轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

我们致力于揭示由爆炸引起的冲击波暴露所导致的轻度创伤性脑损伤的复杂机制。同时，我们也在研究缓解这些症状的方法。本文全面描述了低强度爆炸冲击波引起血脑屏障破坏的初始阶段。

具体而言，血脑屏障的破坏在暴露后约三小时突然开始，在损伤出现后的约一天时间内，受影响的病灶会经历重塑过程。该方法使我们能够更详细地观察血脑屏障的破坏情况，从而提供一种额外的评估指标，用于评价在爆炸事件中可采用的各种治疗方法的有效性。首先，准备冲击管，用于使动物暴露于爆炸引起的冲击波中。

将麻醉后的小鼠置于冲击管出口端5厘米处，确保其身体轴线与冲击管轴线平行但不重合。随后向动物头部施加一次峰值超压为25千帕的冲击波。进行伊文思蓝注射时，用生理盐水配制4%（重量/体积）的伊文思蓝溶液。

涡旋混匀溶液，并避光保存至使用。以每克2.5 µL的剂量将伊文思蓝溶液注入尾静脉。用FITC-葡聚糖染料和多聚甲醛灌注麻醉小鼠后，使用手术剪刀和镊子小心取出脑组织。

将脑组织在相同的固定液中于4摄氏度下后固定过夜。次日，用PBS缓冲液替换固定液。首先，获取经爆炸冲击波处理并注射了伊文思蓝和FITC-葡聚糖染料的小鼠的固定脑组织。

在24孔板的每个孔中加入500微升用磷酸缓冲液配制的20%甘油溶液，并将pH值调节至7.4。使用脑组织切片器将脑组织冠状切分为12片，每片厚度为1毫米。将每一片转移至24孔板中对应的孔内，并将该孔板置于4摄氏度环境中保存至少2小时。

然后用50%甘油磷酸盐缓冲液替换溶液，并在4摄氏度下再次储存至少两小时。最后，用100%甘油替换溶液。如需立即进行显微观察，需将切片在室温下静置至少两小时。

向35毫米玻璃底培养皿底部加入500微升甘油。将脑片转移至甘油溶液中，并用盖玻片覆盖表面。用盖玻片边缘去除多余的甘油。

在荧光显微镜下测量切片的荧光强度。显微测量后，将切片放回培养板的孔中。每孔加入500 µL磷酸缓冲液，并将24孔板在4°C下过夜保存。

用30%甘油磷酸盐缓冲液替换溶液，将培养板置于4°C下孵育至少2小时，然后进行免疫组织化学染色。伊文思蓝标记结果显示，血脑屏障（BBB）的破坏在爆震冲击波暴露后6小时内开始，并持续长达7天。荧光热点的大小和强度各不相同，仅出现伊文思蓝的热点提示在伊文思蓝注射期间发生血脑屏障破坏，而在FITC-葡聚糖注射后提示屏障修复。反应性星形胶质细胞簇与免疫组织化学证实的血脑屏障破坏部位密切相关。

在爆炸冲击波暴露后三天，观察到活化的微胶质细胞和阿米巴样微胶质细胞与反应性星形胶质细胞并存。