的 果蝇 小瓶置于含有新配制气味物质的腔室中图1A，B）。丢弃未封闭的蛹。</li>
	<li>将果蝇置于密封的气味室中，在培养箱内孵育总共24小时。如需更长时间的气味处理，迅速将果蝇转移至新的气味室 果蝇 每24小时将小瓶转移至新配制的气味剂室中。</li>
	<li>将处于特定发育阶段的果蝇浸入盛有70%乙醇的培养皿中1分钟，以麻醉果蝇，为立即进行脑解剖和免疫细胞化学处理做准备。</li>
</ol>
2. 脑组织解剖
<ol>
	<li>将离心管标记为溶剂对照组（仅含100%矿物油）或EB暴露组（% EB），并从脑组织解剖到后续处理的整个过程中始终保持该标记。每种基因型/气味刺激条件下处理10–20只动物。</li>
	<li>用镊子将一只麻醉后的果蝇转移至盛有新鲜配制的磷酸盐缓冲液（PBS）13的小培养皿中。将果蝇完全浸入PBS中，并在液体下完成整个脑组织的解剖操作。</li>
	<li>双手各持一把精细（#5）尖头镊子，将果蝇腹面朝上放置，用一把镊子夹住胸部上部，另一把镊子夹住喙下方的头部区域。注意不要刺穿脑组织。</li>
	<li>双手向相反方向轻轻拉扯，使头部与身体分离。头部应能轻松从胸部脱离；将分离出的头部分离后用于下一步解剖（图1C）。</li>
	<li>将之前夹持胸部的镊子滑至喙的另一侧下方。开始向相反方向轻轻拉扯外骨骼角质层，使其在两眼之间裂开，从而暴露脑组织。</li>
	<li>在拉扯过程中，脑的视叶可能随外骨骼一同被撕离。为避免此情况，在去除外骨骼角质层时应使用两把镊子缓慢而稳定地施力（图1C，中图）。</li>
	<li>继续从头部去除全部外骨骼角质层，确保所有外骨骼碎片均被清除。同时去除附着在脑组织上的其他组织，包括脂肪体和任何延伸的气管。</li>
	<li>为防止粘连，先用含0.2% Triton-X 100的PBS（PBST）冲洗P20移液器吸头。解剖完成后立即转移脑组织至固定液（4%多聚甲醛（PFA）+ 4%蔗糖）中，置于带盖离心管内（图1C、D）。</li>
</ol>
3. 脑免疫细胞化学
<ol>
	<li>在室温（RT）下，以翻转混匀方式固定脑组织 30 分钟。保持脑组织在离心管中，用移液器吸除固定液并妥善处理危险废液。用 PBS 快速洗涤固定后的脑组织 3 次（图 1D）。</li>
	<li>旋转后脑组织常会粘附在离心管盖上。为防止在转移过程中意外丢失脑组织（这是所有转移操作中的常见风险），移液时应使用解剖显微镜观察。</li>
	<li>为进行抗体标记，将固定后的脑组织在含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.5% 正常山羊血清（NGS）的 PBST 中，于室温（RT）封闭 1 小时，同时持续翻转混匀（图 1D）。</li>
	<li>吸除封闭液，加入用 PBST 配制并适当稀释的一抗溶液，使脑组织在其中孵育。于 4 °C 下持续旋转孵育过夜（14–16 小时）。 
	注意：所用一抗示例：大鼠抗 CadN 抗体（稀释比例 1:50）14 用于标记突触小球，鸡抗 GFP 抗体（1:1000）8 用于标记 Or42a-mCD8::GFP（图 1D）。</li>
	<li>吸除一抗溶液，用 PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 20 分钟。随后在含 0.2% BSA 和 0.1% NGS 的 PBST 中加入适当稀释的二抗，于室温下持续旋转孵育 2 小时。 
	注意：也可选择在 4 °C 下过夜（14–16 小时）孵育。二抗稀释于含 0.2% BSA 和 0.1% NGS 的 PBST 中；本实验所用二抗为：488 标记的山羊抗鸡 IgG（1:250）和 546 标记的山羊抗大鼠 IgG（1:250）。</li>
	<li>吸除二抗溶液，用 PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 20 分钟。最后用 PBS 洗涤脑组织 20 分钟（图 1D）。</li>
	<li>准备玻璃载玻片（75 mm × 25 mm），在载玻片上粘贴两条双面胶带，两条胶带间距约为 25 mm。此间隔可防止压碎脑组织。</li>
	<li>在两条胶带之间滴加约 10–15 µL 封片介质以承载脑组织。使用预先用 PBST 冲洗过的 P20 移液器吸头，将标记好的脑组织转移至载玻片上（图 1E）。</li>
	<li>脑组织转移完成后，使用细毛刷调整其位置，确保触角叶朝上。寻找具有拱形隆起的一侧，该侧即含有触角叶。</li>
	<li>待脑组织正确取向后，盖上盖玻片（No. 1.5H），确保盖玻片牢固地粘附在胶带上。然后在盖玻片四周补充封片介质（图 1E）。</li>
	<li>用透明指甲油密封盖玻片边缘。让载玻片充分干燥后，置于冰箱中保存，以备后续成像使用。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像
<ol>
	<li>在成像前，对所有脑切片的基因型和实验条件进行盲法处理，通过标记编码标签以便后续解码。</li>
	<li>使用配备63倍油镜的激光扫描共聚焦显微镜。本文所有图像均使用蔡司510 META显微镜采集（图1F）。</li>
	<li>根据所用荧光染料选择合适的激光谱线。此处使用氩离子488 nm和氦氖543 nm激光，用于触角叶突触小球和Or42a嗅觉感觉神经元成像（图2）。</li>
