Name: 诱导小鼠多囊卵巢综合征的改良技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 了解使用微型泵控释来曲唑诱导小鼠多囊卵巢综合征的改良技术。该方法减少重复给药需求，降低非实验因素干扰，为研究生理机制提供可靠模型。

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本研究获得以下基金资助：中国国家重点研发计划（项目号 2021YFC2700701）、国家自然科学基金（项目号 82088102、82071731、82171613、8227034、81601238）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（项目号 2019-I2M-5-064）、上海市科学技术委员会（项目号 21Y11907600）、上海市卫生健康委员会和计划生育委员会（项目号 20215Y0216）、上海市卫生健康委员会协同创新项目（项目号 2020CXJQ01）、上海医院发展中心临床研究计划（项目号 SHDC2020CR1008A）、上海市妇科疾病临床研究中心（项目号 22MC1940200）、上海市泌尿系统疾病研究中⼼（项目号 2022ZZ01012）、上海市生殖与发育前沿科学研究基地、衢州市科学技术局（项目号 2022K54）、浙江大学教育部生殖遗传重点实验室开放基金项目（项目号 KY2022035）以及广东省医学科学院开放基金项目（项目号 YKY-KF202202）。

本研究中的所有动物实验方案均经批准&#160;动物伦理委员会&#160;复旦大学的4周龄雌性C57BL/6J小鼠被用于本研究。本研究中所用动物、试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 微量泵的准备
<ol>
	<li>取原包装瓶中储存的来曲唑粉末（50 mg），将装有粉末的瓶子在室温下以 300 × g 离心 5 秒，然后打开瓶盖。</li>
	<li>用移液器缓慢加入 625 µL 二甲基亚砜（DMSO）至来曲唑粉末中，充分混匀，得到浓度为 8 mg/100 µL 的储备液，总体积为 625 µL。 
	注意：若使用不同包装规格的来曲唑粉末，请预先计算所需 DMSO 体积以配制相应储备液。&#160;来曲唑粉末、DMSO 及其他相关化合物必须为无菌级。移液器吸头、离心管及其他相关物品在使用前应为无菌或已灭菌状态。</li>
	<li>根据实验设计确定所需小鼠数量。</li>
	<li>根据所需小鼠数量，用移液器吸取所需的来曲唑储备液总量，缓慢注入离心管中。 
	注意：本实验选用 4 周龄小鼠进行为期 8 周的暴露处理，以建立多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型。每只小鼠总给药剂量为 8 mg，需连续植入两个缓释泵（每个泵释放 4 周），即每个泵给药 4 mg/4 周。如步骤 1.2 所述，来曲唑储备液浓度为 8 mg/100 µL。根据以下计算，每个泵需 50 µL 储备液：4 mg ÷ (8 mg/100 µL)。</li>
	<li>用移液器吸取等体积的 PEG300，加入到来曲唑溶液中，并充分混匀（可适当涡旋混合）。</li>
	<li>为对照组配制对照溶剂溶液（每个泵使用不含来曲唑的 50 µL DMSO + 50 µL PEG300）。</li>
	<li>根据所需缓释泵数量，准备足量无菌离心管；每个泵需准备一个 15 mL 离心管。</li>
	<li>用注射器吸取生理盐水，向每个离心管中加入 5 mL 生理盐水。盖上管盖，将离心管置于试管架上备用。</li>
	<li>佩戴一副新的无菌手套，取出所需数量的微型缓释泵，放置于洁净无菌的操作台面或容器中。</li>
	<li>用拇指和食指轻轻夹住与泵体匹配的帽盖，另一只手握住泵体。</li>
	<li>用连接在帽盖上的细管轻轻多次穿刺泵的填充口（图 1B）。 
	注意：若未疏通，填充后液体可能无法在管内自由流动。</li>
	<li>取与泵配套的针头和一支 1 mL 无菌注射器。将针头连接至注射器并拧紧（图 1C）。</li>
	<li>用新组装的注射器小心且缓慢地吸取上述配制好的来曲唑终溶液（图 1D）。 
	注意：吸取来曲唑溶液时应缓慢且均匀。快速吸取可能产生气泡，影响后续药物溶液的注射。</li>
	<li>将来曲唑溶液注入微型缓释泵中。
	<ol>
		<li>一只手小心夹住微型缓释泵使其直立，另一只手持上述 1 mL 注射器，缓慢插入泵体最底部（图 1E）。 
