Name: 基于生物杂化蚊虫叮咬的原子力显微镜探针的研制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 了解如何制备生物杂化原子力显微镜探针以定量研究蚊虫叮咬机制。该协议提供了一种准确、可控且可靠的方法，用于模拟动物叮咬过程，克服了现有方法的局限性。

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作者感谢加拿大新前沿研究基金（NFRF）和自然科学&#160;加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现计划以及魁北克研究基金会自然科学与技术（FRQNT）硕士培训奖学金。作者还感谢麦吉尔大学Prof. Yaoyao Zhao课题组在部分组件3D打印方面的技术支持。

本方案所使用的蚊虫种类为未感染的成年雌性蚊子 埃及伊蚊 (A. aegypti），冷冻保存于-20 °C冰箱中。该物种由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）丝虫病研究试剂资源中心提供，并通过BEI Resources（NIAID，NIH）进行分发：未感染 埃及伊蚊，菌株 Black Eye Liverpool（冻存），NR-48920。本研究中使用的所有试剂和设备均列于下文 材料表.
1. 从喙中解剖下唇
<ol>
	<li>使用镊子将一只死蚊子放置在显微镜下的载玻片上，并确保喙的末端具有一个逐渐变细的尖端（图 2A）。</li>
	<li>保持蚊子位于载玻片上，将手术刀片轻轻置于蚊子头部附近的唇须上方（图 2B）。</li>
	<li>沿唇须上半部分全长进行切开（切口长约80 µm），切口深度应较浅，仅穿透唇须厚度。操作时需施加轻微压力，确保仅切割唇须，而不损伤其下方的口针束。</li>
	<li>用一对镊子牢固夹住蚊子头部，同时用另一对精密镊子在逐渐变细的尖端与切口位置之间的任意位置轻轻夹住唇须（图 2B）。
	<ol>
		<li>将夹住唇须的镊子朝向逐渐变细的尖端方向拉动（图 2C）。持续拉动，直至唇须完全撕裂并从口针束上彻底移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将蚊子置于显微镜下，检查唇舌尖端是否存在。可通过口针束上是否存在逐渐变细的尖端来确认（图 2D）。</li>
</ol>
2. 将唇瓣的尖端与其他束成员分离
<ol>
	<li>夹紧并闭合一对精密镊子的尖端，将镊子尖端置于唇瓣近尖端处的旁边。</li>
	<li>使用镊子尖端沿束状结构长度的垂直方向，对唇瓣施加轻柔的力（图3A）。</li>
	<li>持续推动唇瓣沿玻片移动，直至唇瓣与其他束状结构成员完全分离。</li>
	<li>在显微镜下检查样品，确认唇瓣与其他束状结构成员之间已实现适当分离（图3，左图）。若分离未成功，请返回步骤2.1。</li>
</ol>
3. 切割唇瓣的尖端
<ol>
	<li>当唇瓣仍在载玻片上时，将手术刀片置于距唇瓣尖端约 200 µm 处（图 4A）。轻轻施加足够的压力，将唇瓣尖端完全切断。尽管理想情况下唇瓣尖端应尽可能短，但目前的方法所能处理的最佳距离约为 200 µm。</li>
	<li>使用任意数字测量软件测量被切割后的唇瓣长度，确保其不超过 300 µm（图 4B）。本实验方案中使用了 ImageJ14。</li>
</ol>
4. 抓取唇瓣的尖端
<ol>
	<li>使用一对精密镊子，在载玻片上定位并分离上唇的尖端。丢弃载玻片上除上唇尖端以外的所有其他部分。</li>
	<li>用同一对精密镊子缓慢而轻柔地夹住上唇，使切割端自由且不被镊子遮挡。同时，确保上唇的方向与镊子的长轴平行，且上唇的切割端朝向远离镊子本体的方向。</li>
	<li>一旦标本被牢固夹住，松开使镊子尖端闭合的夹持力。上唇的尖端将附着在其中一个镊子的尖端上。</li>
	<li>在显微镜下检查镊子的尖端，确认上唇的尖端附着在其中一个镊子的尖端上（图5）。如果上唇尖端不在镊子上，请返回步骤4.2；如果上唇尖端既不在镊子上也不在载玻片上，请返回步骤1。</li>
</ol>
5. 在无针尖悬臂梁上涂抹环氧树脂
<ol>
	<li>将一滴环氧树脂（约 0.05 mL）直接从原装瓶/容器中滴加到新载玻片的边缘。将含有环氧树脂的载玻片置于探针台下并进行聚焦。</li>
	<li>将无针尖的原子力显微镜（AFM）悬臂固定在夹具组件上，固定其基部（即较宽的一端），使悬臂末端自由悬空。确保 AFM 悬臂的底面朝下。</li>
	<li>将操纵器安装到探针台上。</li>
	<li>升高操纵器的 Z 轴，使无针尖悬臂位于含环氧树脂的载玻片上方几毫米处。</li>
	<li>手动移动操纵器，使无针尖悬臂出现在探针台摄像头的视野范围内。</li>
	<li>使用操纵器，沿 X 和 Y 方向移动 AFM 悬臂，直至悬臂末端正对载玻片边缘的环氧树脂上方。</li>
	<li>再次使用操纵器，缓慢地将无针尖悬臂沿 Z 方向下降至载玻片边缘上方。</li>
	<li>当悬臂逐渐下降并接近载玻片时，继续非常缓慢地下降，直到悬臂首次接触到环氧树脂。此时不得再进一步降低悬臂。</li>
	<li>小心启动操纵器，缓慢地沿 X 或 Y 方向移动悬臂，持续朝选定方向移动，直至悬臂完全脱离载玻片上的环氧树脂。此时无针尖悬臂的末端应带有一个微小的环氧树脂液滴，在探针台下可见。</li>
	<li>使用操纵器将悬臂沿 Z 方向抬升。</li>
</ol>
6. 将唇瓣尖端与无尖悬臂梁进行连接
<ol>
	<li>将操纵器绕悬臂的长轴旋转90度，并将其侧放在探针台支架上。在此配置下，原子力显微镜（AFM）悬臂沿长度方向的厚度处于垂直方向。</li>