	<li>确定两个通道的最佳增益和偏移值，理想情况下两个通道的增益应&#60;750，偏移值≈0。此设置旨在保证信噪比最优的同时限制背景信号。</li>
	<li>将成像区域定位至脑中心。成像时，VM7小球位于解剖过程中移除食道后在脑中央留下的孔洞附近（图2A）。 
	注意：VM7小球始终靠近食道开口位置。然而，其确切位置和大小会因脑组织解剖和封片操作的差异而略有不同，成像时需考虑此因素。</li>
	<li>选择成像分辨率和光学切片厚度。此处采用1024 × 1024分辨率，Z轴堆栈切片厚度为0.37 µm。</li>
	<li>对整个触角叶进行共聚焦Z轴堆栈投影成像，确保完整捕获Or42a神经元在VM7小球中的全部神经支配区域。</li>
</ol>
5. 突触测量
<ol>
	<li>将基因型/条件设盲的图像载入 Fiji 软件（1.54f）。通过点击 图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道，分离激光通道。</li>
	<li>在 Or42a 嗅觉感觉通道中，通过浏览整个 Z 轴层叠图像，确定哪些切片包含 Or42a 神经支配，识别荧光信号的起始与终止位置。</li>
	<li>仅选取包含 Or42a 神经元支配的切片，创建最大强度投影图像：点击 图像 &#62; 图像栈 &#62; Z 轴投影 &#62; 求和切片，并输入所需的切片范围。</li>
	<li>在 Fiji 中，点击顶部工具栏的 套索 工具，勾勒 VM7 小球中 Or42a 神经元支配的轮廓，对每侧大脑的小球独立处理（图 3）。</li>
	<li>将轮廓周长乘以 Z 轴层叠图像的切片数量及每片厚度，计算 VM7 突触小球的神经支配体积。为定量突触数量，可在划定区域内使用“寻找最大值”工具，并结合“寻找最大值图像栈”宏，计数突触 puncta8,15。</li>
</ol>

Olfactory Experience-Induced Synaptic Remodeling in Drosophila's Juvenile Brain

<ol><li>English, S., Barreaux, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+sensitive+periods+in+development%3A+insights+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Behav+Sci%22%5BJournal%5D)">The evolution of sensitive periods in development: insights from insects.</a> Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).</li>
<li>Fabian, B., Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+in+the+olfactory+system+of+Drosophila+melanogaster+and+other+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Fron+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects.</a> Fron Cell Neurosci. 17, 1130091(2023).</li>
<li>Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+exposure+causes+central+adaptation+and+morphological+changes+in+selected+olfactory+glomeruli+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila.</a> J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).</li>
<li>Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+in+the+olfactory+pathway+of+adult+Drosophila+take+place+at+a+critical+age%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age.</a> J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).</li>
<li>Sachse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+local+GABAergic+interneurons+drives+olfactory+habituation%5BTitle%5D)+AND+%22Pro+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation.</a> Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).</li>
