Name: 原代人乳腺上皮细胞的分离和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 学习原代人乳腺上皮细胞的高效分离与培养方法，采用酶解消化技术从少量乳腺组织中提取HMECs。该方法结合ROCK抑制剂Y-27632促进细胞增殖，适用于肉芽肿性乳腺炎病理研究与临床应用。

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本研究得到了中国浙江省中医药科技计划项目（2017ZA055；2018ZA036）和中国贵州省遵义市科技项目（遵科合支社〔2020〕第18号）对许X.的资助。作者感谢优嘉（杭州）生物医药科技有限公司分子生物学实验室提供的细胞培养培训支持。

本方案中使用的正常新鲜乳腺组织来自浙江中医药大学附属第一医院难治性肉芽肿性小叶性乳腺炎病灶周围手术切除标本，采集过程遵循浙江中医药大学附属第一医院医学伦理委员会指南（方案编号：ChiMCTR2100005281，日期：2017-07-17）。
1. 组织获取
<ol>
	<li>从成年女性手术标本中采集新鲜乳腺组织，放入含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）和3%青霉素/链霉素（P/S）的无菌管中。 
	注意：乳腺组织应在手术后24小时内按照以下步骤进行处理。</li>
</ol>
2. 组织预处理
<ol>
	<li>使用两把镊子去除乳腺组织中的脂肪组织，确保剩余乳腺组织重量约为 1 g。</li>
	<li>将乳腺组织在 75% 乙醇溶液（5 mL）中冲洗 5 秒，随后用 20 mL 洗涤液（表 1）洗涤 2 次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
3. 组织消化
<ol>
	<li>将乳腺组织切成较小的碎片，使用两把手术刀剪切组织约15分钟，以获得组织匀浆。将组织碎片转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>在含有乳腺组织碎片的50 mL离心管中加入10 mL浓度为5.0 mg/mL的dispase和5.0 mg/mL的胶原酶溶液、3 mL 0.25%的胰蛋白酶以及7 mL PBS，总体积为20 mL消化液。将离心管置于37 °C水浴中孵育1.5小时，每20分钟摇动一次。</li>
	<li>通过加入20 mL中和液终止消化过程。用移液器吹打约15次以混匀内容物。</li>
	<li>将混合物通过100 µm孔径的滤网过滤。在156 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并用20 mL中和液重新悬浮沉淀，再次孵育。吹打混匀约15次后，在156 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，用10 mL初始培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液接种至100 mm细胞培养皿中。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。每隔三天将原始培养基更换为新鲜的上皮细胞培养基。每两天检查细胞状态并更新培养基。</li>
</ol>
4. 细胞传代
<ol>
	<li>当细胞融合度达到80%-90%时，从培养箱中取出100 mm培养皿，弃去旧培养基，用2 mL PBS洗涤培养皿2次。吸除PBS后，向每个100 mm培养皿中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶溶液。 
	注意：轻轻晃动培养皿，确保胰蛋白酶溶液充分接触皿底。</li>
	<li>将100 mm培养皿置于37 °C培养箱中，消化约7分钟。</li>
	<li>使用显微镜40倍物镜观察细胞，确认大部分细胞已从皿底脱落。</li>
	<li>加入8 mL中和液终止消化反应，并将细胞转移至15 mL离心管中。用移液器吹打10–15次使细胞混匀。在156 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用10 mL上皮细胞培养基重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。</li>
	<li>将1 × 106个细胞接种于10 mL上皮细胞培养基中，置于100 mm培养皿中培养。</li>
	<li>每2天更换一次上皮细胞培养基，并观察细胞生长状态。</li>
</ol>
5. 细胞冷冻保存
<ol>
	<li>重复步骤 4.1–4.4。</li>
	<li>小心移除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 细胞冻存液中。</li>
	<li>将含有细胞的冻存液每管 1 mL 转移至每个冻存管中。</li>
	<li>记录冻存细胞的名称、传代次数和日期。</li>
	<li>将冻存管放入程序降温盒中，在 -80 °C 下过夜。</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出冻存管，迅速转移至液氮中进行长期保存。</li>
</ol>