		注意：若针头未插入泵体底部，注射过程中泵内液体易产生气泡，影响后续药物释放。</li>
		<li>然后缓慢注入配制好的溶液；当泵口出现轻微冒泡时，表明正在注入。</li>
		<li>当注射量接近 90 µL 时，进一步减慢注射速度。当泵完全充满（约 100 µL）后，拔出注射器。</li>
		<li>小心将帽盖插入泵体并拧紧；此时会有少量溶液溢出，需小心擦拭干净。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载药后的缓释泵出口朝上（即带帽盖的一端），取之前准备好的离心管，将泵完全浸入无菌生理盐水中（图 1F）。然后盖上管盖，置于试管架上。 
	注意：整个操作过程中应避免污染缓释泵。</li>
	<li>所有微型缓释泵制备完成后，将所有离心管置于 37 °C 恒温箱中孵育 48 小时。</li>
</ol>
2. 手术与麻醉的准备工作
<ol>
	<li>在手术当天准备并灭菌所有所需器械，包括镊子、止血钳、手术剪、持针器和4-0可吸收手术缝线。</li>
	<li>使用异氟烷麻醉机前（图2B），仔细检查管道连接是否正确，并确保管道完好无泄漏。</li>
	<li>拧开麻醉机蒸发器上的加药密封盖，然后缓慢加入麻醉剂。</li>
	<li>保持麻醉剂液面位于麻醉机标注的上下限之间。</li>
	<li>转换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流与麻醉诱导箱相连。</li>
	<li>打开气泵和蒸发器，调节异氟烷浓度以进行麻醉诱导（通常为3%-4%）。</li>
	<li>等待约1分钟，待麻醉气体充满诱导箱后，将小鼠放入诱导箱内，直至完全麻醉（此过程约需2-3分钟）。</li>
	<li>通过轻轻倾斜&#160;诱导箱检查小鼠是否充分麻醉。若小鼠翻转后无恢复俯卧姿势的迹象，则表明麻醉已生效。</li>
</ol>
3. 来曲唑微型泵的植入
<ol>
	<li>戴上外科口罩和无菌手套。</li>
	<li>将预先麻醉的小鼠从诱导箱中取出，在小鼠背部涂抹脱毛膏，静置1分钟。用湿纱布轻轻擦去脱毛膏及毛发。</li>
	<li>同时，切换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流连接至麻醉面罩，并调节维持浓度（通常为2%）。</li>
	<li>脱毛后，用优势手握住小鼠，将其头部/鼻部放入麻醉面罩中。</li>
	<li>通过测试足底回缩反射检查麻醉深度。 
	注意：所有涉及麻醉的操作必须使用装有活性炭片的气体过滤器，并在通风橱内进行。</li>
	<li>将小鼠俯卧位固定于手术板上，并在双眼涂抹眼用润滑剂。</li>
	<li>用聚维酮碘棉签对暴露的皮肤擦拭三次（图2C）。然后，皮下注射美洛昔康，剂量为2 mg/kg。&#160;</li>
	<li>再次通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。随后，在颈背部正中线处，偏向无毛侧皮肤，用镊子提起皮肤，用手术刀或手术剪横向切开约0.5 cm（图2D）。</li>
	<li>然后打开切口下方的表皮，使用止血钳或持针器分离皮下组织，为微型泵预留空间（距离切口约2 cm处）（图2E）。</li>
	<li>用无菌镊子从离心管的生理盐水中取出泵，使泵的开口端朝下，准备将泵植入小鼠皮下（图2F）。</li>
	<li>用镊子夹住一侧皮肤切口，将泵推入皮下腔隙。植入时应无明显阻力。进入皮下后，用手指轻微而轻柔地将泵向内挤压至尽可能深的位置（图1G）。</li>
	<li>使用4-0外科缝线仔细缝合切口部位（图2H）。 
	注意：缝合时注意避免损伤皮下泵体。</li>
	<li>缝合后，用碘伏棉签对手术部位皮肤消毒两次。</li>
</ol>
4. 动物恢复
<ol>
	<li>手术后，将小鼠从麻醉期间使用的垫子上轻轻转移到干燥、清洁的垫子上。确保小鼠处于温暖且安静的环境中。</li>
	<li>密切监测小鼠的状况，例如呼吸的深度和频率。</li>
	<li>观察小鼠活动能力恢复过程中的行为表现。最终确保它们能够站立并行走，且无明显异常行为，如头晕或运动不协调。</li>
	<li>小鼠恢复后，将其轻轻转移至预先准备好的笼子中。在笼底放置无菌果冻和食物供其摄食。&#160; 
	注意：手术部位的拉伸可能影响小鼠在术后早期饮水和进食，因此需将果冻和食物放置于笼底。</li>
	<li>皮下注射美洛昔康，剂量为 2 mg/kg（术后前 3 天每 24 小时一次）。在来曲唑治疗 8 周后（即连续两次微型泵植入），对小鼠模型进行检测。</li>
</ol>