<li>Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+in+adult+Drosophila+sensory+neurons+for+morphological+and+functional+plasticity+of+the+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit.</a> PLoS Genet. 11 (5), e1005244(2015).</li>
<li>Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+remodeling+of+Drosophila+olfactory+sensory+neuron+brain+innervation+during+an+early-life+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period.</a> J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).</li>
<li>Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+FMRP+roles+in+experience-dependent+remodeling+of+olfactory+brain+innervation+during+an+early-life+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period.</a> J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).</li>
<li>Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerulus-selective+regulation+of+a+critical+period+for+interneuron+plasticity+in+the+drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe.</a> J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).</li>
<li>Stephan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Psidin+regulates+olfactory+neuron+number+and+axon+targeting+through+two+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (46), 16080(2012).</li>
<li>Doll, C. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+FMRP+requirements+in+development+of+the+neural+circuitry+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory.</a> Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).</li>
<li>Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+one-step+dissection+protocol+for+whole-mount+preparation+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (118), e55128(2016).</li>
<li>Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+axon+targeting+of+Drosophila+olfactory+receptor+neurons+specified+by+the+proneural+transcription+factors+Atonal+and+Amos%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos.</a> Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fragile+X+mental+retardation+protein+activates+glial+insulin+receptor+mediated+PDF-Tri+neuron+developmental+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance.</a> Nat Comm. 12 (1), 1160(2021).</li>
<li>Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+odors+at+naturally+occurring+concentrations+triggers+limited+plasticity+in+early+stages+of+Drosophila+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing.</a> eLife. 12, 85443(2023).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