Protocol for Isolating Mammary Epithelial Cells from Human Tissue

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
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<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

作者声明，本文发表不存在任何利益冲突。

人乳腺上皮细胞（HMECs）在维持乳腺组织的解剖和功能完整性方面至关重要，在科学研究、临床应用及相关领域中具有重要价值15。原代上皮细胞是一类具有有限传代次数和较短生命周期的特化细胞。然而，由于技术限制，HMECs 的培养受到阻碍，进而影响了乳腺癌及其他乳腺相关炎症性疾病的研究进展16。
因此，迫切需要建立一种稳定、可行且高效的方法，从新鲜的乳腺组织中获取人乳腺上皮细胞（HMECs）。Hammond 等人8以及 Band 和 Sager17曾成功分离并培养了乳腺上皮细胞。然而，其所需培养基的成分过于复杂。Taylor-Papidamitriou 等人先前的研究表明，可通过添加生长因子和血清的培养基对乳汁中的腔面细胞进行培养18。尽管该方法可直接从乳汁中提取 HMECs，但非上皮细胞的存在会影响 HMECs 的生长，导致细胞计数难以准确判定。Jin 等人开发了一种条件重编程方法，与传统培养方法相比，该方法可使原代 HMECs 具有更长的生命周期并保持细胞异质性，但其高度依赖特定的培养条件，限制了该方法在其他实验室及应用中的推广使用12。
Zubeldia-Plazaola 团队的一项研究建立了一种优化的分离方法，该方法通过胶原酶和透明质酸酶混合物对剪碎的组织片段进行缓慢消化（过夜），随后在第二天进行三次差速离心，以分离基质/上皮组分。该分离方法结合在培养过程中添加 Y-27632，可获得大量存活的上皮细胞。然而，该研究中使用的乳腺组织量为 40–75 g，且分离过程持续近 2 天9。本文中，我们报告在此方案中仅使用 1 g 组织，并经测试发现该方法在低至 0.25 g 组织时仍有效。胶原酶、分散酶和胰蛋白酶的混合酶可在 1.5 小时内高效消化 1 g 组织，整个操作过程约需 3 小时。在初始培养基中添加 Y-27632 可促进上皮细胞的贴壁与增殖，同时抑制基质细胞的生长19。本研究中尤为重要的是，我们测试了初始培养基的组分，发现使用含 5% FBS 的 DMEM 替代先前文献中使用的 G 培养基，足以有效促进表皮细胞的贴壁与生长10。
在初始培养基中培养2天后，细胞被转移至无血清角质形成细胞培养基中继续培养。初始培养（P0代）接种后的细胞生长模式如图2所示，呈现出集落状生长特征。该分离方法可能获得了包括乳腺组织中肌上皮细胞在内的各种上皮细胞类型，这些细胞类型尚需在未来进一步鉴定。然而，通过比较在初始培养基中添加Y-27632与未添加Y-27632的对照组细胞的生长情况，我们发现使用Y-27632的方法显著提高了细胞产量，并改善了细胞培养效率（图2A）。通常在接种后约9–10天，表皮细胞即可达到适合传代的密度。此外，我们还发现，在完成初始培养并将P0代细胞冻存后复苏，Y-27632的存在仍可促进P1代HMEC的生长（图3）。在我们的实验条件下，超过90%的细胞在冻存后解冻仍能存活。细胞的倍增时间约为72 h，HMEC在正常条件下可稳定生长至第7代传代。
本研究中，细胞高表达乳腺上皮细胞标志物CK7和&#160;GATA3，尤其在初始培养的晚期阶段，几乎所有细胞均呈CK7和GATA3阳性（图4），表明该方法获得的上皮细胞纯度较高。最后，本研究比较了P0和P3代细胞中CK7和GATA3的表达水平，结果显示两者均维持高表达，提示传代未改变细胞表型（图5A、B）。此外，无论是否添加Y-27632，CK7和GATA3均持续高表达，说明Y-27632的添加对细胞表型无影响（图5C、D）。
通过我们的方法促进细胞增殖的主要原因是添加了Y-27632，该物质已被证明对人类上皮细胞的增殖和分化具有有利影响19,20。Chapman等研究发现，使用Y-27632显著增强了上皮细胞的增殖能力，并成功实现了细胞的永生化，且未出现细胞危机的迹象21。在我们的研究中，Y-27632通过促进细胞的贴附和增殖，显著提高了这些上皮细胞的产量19。
该方法的一个关键特征是联合使用dispase和胶原酶来分离上皮组织与结缔组织，同时采用胰蛋白酶将上皮细胞从上皮组织中解离出来22。dispase已被证明是一种快速、高效且温和的酶，能够在保持上皮细胞活力的同时，有效地将未受损的表皮从真皮层分离，或将培养中完整的上皮细胞层从基底表面分离23。I型胶原酶有助于上皮细胞的分离，并确保细胞的活性与完整性24。该方法的另一个关键特征是使用含有Y-27632的初始培养基来培养新分离的HMECs。在细胞接种后第三天贴壁时，更换为角质形成细胞无血清培养基。这种方法显著简化了实验步骤，并降低了实验成本。因此，仅使用少量乳腺组织，我们便获得了非常理想的细胞数量，表明无需大量起始组织。然而，该方法的一个缺点是胰蛋白酶的存在未能充分保护上皮细胞的完整性。另一个潜在的局限性是在初始培养过程中可能存在少量（&#60;1%）肌上皮细胞的污染9。
我们的方法为从成人乳腺组织中分离和培养原代HMEC提供了一种简化且高效的途径。该技术具有操作简便、节省时间以及能够维持细胞基本功能的特点。因此，该技术具有明显优势，有望大量获取上皮细胞。此外，该方法适用于从多种供体中分离和培养HMEC，可用于实验室研究和临床应用，具有高度的通用性和广泛的应用前景。