Polycystic Ovary Syndrome Induction in Mice Through Controlled Letrozole Release 

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告展示了一种使用易得材料在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）的简单方案。小鼠PCOS模型对于探索PCOS的发病机制及药物筛选至关重要26。在现有的多种小鼠PCOS建模方法中，来曲唑诱导法是最常用的方法之一。来曲唑可通过抑制睾酮向雌二醇的转化或促进睾酮合成，从而建立并维持高雄激素状态27。来曲唑诱导的小鼠模型在代谢和生殖特征方面与PCOS患者具有相似性28。然而，传统的小鼠来曲唑处理方法需要连续21天或更长时间每日口服给药或注射29,30。长期、定时的给药过程耗时且劳动密集，反复给药对小鼠造成显著应激，可能引入影响模型结果的非实验性干扰因素23,31。尽管部分大鼠和小鼠PCOS研究已采用可植入的来曲唑缓释丸28,32，但此类产品需定制，可能无法及时获得。本研究提出一种通过植入来曲唑微型泵以诱导小鼠PCOS的技术。该方法操作简便、节省时间，且所用手术工具和设备在大多数实验室中均可常规获取。
关键步骤与故障排除 
在实施本方法时，为获得最佳结果，需注意以下几个关键步骤。首先，使用前应利用配套帽上附带的细管疏通泵体。以往经验表明，泵体堵塞可能干扰药物的装载与释放。此外，配置来曲唑溶液的每一步都必须谨慎操作，以确保最终溶液的浓度准确达到预期值。在泵体组装过程中，必须注意防止污染。 Furthermore，麻醉前及麻醉过程中需进行仔细调整，以确保实验小鼠达到充分的麻醉状态，并尽量减少麻醉对受术小鼠产生的不良影响。
优点与局限性 
本研究中描述的方法具有多项优点：（1）节省时间，并可在泵植入后实现来曲唑的持续释放；（2）避免了反复给药对实验动物造成的应激，最大限度减少了非实验因素对建模结果的影响；（3）所需材料、手术器械和设备在大多数实验室中均常见易得；（4）该方法可有效诱导小鼠出现多囊卵巢综合征（PCOS）表型。然而，该方法也存在局限性：（1）微型泵植入所需的麻醉和手术操作可能对小鼠造成刺激，且皮下植入的微型泵可能干扰其正常活动；（2）在操作过程中，若泵体受到污染或损坏，可能影响该建模方法的效果。根据作者的经验，严谨地执行实验方案各步骤，可实现较高的PCOS小鼠模型构建成功率。