此处介绍的气味暴露与脑成像方案可用于在生命早期关键期可靠地诱导并量化依赖经验的嗅觉感觉神经元突触小球修剪过程。早期采用该处理范式研究嗅觉环路重塑的研究从出生后第2天开始进行气味暴露nd 羽化后第一天3,4,5相比之下，我们在成虫羽化前的围蛹期开始进行气味物质暴露，发现绝大多数的神经重塑发生在羽化后的前24小时内。8,9因此，该气味暴露方案的一个关键步骤是在蛹羽化前将处于特定发育阶段的暗色蛹放入气味暴露室中。图1）。这不适用于蛹期气味暴露 本身 而是为了确保成虫羽化后立即接触气味物质。我们选择在分期后4小时选取刚羽化的幼年成虫，以在较短的时间窗口内同步个体年龄，并避免气味物质暴露时间的差异。这一较早的经历时间段与近期研究结果一致，表明EB嗅觉习惯化在羽化后仅2天即告结束。10然而，关键期内不同气味暴露时间点（例如，0-1天与1-2天）所导致的后果尚未被充分阐明。Or42a嗅觉感觉神经元选择性地投射至触角叶中的VM7小球，该小球可根据精确的小球图谱和靶向神经支配标记（例如，Or42a-mCD8::GFP）轻松识别。 图2关键期内暴露于EB气味分子不会改变Or42a启动子表达或报告基因水平8定时暴露于气味分子可导致Or42a受体神经元发生顺序性突触消除和轴突支配丧失。这种修剪过程在生命早期的关键期（0–2 dpe）内完全可逆，但在成体成熟阶段（7–9 dpe）则不可逆，此时气味环境的变化不再影响神经支配。这种依赖感觉经验的机制具有严格的时间限制，是当前领域内尚未解决的重要问题。目前正有诸多尝试旨在重新开启成体阶段类似关键期的可塑性。本文所提供的实验方案为此类研究提供了有力途径。
本文所述的气味暴露与脑成像方案操作简便，具有广泛的可及性和适应性。气味暴露的起始时间、终止时间及持续时间完全由研究者自主控制，便于针对关键期特性、神经环路重塑的可逆性以及关键期样可塑性重新开启等问题开展靶向研究。同样，气味刺激强度也可轻松调节，用于研究剂量依赖性的突触小球修剪（图3）。重要的是，使用较低浓度EB（例如15% EB）的研究可用于检测可能增强突触小球重塑速率或程度的干预措施。例如，实验结果可能显示，在较低EB浓度（如15%）下发生的突触修剪与较高浓度（如25%）下的效果无明显差异。在不同干预条件下，结果均可与溶剂对照组稳定的神经支配情况以及25% EB浓度下显著的突触小球修剪效应进行一致比较（图3）。该方法的一个局限性在于，气味暴露完全依赖于溶解后气味分子的挥发性。环境因素如温度和相对湿度的变化会影响气味暴露的效果8。果蝇在气味暴露装置中的密度也可能影响暴露效果，例如通过果蝇自身产生的气味物质产生干扰。建议每瓶果蝇密度不超过20–25只。诱导强烈突触小球修剪所需的气味浓度可能高于自然界中通常遇到的水平10,17。若要在更低气味浓度下检测突触消除，需采用更高分辨率的成像技术。然而，当前方案仍可为多种实验干预提供一致且可靠的实验基础。
这种气味暴露与脑成像方案具有巨大优势。Drosophila 是一种极具优势的动物模型，其基础是丰富且精密的遗传工具箱，可被系统性地用于广泛研究关键期嗅觉环路重塑中的基因-环境相互作用。本文展示的示例包括 Or42a-Gal4 转基因驱动品系、UAS-mCD8::GFP 膜标记以及 Or42a-mCD8::GFP 直接融合品系。在突触小球修剪方面，Or42a 直接融合与 Gal4/UAS 间接标记方法之间无显著差异8,9。Or42a-Gal4 驱动系统既可用于操控特定的嗅觉受体神经元，也可用于观察经验依赖性的 VM7 神经支配变化；而直接融合品系则可释放二元 UAS-Gal4 转基因系统，以便对其他细胞进行靶向操控。利用 Drosophila 遗传工具箱中大量其他突变体和转基因品系，可进一步检验时间限制性和经验依赖性机制，包括鉴定介导突触修剪的细胞、传递嗅觉经验信息的细胞间信号通路，以及靶向突触消除所必需的细胞内机制。总体而言，该方案可系统性地探究驱动嗅觉经验依赖性脑环路重塑的多种机制。此外，该气味暴露与脑成像方案还可用于研究关键期特异性的嗅觉经验行为改变、可能在成熟阶段重新开启类似关键期可塑性的遗传与药物干预，以及其他超越突触小球修剪的嗅觉环路可塑性方面。

在生命早期，幼年大脑神经回路的重塑代表了动物出生后最后一次大规模突触连接发生改变以适应高度可变且不可预测环境的机会。作为动物界中数量最丰富的类群，昆虫共享这一在进化上保守的基础性关键期重塑机制1。关键期随着感觉输入的开始而开启，期间神经回路发生可逆性变化以优化连接，随后当稳定化机制抵抗进一步重塑时，关键期关闭2。昆虫尤其依赖嗅觉感觉信息，并表现出明确界定的嗅觉关键期。Drosophila 是研究幼年大脑中这种依赖经验的关键期的优良遗传模型。羽化后最初几天内的气味经验会驱动在个体水平上可识别的突触小球发生显著的回路连接改变3,4。重塑的方向取决于特定的输入气味经验：某些气味在羽化后数天（dpe）内引起突触小球体积增加3,5,6,7，而其他气味则在0–2 dpe的关键期内迅速消除突触，导致神经支配体积减小8,9,10。具体而言，丁酸乙酯（EB）气味经验仅在生命早期这一关键期内引起Or42a嗅觉受体神经元的剂量依赖性突触修剪8。在关键期内通过调节EB气味输入可完全逆转突触消除，但一旦关键期关闭，该变化即变为永久性。这种依赖嗅觉经验的突触修剪为揭示幼年大脑回路重塑的时间限制机制提供了一个有价值的实验系统。