乳腺癌是全球女性中最常见的癌症类型，也是女性因癌症死亡的首要原因1。乳腺癌的发病机制复杂，涉及遗传、环境和生活方式等多种因素。HMECs（人乳腺上皮细胞）是乳腺组织中重要的活性泌乳细胞，很可能是乳腺癌发生过程中的起始细胞。因此，HMECs 一直是乳腺癌研究中受到最多关注的细胞类型2。此外，由于原代细胞能够保持遗传稳定性、正常形态以及更完整的细胞基本功能，因而能够对复杂的细胞过程提供具有生物学相关性的表征，而这些特性是永生化细胞系所无法实现的3。因此，原代 HMECs 的分离与培养是研究大多数乳腺相关疾病（如乳腺癌和乳腺炎症性疾病）的关键步骤。
目前，已建立了一套稳定且可重复的大鼠、牛、猪和山羊乳腺上皮细胞分离、培养与鉴定的系统4,5,6,7。然而，由于微环境复杂且细胞得率低，原代人乳腺上皮细胞（HMECs）的分离与培养仍具有挑战性。尽管HMECs的培养体系近20年前即已建立，但数十年来科学家们一直在寻找最有效的HMECs分离与培养方法。例如，Hammond等人开发了一种无血清培养基，可使HMECs高效生长8。最近，Zubeldia-Plazaola等人测试了四种不同的分离方法，通过快速/慢速酶消化程序结合顺序过滤或差速离心步骤来获取HMECs9。他们发现，慢速消化联合差速离心是从新鲜乳腺组织中分离HMECs最有效的方法。然而，该方法需要较大体积的组织（40–75 g），并使用较多的消化酶。其操作流程复杂（至少需进行三次不同的离心以获得不同细胞组分），且耗时较长。因此，仍亟需一种简单、快速的方法，能够从小量乳腺组织中高效获取HMECs群体，以满足科研与临床应用的需求9。
我们之前的研究表明，在初始培养基中添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632可简化人皮肤表皮细胞的分离过程10，该方法也已成功用于牙龈上皮细胞的分离11此外，Zubeldia-Plazaola 团队和 Jin 团队早前的研究表明，Y-27632 能够促进快速且无限的 体外 源自乳腺组织的原代上皮细胞的培养9,12本研究旨在验证使用Y-27632是否能够简化HMEC的分离与培养过程，我们成功建立了一种简单且易于操作的方法，可从小块（1 g）乳腺组织中分离HMEC。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>用于 HMECs&amp;nbsp; 解离</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>用于细胞消化</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 孔径滤网</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>用于 HMECs 过滤</td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>用于免疫荧光染色以检测 HMECs 的分化标志物</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>用于细胞离心</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>细胞过滤</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>用于细胞离心</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>用于 HMECs 分离</td></tr><tr><td>中性蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS:42613-33-2</td><td>用于 HMECs 分离</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>中和培养基组分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>中和培养基组分</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td>洗涤液</td></tr><tr><td>兔抗 CK7 抗体</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>用于免疫荧光染色以检测 HMECs 的分化标志物</td></tr><tr><td>兔抗 GATA3 抗体</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>用于免疫荧光染色以检测 HMECs 的分化标志物</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>ROCK 抑制剂</td></tr></tbody></table>