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性中最常见的疾病之一1。全球多达18%的女性受其影响，是全球女性不孕的主要原因2,3。PCOS 的特征是一系列相互关联的生殖异常，包括促性腺激素分泌紊乱、慢性无排卵、雄激素生成增加以及多囊卵巢形态4。除了妇科疾病外，PCOS 还会增加心血管疾病的风险5,6。尽管已有数十年的研究，PCOS 的病因仍不明确7,8。
为了更深入地了解多囊卵巢综合征（PCOS）的发病机制并开发新的治疗方法，建立能够紧密模拟人类生理状态的动物模型具有重要意义9。目前报道的PCOS啮齿类动物模型包括通过睾酮、来曲唑和戊酸雌二醇等处理诱导的模型。睾酮可引起高雄激素血症，在大鼠中更常被用作PCOS诱导剂10。脱氢表雄酮（DHEA）已被用于在啮齿类动物中诱导PCOS，可升高睾酮水平、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值，并导致动情周期紊乱11。戊酸雌二醇（EV）是一种长效雌激素，使用该方法的研究表明，性类固醇激素和促性腺激素的水平随EV给药剂量的不同而变化12,13,14。来曲唑是一种非甾体芳香化酶抑制剂15。来曲唑处理可导致大鼠出现无周期性动情期、卵巢重量和体重增加、脂肪细胞增大、卵泡发育最大化以及睾酮水平升高16,17。来曲唑处理的小鼠则表现出窦状卵泡和出血性囊肿数量增加，以及黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇和孕酮浓度升高18,19。
目前，来曲唑诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的主要方法包括口服给药和皮下注射，这两种方法均需要每日重复给药20,21,22。这些方法耗时且劳动强度大，反复给药可能对动物造成显著应激23。尽管一些研究使用来曲唑缓释丸24,25，但这类产品需要定制，成本较高。本报告介绍了一种利用微型泵在小鼠中诱导PCOS的技术。该方法操作简便、节省时间，并使用大多数实验室中常见的手术工具和设备。

<table><tbody><tr><td>注射器</td><td>Bofeng Biotech</td><td>BD300841</td><td>1ML（无菌）</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Biological Hope</td><td>1850-K</td><td>15ML（无菌）</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000268-A</td><td>100&amp;mu;L-1000&amp;mu;L（无菌）</td></tr><tr><td>移液器</td><td>TopPette</td><td>7010101008</td><td>10&amp;mu;L-100&amp;mu;L（无菌）</td></tr><tr><td>来曲唑粉末</td><td>Sigma</td><td>L6545-50MG</td><td>主要作用药物（无菌）</td></tr><tr><td>PEG（聚乙二醇）</td><td>Solarbio</td><td>P8250</td><td>用于溶解（无菌）</td></tr><tr><td>无菌生理盐水溶液</td><td>Biosharp</td><td>BL158A</td><td>微型泵储存</td></tr><tr><td>渗透泵</td><td>ALZET</td><td>1004</td><td>来曲唑储存与缓释（无菌）</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Biosharp</td><td>BS087</td><td>用于溶解（无菌）</td></tr><tr><td>小动物麻醉机</td><td>RWD&amp;nbsp;</td><td>R500IP</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>RWD</td><td>20071302</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Biosharp</td><td>BS-HF-S-125</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Biosharp</td><td>BS-SOR-S-100P</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>持针器</td><td>ShangHaiJZ</td><td>J32010</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>镊子</td><td>RWD&amp;nbsp;</td><td>F12028</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>缝合针与4-0可吸收缝线</td><td>JINGHUAN</td><td>CR413</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签</td><td>SingleLady</td><td>GB26368-2010</td><td>皮肤消毒</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>ZIKER BIOTECHNOLOGY</td><td>ZK-L2701&amp;nbsp;</td><td>实验动物脱毛剂</td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>Biosharp</td><td>BC040-L</td><td>用于无菌操作</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>ZHENDE</td><td>BA69087</td><td>用于擦拭液体</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>上海模型生物中心</td><td>N/A</td><td>年龄：4周</td></tr><tr><td>宠物眼润滑剂</td><td>BAITE</td><td>SHF021153</td><td>用于小鼠眼部润滑</td></tr><tr><td>美洛昔康注射液</td><td>MEIDAJIA</td><td>R21064-21</td><td>用于小鼠镇痛（无菌）</td></tr></tbody></table>