本文介绍了一种详细的实验方案，用于诱导并分析果蝇幼年关键期中，EB（经验依赖性）调控的 Or42a 受体嗅觉感觉神经元突触修剪过程。我们展示，可通过转基因手段特异性地标记触角叶 VM7 小球中的 Or42a 突触末端，方法包括：将膜锚定型 mCD8::GFP 标记物直接由 Or42a 启动子驱动表达（Or42a-mCD8::GFP）11，或利用 Gal4/UAS 双元表达系统（Or42a-Gal4 驱动 UAS-mCD8::GFP）12。单个 Or42a 神经元的突触也可通过靶向转基因表达的方式，使用与多种荧光标签融合的突触前活性区标记物（例如 Bruchpilot::RFP）8，或用于超微结构突触分析的电子致密信号标记（例如 miniSOG-mCherry）8 进行标记。Or42a 突触末端可通过激光扫描共聚焦显微镜与透射电子显微镜联合成像。我们发现，Or42a 突触小球的修剪程度与 EB 剂量相关，并随定时施加的气味刺激浓度而变化。作为溶剂的矿物油中 EB 气味剂的溶解百分比可进行调节，也可根据发育阶段定时改变动物接受气味暴露的持续时间。最后，我们展示了通过测量 VM7 支配区域的荧光强度与体积，来分析突触小球修剪程度的方法。突触数量还可通过计数标记的突触斑点以及利用透射电子显微镜测量突触超微结构参数进行定量分析8。总体而言，本文所述方案是一种强大而系统的方法，可用于解析幼年关键期内介导 Drosophila 嗅觉环路突触连接修剪的细胞与分子机制。本研究中描述的通用气味暴露装置已在先前研究中被用于其他气味刺激及其他小球的检测分析3,7。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;气味暴露用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila &lt;/em&gt;小管</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-110</td><td></td></tr><tr><td>丁酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>气味暴露室</td><td>Glasslock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Winsor &amp;amp; Newton</td><td>Series 233</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>金属丝网</td><td>Scienceware</td><td>378460000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脑组织解剖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇，190 proof</td><td>Decon Labs</td><td>2801</td><td>稀释至70%</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>157-8</td><td>稀释至4%</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td>稀释至1x</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脑组织免疫细胞化学染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488标记山羊抗鸡IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>546标记山羊抗大鼠IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>13970</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Avantor</td><td>48366-067</td><td>25 × 25 mm</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch</td><td>34-8724-5228-8</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G封片剂&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>75 × 25 mm</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Sally Hansen</td><td>109</td><td>Xtreme Wear，无色透明</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗CadN抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AB_528121</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;共聚焦显微镜/图像分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>任意计算机/笔记本电脑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 510 META&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fiji软件</td><td>Fiji</td><td></td><td>版本 2.14.0/1.54f</td></tr></tbody></table>

幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

生命早期嗅觉感官经验可诱导嗅球中突触小球发生显著重塑 果蝇 幼年大脑具有经验依赖性，其可塑性在时间上受到限制，且仅在短暂而明确的关键期内可短暂逆转。脑回路突触连接的重塑方向由作用于嗅觉感觉神经元特定受体类别的气味分子决定。通常情况下，每类神经元仅表达一种气味受体，并投射至单一的嗅觉突触小球。在 黑腹果蝇 遗传模型中，已通过气味反应性和行为输出精确绘制出嗅觉小球的完整图谱。乙酸乙酯（EB）气味分子可激活投射至VM7小球的Or42a受体神经元。在生命早期关键期，EB刺激会引发Or42a嗅觉感觉神经元中剂量依赖性的突触消除。通过精确控制EB气味分子的暴露时长与剂量，可研究幼年大脑中依赖经验的神经环路连接修剪过程。利用Or42a受体驱动的转基因标记物，可通过共聚焦显微镜对触角叶突触小球进行成像，从而定量分析突触数量与神经支配体积。该方法具有高度的 果蝇 基因工具包能够系统解析介导脑环路重塑的细胞与分子机制。

图1展示了基于嗅觉经历依赖性关键期的气味暴露与脑成像方法的工作流程。图1A所示，该方案从羽化前的龄期匹配的暗蛹阶段开始。将蛹置于气味暴露室中4小时，随后将新羽化的成虫转移至对照溶剂或含EB气味剂的暴露室中的新试管中图1B。我们通常进行24小时的气味暴露，但也可根据需要调整暴露时长。气味暴露结束后，开始脑组织解剖：首先将头部从胸部分离，再用精细镊子去除角质外骨骼图1C。分离出的脑组织需清除可能干扰成像的附属组织，随后立即在含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS溶液中固定。短时间固定30分钟即可充分保持脑组织完整性。免疫细胞化学染色流程包括：1小时封闭（如BSA、NGS），随后在一抗（如抗-GFP、抗-CadN）中过夜孵育，再在二抗中短暂孵育2小时图1D。标记完成的脑组织被置于载玻片上，加盖玻片密封，脑背侧朝上，以获得最佳的触角叶成像效果图1E。注意，所有样本均对基因型和经历条件设盲，通过在载玻片上标记编码代号，待后续解码分析。使用配备63倍油镜物镜的激光扫描共聚焦显微镜对中枢脑的触角叶进行成像图1F。选择与所用荧光染料匹配的最优激光线（如氩离子488 nm、氦氖543 nm），以成像Or42a嗅觉感觉神经元在周围小球背景下对VM7的支配情况。
为了完整捕获VM7嗅小球中Or42a神经元支配的Z轴层析投影，选择最佳的增益、偏移、成像分辨率和光学切片厚度至关重要。所有待比较的基因型和实验条件均使用相同的显微镜设置进行成像。Z轴层析图像通过ImageJ软件进行处理，主要依据支配体积评估经验依赖性变化7,14。体积测量的计算方法有两种：一种是使用ImageJ的套索工具逐层计算支配区域面积，然后将每层的面积乘以切片厚度（µm）8,9；另一种是使用Z轴投影的总和投影图，将Z轴层析切片数量乘以切片厚度以确定平均体积。这两种方法所得结果一致。除了体积测量外，还可通过VM7嗅小球的最大强度投影评估荧光强度16。通过ImageJ的Z轴总和最大投影功能评估所有像素的加权总和，对每个强度水平的像素数量进行累加以计算总体强度8,9。背景可通过量化一个相同大小的嗅小球外区域进行扣除。该背景扣除方法虽然耗时较长，但更为准确，因为它考虑了每份脑样本中背景抗体标记水平的差异，从而对支配区域的荧光强度值进行更具代表性的定量。强度测量通常在Z轴层析图像中的18–30层光学切片（0.37 µm/层）范围内进行，并对每份脑样本取平均值16。在几乎所有情况下，荧光强度和体积测量结果均具有一致性。
在所有测量方式中，代表性结果均保持一致：生命早期接触 EB 气味分子会导致 Or42a 神经元神经支配的显著丧失。VM7 嗅小球可通过其大小、形状和位置，在其他精确定位的触角叶嗅觉小球中可靠地被识别（图 2A），也可通过 Or42a-mCD8::GFP 膜标记的靶向表达结合抗神经钙黏蛋白（CadN）对嗅小球进行标记来识别（图 2B）。在限定时间内暴露于气味溶剂对照（矿物油）后，Or42a 神经元的神经支配与未经处理的正常动物无明显差异。然而，在羽化后最初几天（dpe）内接触 EB 气味分子，则会导致突触嗅小球发生修剪（图 2C）。这种修剪机制完全局限于生命早期短暂的关键期8,10。目前我们通常采用 24 小时的气味暴露来评估幼年 Drosophila 脑中 VM7 嗅小球的突触修剪及其所致的神经支配体积减少。在羽化后 0–1 天（0-1 dpe）暴露于气味溶剂对照（矿物油）24 小时，可在两个脑半球的触角叶中均维持 VM7 突触嗅小球内正常且密集的 Or42a-mCD8::GFP 神经支配信号（绿色），表现为完整的突触小球结构（白色虚线圆圈）（图 2D，左）。与此形成鲜明对比的是，在 0–1 dpe 期间暴露于矿物油中溶解的 25% EB 气味分子 24 小时，会导致 Or42a-mCD8::GFP 神经支配（绿色）显著减少，并伴随突触嗅小球体积的丧失（图 2D，右）。这些结果在视觉上清晰明显，且重复性极高。该气味暴露实验方案最突出的优点之一，就在于脑成像结果的高度清晰性，同时也非常适用于对神经支配的荧光强度和体积进行直接定量分析。