原代人乳腺上皮细胞的分离与培养

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

乳腺是乳房的基本结构，在生殖过程中发挥着至关重要的作用。人乳腺上皮细胞（HMECs）是乳腺癌及其他乳腺相关炎症性疾病的起源细胞，因而受到广泛关注。然而，原代HMECs的分离与培养 体外 由于人乳腺上皮细胞（HMECs）高度分化、角质化且寿命较短，出于研究目的获取这些细胞一直具有挑战性。因此，建立一种简单高效的原代HMECs分离与培养方法，对于乳腺生物学及乳腺相关疾病的研究具有重要的科学价值。本研究中，我们通过酶混合消化法，从小量乳腺组织中成功分离出原代HMECs，并在含Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的5%胎牛血清-DMEM培养基中进行初始培养，随后转移至无血清角质形成细胞培养基中进行扩增培养。该方法可选择性促进上皮细胞生长，从而获得优化的细胞产量。本方法操作简便、实用性强，适用于实验室与临床研究，将为这些重要研究领域提供有价值的见解。

图1展示了该实验流程的示意图。本方案采用多种酶联合消化的方法，具体包括dispase、collagenase和trypsin。该酶组合首先用于将上皮细胞层从其下方的成纤维细胞层中分离，随后使用trypsin将乳腺上皮细胞解离为单细胞悬液。此外，通过在初始培养基中添加Y-27632，可有效促进上皮细胞的生长。因此，该方法可在平均仅10天内获得大量人乳腺上皮细胞（HMECs），满足传代培养的需求。
为了验证 Y-27632 在细胞分离后生长过程中的关键作用，我们将新分离的细胞分为两组：一组使用含有 10 mM Y-27632 的初始培养基进行接种（图 2A）；另一组则使用不添加 Y-27632 的初始培养基作为对照组（图 2B）。培养 2 天后，将两组细胞均更换为表皮细胞培养基（图 1）。从 图 2 可以观察到，与第 3 天相比，添加 Y-27632 的方法在第 9 天显著增加了 HMEC 的数量。HMEC 形成了边界清晰、细胞间连接紧密的聚集体，形似“岛屿”，并从中心向外周环境扩展。接种于含 Y-27632 培养基中的细胞（图 2A）比对照组细胞（图 2B）生长速度明显更快。为了进一步证实 Y-27632 对 HMEC 生长的促进作用，将冻存的 P0 代细胞复苏后，分别在添加或不添加 10 mM Y-27632 的条件下接种，并在不同时间点收集第 1 代（P1）细胞，如 图 3 所示。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）对细胞活力和增殖能力进行分析。如 图 3 所示，使用含 Y-27632 培养基处理的细胞其生长速率显著高于未添加 Y-27632 的对照组细胞。综合上述结果可以看出，在初始培养基中添加 Y-27632 可显著促进分离后贴壁细胞的生长。
为了验证通过该方法获得的细胞为HMECs，我们对P0代HMECs进行了两种乳腺上皮细胞标志物CK7和GATA3的免疫荧光分析。CK7是一种具有诊断意义的细胞角蛋白，是正常乳腺上皮及其增殖性上皮过程腺样分化的标志物13。此外，Kouros-Mehr等人报道，GATA3在乳腺上皮细胞中发挥转录因子功能，并参与维持完全发育乳腺组织中腔面上皮的分化状态14。如图3所示，我们培养并扩增的细胞强烈表达CK7（图4A）和GATA3（图4B）。对CK7和GATA3阳性细胞的定量分析显示，超过98%的细胞同时表达CK7和GATA3（图4C），表明其他类型细胞（如成纤维细胞）的污染极少。我们在初始培养（P0代，图2）中偶尔观察到少量成纤维细胞样细胞（呈细长形态），但在传代后的细胞（P3代，图4D）中极少见到此类细胞。
为了检测HMEC的上皮细胞特性在多次传代后是否能够维持，我们对在有或无Y-27632条件下培养的细胞进行了乳腺上皮细胞标志物CK7和GATA3的qRT-PCR分析（图5）。在P0和P3代细胞中，无论是否添加Y-27632，CK7和GATA3的表达水平均无显著差异，表明其表型和分化特性在培养扩增过程中随时间未发生改变。