一种改良的小鼠多囊卵巢综合征诱导技术

A Modified Technique for Inducing Polycystic Ovary Syndrome in Mice

多囊卵巢综合征（PCOS）是导致女性不孕的主要原因之一。动物模型被广泛用于研究PCOS的病因机制及相关药物开发。来曲唑诱导的小鼠模型能够复制PCOS患者的代谢和生殖表型。传统的PCOS小鼠来曲唑给药方法需要在一定时期内每日给药，操作繁琐且可能对小鼠造成显著应激。本研究描述了一种通过植入可控释以来曲唑的微型泵来诱导小鼠PCOS的简便有效方法。研究人员制备了一种可稳定、持续释放定量来曲唑的微型泵，并在麻醉条件下将其皮下植入小鼠体内。本研究表明，植入来曲唑微型泵后，小鼠模型成功模拟了PCOS的特征。本研究中所用材料与设备在大多数实验室中均易于获取，无需特殊定制。综上所述，本文提供了一种独特且易于操作的小鼠PCOS诱导方法。

实验方案及部分关键步骤见图1和图2。血清睾酮水平显示在图3A中。来曲唑微型泵处理的小鼠（以下简称LTZ小鼠）血清睾酮水平显著高于雌性对照小鼠。同时，卵巢组织学分析显示，LTZ小鼠出现多囊卵巢，并且黄体数量显著减少（图3B、C），提示无排卵。此外，与雌性对照小鼠相比，LTZ小鼠表现出显著的动情周期紊乱（图3D）。体重评估结果显示，LTZ小鼠体重高于对照小鼠（图3E）。葡萄糖耐量试验结果及AUC计算表明，与对照小鼠相比，LTZ小鼠出现葡萄糖耐受不良（图3F、G）。血清脂质检测显示，LTZ小鼠的血清脂质谱较对照小鼠发生改变（图3H）。
<img alt="使用溶剂萃取、注射器过滤和实验装置图像的可控药物释放实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66637/66637fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：制备微型泵的材料与关键步骤。（A）来曲唑微型泵制备过程的示意图。（B）通过连接在帽端的细管疏通微型泵。（C）将与泵匹配的针头连接至1 mL注射器的针头端。（D）缓慢吸取来曲唑溶液，避免产生气泡。（E）从泵的最底部缓慢注入来曲唑溶液。（F）填充后的泵盖上帽，帽端朝上保存于生理盐水中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66637/66637fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于麻醉气体输送和微型泵植入的动物手术装置；显示操作步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66637/66637fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：在小鼠体内植入泵以诱导多囊卵巢综合征（PCOS）的材料与关键步骤。（A）示意图显示来曲唑微型泵的植入过程。（B）麻醉设备：空气泵、麻醉机、诱导箱和气体过滤器。（C）将小鼠麻醉后固定并进行消毒。（D）在背部中线附近做一个0.5 cm的切口。（E）分离皮肤以留出空间用于插入微型泵。（F）使用清洁且无菌的镊子将微型泵从生理盐水中取出。（G）将微型泵植入先前分离的皮下空间。（H）用4-0缝线关闭皮肤。（I）让已植入微型泵的小鼠恢复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66637/66637fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多囊卵巢综合征对血清睾酮、黄体数量、周期阶段的影响；用于分析的图表和组织学图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66637/66637fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：来曲唑微型泵植入小鼠模型中生殖与代谢表型的表征。（A）来曲唑（LTZ）处理组小鼠的血浆睾酮水平显著高于对照组小鼠（每组 n = 9 只动物）。（B）卵巢组织学分析。箭头指示黄体。比例尺：1 mm。（C）各指定组中黄体的数量（每组 n = 9 只动物）。（D）与对照组雌性小鼠相比，LTZ 处理小鼠出现无周期性。（E）各指定组的体重变化（每组 n = 10 只动物）。（F,G）各指定组的葡萄糖耐量试验结果（每组 n = 8 只动物）。（H）各指定组的血清脂质水平（每组 n = 8 只动物）。数据以均值 ± 标准误表示。AUC 表示曲线下面积；E，动情期；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；P，动情前期；M/D，动情间期/动情后期；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66637/66637fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种通过微型泵控释来曲唑在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的技术。在充分麻醉条件下，将微型泵皮下植入小鼠体内，经过微型泵一定时间的释放后，成功诱导出小鼠PCOS模型。