该气味刺激实验方案的主要优势在于，可用于研究关键期突触修剪过程中时间限制性和气味剂剂量依赖性机制。在VM7嗅小球中，由EB驱动的Or42a神经元突触消除，其重塑机制主要局限于早期幼年阶段（0–2 dpe），在成熟期（7–9 dpe）则无法检测到明显的经验依赖性突触修剪，仅在最高EB暴露水平下出现轻微调节作用8。这种时间限制性定义了一个关键期，而理解该时间调控机制是重要的研究目标之一。本方案的另一特点是，经验依赖性突触修剪具有EB剂量依赖性（图3）。在0% EB气味剂的载体对照（矿物油）定时暴露条件下，Or42a神经元对VM7突触嗅小球的支配正常，与未经处理的动物无明显差异。Or42a神经元支配的三维体积计算结果显示，其大小与正常幼年脑组织相当（2260 µm3；图3A，左）。代表性结果表明，随着EB气味剂浓度的增加，突触嗅小球的修剪程度逐步增强。例如，在0–1 dpe期间暴露于15% EB气味剂24小时，会导致明显且一致的神经支配减少（图3A，中）。三维支配体积的定量结果显示，与载体对照组相比显著减小（760 µm3 vs. 2260 µm3）。在0–1 dpe期间暴露于25% EB气味剂24小时，则导致更严重的支配丢失（281 µm3；图3A，右）。该EB气味剂浓度范围内的代表性定量结果在荧光强度（图3B）和支配体积（图3C）上均表现出一致的趋势。这种剂量依赖性使得研究人员能够探索抑制突触修剪的机制，也可通过较低气味剂暴露增强修剪效应，从而展示突触嗅小球更显著的重塑能力。一些前期研究显示，使用其他气味剂时，该方案可导致嗅小球体积增大的相反效应10。然而，在关键期内暴露于EB气味剂始终会导致显著且易于检测的突触嗅小球修剪。
<img alt="果蝇脑解剖结合抗体染色与共聚焦成像；包含实验准备与方法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：气味暴露研究的流程图 果蝇 幼年大脑 (A) 蛹化后90小时以上的暗蛹（Pharate暗蛹） 25 °C收集并置于气味室中。在有气味条件下，允许羽化4小时，然后将未成熟果蝇转移至新的试管中。B将同龄果蝇分为溶剂对照组（100%矿物油）和丁酸乙酯（EB；% v/v，溶于矿物油）处理组。细金属网（插图）允许气味分子进入。果蝇通常额外暴露20小时，总计暴露24小时，时间为羽化后0-1天（dpe）。C果蝇首先去除头部，然后使用精细镊子小心去除角质层外骨骼，分离出幼体脑组织。分离出的脑组织需清除所有周围组织及突出的气管。D分离的大脑组织经固定和封闭后，依次与一抗和二抗孵育。所用抗体通常包括一种用于显示触角叶突触小球的一般性膜标记探针，以及一种针对Or42a嗅觉感觉神经元的特异性膜标记探针。E) 标记后的脑组织置于载玻片上，用胶带作为间隔物，并加盖盖玻片密封，周围使用封片介质固定。脑组织的正确朝向（背侧向上）对于触角叶的最佳成像至关重要。F使用激光扫描共聚焦荧光显微镜对脑组织进行成像。所有样品在成像及后续定量分析前均对基因型和实验条件设盲。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="触角叶示意图及突触修剪分析；GFP标记，嗅觉神经元研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：气味经验依赖性关键期突触小球修剪。 （A）触角叶（AL）嗅觉小球被精确定位。图中显示了几个代表性突触小球。Or42a受体嗅觉感觉神经元（OSN）类别特异性地支配VM7小球。（B）Or42a-mCD8::GFP标记的神经元（绿色）密集支配大脑左右两侧（L和R）成对的VM7小球，N-钙黏蛋白（CadN）抗体标记所有AL突触小球（品红色）。果蝇品系为 w1118; Or42a-mCD8::GFP/+。（C）在溶剂对照条件（100%矿物油；左侧）和幼年关键期暴露于丁酸乙酯（矿物油中EB体积百分比；右侧）条件下，Or42a OSN对VM7突触小球支配的示意图。经验依赖性支配修剪仅在生命早期暴露于EB时发生，伴随突触消除和轴突丢失，导致支配体积减少。（D）Or42a OSN对成对VM7突触小球支配的代表性共聚焦图像（虚线白色轮廓圆圈；Or42a-mCD8::GFP，绿色），分别在溶剂对照（左侧）和25% EB暴露（右侧）24小时（0–1 dpe）后获得。EB气味经验驱动突触修剪并导致支配体积减少。这种经验依赖性机制在时间上受到限制，且仅在羽化后最初几天内一个明确定义的嗅觉关键期内短暂可逆。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度与神经支配体积示意图；GFP表达；显微镜结果；EB效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：定量分析EB剂量依赖性突触小球神经支配的荧光强度与体积。（A）Or42a-mCD8::GFP标记的VM7突触小球神经支配（绿色），在0–1 dpe期间分别暴露于气味载体矿物油对照组（0% EB，左）、15% EB（中）或25% EB（右）。下方：相同图像中标出突触小球神经支配区域（白色圆圈），并计算其三维神经支配体积。载体对照组中，Or42a神经元对VM7突触小球的神经支配与未处理动物无差异。关键期暴露于15% EB气味剂导致明显的突触小球修剪，本例中三维神经支配体积减少66%。暴露于更高浓度的25% EB则导致更显著的修剪，本例中突触小球体积几乎减少90%。因此，随着气味刺激强度增加，可观察到剂量依赖性的突触修剪现象。（B）Or42a-mCD8::GFP标记的VM7突触小球在0–1 dpe期间暴露于气味载体对照（油，绿色）、15% EB（中，橙色）或25% EB（右，黑色）后的代表性荧光强度结果。（C）在相同关键期气味刺激条件下VM7小球三维神经支配体积的代表性结果。散点图显示所有单个数据点，误差线表示均值±标准误。显著性水平标注为 p≤0.05（*），p≤ 0.01（**），p≤ 0.001（***），以及 p≤ 0.0001（****）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们在此描述了诱导和分析触角叶突触小球在嗅觉经验依赖性重塑过程中的方法 果蝇 幼年大脑