<img alt="乳腺上皮细胞培养过程示意图；酶消化、培养基、细胞传代。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：分离与培养人乳腺上皮细胞（HMECs）的操作流程图。 首先，使用手术刀将女性乳腺组织切成小块，并用多种酶联合消化。随后，将获得的细胞沉淀接种于初始培养基中进行培养，该培养基含有10 mM Y-27632。培养2天后，将初始培养基更换为上皮细胞培养基。乳腺上皮细胞在上皮细胞培养基中继续培养约8天，直至达到理想的细胞覆盖率，此时可进行传代。如有需要，部分细胞可用于冷冻保存。缩写：HMECs = human mammary epithelial cells。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 Y-27632 与对照组的细胞生长比较；第 3、5、9 天细胞培养的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：初始接种后获得的 HMEC 图像。 接种后 2 天内，(A) 原代 HMEC 在含 Y-27632 的初始培养基中培养，(B) 原代 HMEC 在不含 Y-27632 的初始培养基中培养。经过 48 小时培养后，两组均更换为无血清角质形成细胞培养基。每隔一天拍摄一次照片以记录细胞生长状态。两组代表性图像均于接种后第 3、5 和 9 天使用倒置显微镜（100 倍）拍摄。比例尺 = 100 µm。缩写：HMECs = human mammary epithelial cells。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度图；Y-27632 组与对照组细胞生长9天，差异显著。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：添加Y-27632可促进第1代人乳腺上皮细胞（P1）的生长。 冻存的P0代细胞解冻后，在有或无Y-27632的条件下进行培养。于培养第1、3、5、7和9天收集细胞（P1），并使用CCK-8试剂盒在450 nm波长下测定吸光度。第1天时，含有Y-27632的初始培养基中贴壁活细胞数量显著高于不含Y-27632的组别。此外，经Y-27632处理的细胞生长曲线呈现更陡峭的上升趋势。**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001。缩写：HMECs = human mammary epithelial cells。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光检测；CK7/GATA3，DAPI染色细胞；结果图；细胞形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：HMEC标志物的表达（P0）。 通过免疫荧光染色分析HMEC中CK7和GATA3的表达。HMEC分别进行（A）CK7（红色）和（B）GATA3（红色）染色；DAPI（蓝色）用于细胞核染色。图像使用激光共聚焦显微镜（400倍）拍摄。比例尺 = 20 µm。（C）染色阳性细胞百分比；（D）HMEC（P3）的代表性图像。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图显示CK7、GATA3 mRNA表达在P0、P3、对照组和Y-27632组之间的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：HMEC在P0和P3代时CK7和GATA3的表达情况。 使用qRT-PCR检测以下表达：（A）第7天P0和P3代HMEC中CK7的表达，（B）P0和P3代HMEC中GATA3的表达，（C）第7天培养时添加或不添加Y27632的P1代HMEC中CK7的表达，（D）第7天培养时添加或不添加Y-27632的P1代HMEC中GATA3的表达。nsp &gt; 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究报道了一种更简便、省时且经济的方案，可从少量乳腺组织中高效分离和培养原代人乳腺上皮细胞（HMECs）。该方案适用于快速制备原代HMECs，可用于实验室和临床应用。