多囊卵巢综合征（PCOS）是导致女性不孕的主要原因之一。动物模型被广泛用于研究其病因机制……

我们的研究主要聚焦于多囊卵巢综合征相关的生理及病理机制。具体而言，本研究旨在建立一种简单高效的诱导小鼠多囊卵巢综合征（PCOS）的技术，以更好地模拟和研究PCOS的生理特征。2023年，院士团队在《循环》杂志发表了一项研究，提出了一种新机制，揭示慢性炎症在多囊卵巢综合征患者发生高危心血管疾病中的作用。本方案提供了一种省时且灵活的方法，可有效诱导小鼠多囊卵巢综合征（PCOS），避免反复给药，并减少非实验因素的干扰。我们的实验室将致力于研究疾病发育起源背后的机制，旨在揭示不良早期暴露如何导致成年后代谢性疾病、心血管疾病及神经系统疾病的发生。首先，将微型泵放置在干净、无菌的台面上。用拇指和食指轻轻捏住与泵体相匹配的泵帽，另一只手握住泵体。使用连接在泵帽上的细管多次穿刺泵体的填充口。现在，取一根与泵和一毫升注射器相匹配的针头。将针头牢固地安装到注射器上。缓慢将来曲唑的终溶液吸入注射器中。接下来，用一只手小心地捏住微型泵，使其保持直立。用另一只手将一毫升注射器插入泵的底部，缓慢将来曲唑溶液注入泵中。当泵充满后，拔出注射器。小心地将盖子插入泵体并拧紧。擦去任何溢出的液体。将装满液体的泵的出口朝外，浸入已准备好的离心管中的无菌生理盐水中。盖上管盖，并将离心管置于试管架上。将试管放入37摄氏度的恒温箱中孵育48小时。首先，将麻醉后的小鼠俯卧位固定于手术板上。用镊子夹起颈部背面中线处的皮肤，优先选择无毛侧的皮肤。使用手术刀在侧方做一个0.5厘米长的切口。然后，切开切口下方的表皮，用止血钳插入并分离皮肤，为植入微型泵留出空间。接着，用无菌镊子夹取浸在生理盐水中的来曲唑微型泵，取出时应使泵的开口端朝下。用另一把镊子夹住皮肤切口的一侧，固定切口。然后，将泵推入皮下空间。泵置入后，用手指轻轻挤压泵体，使其尽可能向内推进。接着，使用4-0外科缝线缝合切口部位。与雌性对照小鼠相比，经来曲唑微型泵处理的小鼠血清睾酮水平显著升高。对小鼠卵巢的组织学分析显示，处理组小鼠的黄体数量显著减少。此外，这些小鼠还表现出明显的动情周期紊乱，且体重高于对照组小鼠。经处理的小鼠出现了葡萄糖耐受不良，并且血清脂质谱的变化更为显著。

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