幼年期嗅觉感知经历可诱导果蝇幼体大脑中突触小球发生显著的重塑，这一过程具有经验依赖性……

我的研究涉及探索胶质细胞在依赖经验的关键期突触重塑中的作用。我正在明确胶质细胞在突触修剪中的功能，特别是在关键期内，以及介导经验驱动突触修剪的神经元-胶质细胞间通讯机制。我们的实验方案利用了果蝇遗传学的强大能力，以解析其中的分子机制。为了研究基因与环境的相互作用，我们可以在一个短暂且定义明确的关键期中，精确调控气味的浓度、持续时间和作用时机。该方案在诱导突触重塑方面具有极高的灵活性。我们的研究结果建立了一个优良的模型，适用于遗传和药物干预，有望在成年期重新开启类似关键期的可塑性，这一方向对于损伤、创伤及神经系统疾病的治疗具有重大研究价值。首先，取一支装有果蝇幼虫的小瓶。使用细小的画笔，将40至50只颜色非常深的蛹挑选至含有标准玉米粉-糖蜜培养基的聚苯乙烯果蝇小瓶中。在果蝇小瓶的开口端覆盖一层细的不锈钢丝网，以防止果蝇逸出，同时保证良好的空气流通。用透明胶带将金属网盖固定在小瓶侧面。然后在1.5毫升离心管中加入1毫升100%矿物油或溶于矿物油中的EB。将这些离心管直立放置于一个3,700毫升的Glasslock容器中。使用胶带将试管与果蝇小瓶一起固定在气味室中央。将密封的对照载体和含有蛹小瓶的EB气味室置于湿润培养箱中，保持12小时光照与12小时黑暗的循环条件。在气味室暴露4小时后，迅速将20至25只新羽化的果蝇转移到含有新配制气味剂的培养室中的新鲜果蝇小瓶内。将果蝇置于密封的气味室中，在培养箱内共孵育24小时。首先，取经矿物油和EB处理24小时的黑腹果蝇（Drosophila）。将试管标记为溶剂对照组或EB暴露组，并在后续的脑组织解剖和处理过程中始终保持这些标识。用镊子将一只麻醉的果蝇转移至盛有新鲜配制 PBS 的小培养皿中。将果蝇完全浸入 PBS 中，以进行完整的脑解剖。然后将果蝇腹面朝上放置。用两把精细打磨的镊子，一把夹住胸部上部，另一把夹住吻下方的头部。向相反方向拉动头部与身体其余部分，以分离头部。确保头部顺利与胸部脱离，并保留分离的头部用于解剖。将先前用于夹住胸部的镊子滑至喙的另一侧下方。轻轻向相反方向拉动外骨骼角质层，使其在两眼之间撕裂，从而暴露脑组织。继续清除头部的外骨骼角质层，确保完全去除所有部分。现在用 PBS 和 0.2% Triton X-100 冲洗 P20 移液器吸头。解剖后立即将脑组织转移至带盖试管中的固定液中。首先，取一张载玻片，并在其上粘贴两条细的双面胶带，以准备成像。在用于脑组织固定的两片胶带之间加入约10至15微升封片介质。使用预先用PBS和0.2%Triton X-100冲洗过的P20移液枪头，将标记好的黑腹果蝇（Drosophila）脑组织转移至显微镜载玻片上。脑组织转移完成后，用细毛刷调整其位置，确保触角叶朝上。将脑组织定位后，盖上玻璃盖玻片，然后在盖玻片四周补充封片介质。用透明指甲油密封盖玻片边缘。彻底干燥载玻片后，将其存放于冰箱中以备后续成像。使用配备63倍油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。采用氩离子488和氦氖543激光器对触角叶突触小球及Or42a嗅觉感觉神经元进行成像。确定两个通道的最佳增益和偏移。将成像位置调整至脑部中心，并聚焦于位于脑部中央孔洞附近的大约位置的VM7嗅小球。选择1024×1024的成像分辨率。捕获贯穿触角叶的完整共聚焦Z轴层扫投影，以确保完全覆盖VM7嗅小球中Or42a神经元的全部神经支配。将基因型或条件设盲的图像载入Fiji。为分离激光通道，请前往图像菜单，点击颜色，然后选择拆分通道。在 Or42a 嗅觉感觉通道中，滚动 Z 层切片以确定哪些切片包含 Or42a 神经元的神经支配，识别荧光的起始和终止位置。要创建仅包含 Or42a 神经元神经支配切片的最大密度投影，请点击图像，进入堆栈，然后点击 Z 投影，选择部分切片，并输入所需的范围。使用 Fiji 中的套索工具勾勒 VM7 小球中 Or42a 神经元支配的轮廓。将所勾勒区域的周长乘以 Z 轴堆栈切片的数量以及每个切片的厚度，以计算 VM7 突触小球的支配体积。在暴露于对照气味和溶剂 24 小时后，双侧天线叶的 VM7 小球中仍持续存在密集的 Or42a mCD8-GFP 支配。相比之下，暴露于25% EB气味剂24小时会导致明显的突触小球修剪及突触小球体积的显著减少。增加EB气味剂浓度会逐步加剧突触小球的修剪程度。针对该EB气味剂浓度范围的代表性定量分析在荧光强度和神经支配体积方面显示出类似结果。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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