乳腺是乳房的基本结构，在生殖过程中发挥着至关重要的作用。人乳腺上皮细胞（HMECs）是……

我们的研究重点在于阐明难治性肉芽肿性乳腺炎的治疗途径。通过采用一种整合方法，同时结合传统中医与西医治疗手段，揭示驱动该疾病及其并发症的复杂致病机制，致力于缓解这些问题并改善患者的预后。本研究报道了一种更为简便、省时且经济的实验方案，可从少量乳腺组织中高效分离并培养原代人乳腺上皮细胞（HMECs）。本方案适用于快速制备用于实验室和临床应用的原代HMEC。在本研究的基础上，我们旨在建立肉芽肿性乳腺炎乳腺上皮细胞模型，以加深对病因及有效治疗策略的理解。首先解离组织。使用两把镊子去除乳腺组织中的脂肪组织。确保剩余的乳腺组织重量约为一克。将乳腺组织在5毫升75%乙醇溶液中冲洗五秒钟。然后用20毫升洗涤液洗涤两次，每次5分钟。接着使用两把手术刀持续将乳腺组织切碎15分钟，以获得组织匀浆。将切碎的组织转移至50毫升离心管中。加入10毫升dispase和胶原酶溶液、3毫升0.25%胰蛋白酶以及7毫升PBS，共20毫升消化液。将试管置于37摄氏度水浴中孵育1.5小时，每20分钟摇动一次试管。为终止消化过程，加入20毫升中和液，然后用移液器吹打约15次。为确保充分混匀，将混合物通过100微米的滤网过滤。随后在156×g条件下离心5分钟。然后移除上清液。用20毫升中和溶液重复重悬沉淀物。随后用移液器吹打混匀。再次离心5分钟。小心去除上清液，并用10毫升初始培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液接种至100毫米细胞培养皿中。将细胞置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养。每隔三天将原培养基更换为新鲜的上皮细胞培养基。每两天检查细胞并更新培养基。采用该方案，从乳腺组织中分离出人乳腺上皮细胞。分离后的分析显示，经ROCK抑制剂Y-27632处理的细胞较对照组表现出显著增强的生长。CCK-8检测结果表明，含有Y-27632的培养基中的细胞增殖速率明显高于对照培养基中的细胞。免疫荧光检测证实，在后续传代中，大多数细胞表达乳腺上皮细胞标志物CK7和GATA3，其他细胞类型的含量可忽略不计。此外，qRT-PCR研究显示，在多次传代过程中CK7和GATA3的表达水平保持稳定，表明其表型或分化能力具有一致性。

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科研

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生物学

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