	<li>将夹持着蚊子口针尖端的精密镊子置于探针台摄像头下方，使口针尖端的整个长度在计算机显示器上清晰可见。</li>
	<li>将固定夹具和无针悬臂的操纵器组件置于探针台摄像头下方，使无针悬臂的整个长度在计算机显示器上清晰可见。</li>
	<li>调节探针台显微镜，使蚊子口针尖端和无针悬臂均处于清晰对焦状态。</li>
	<li>通过小心地手动旋转操纵器，使悬臂与口针尖端呈垂直方向（图6A）。</li>
	<li>利用操纵器的自由度，缓慢在XY方向移动无针悬臂，使悬臂上的胶水接触口针尖端的切割端面（图6B）。</li>
	<li>固化环氧树脂，使悬臂与蚊子口针的连接处牢固固定。</li>
	<li>环氧树脂固化后，轻柔地在XY方向操作操纵器，将悬臂从镊子上移开，确认口针尖端已稳固地竖立在无针悬臂梁上（图6C）。</li>
</ol>

Bio-Hybrid AFM Probe with Mosquito Labrum for Studying Biting Behaviors

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+vector+control+response+2017%E2%80%932030%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global vector control response 2017–2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li>
<li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+mosquitoes%E2%80%99+painless+piercing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Lessons from mosquitoes’ painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li>
<li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle%2C+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journ+of+Contr+Relea%22%5BJournal%5D)">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li>
<li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito%E2%80%99s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Advan+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li>
<li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248(2020).</li>
<li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Probe+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li>
<li>García, R., Peréz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+and+Nanobio%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li>
<li>Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology%5BTitle%5D)+AND+%22Meas+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001(2017).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis%3A+An+elegant+biomicroelectromechanical+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910(2010).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bionic+Eng%22%5BJournal%5D)">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li>
<li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinspir+Biomim%22%5BJournal%5D)">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001(2008).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide">http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide</a> (2012).</li>
<li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures%5BTitle%5D)+AND+%22Measur+Sci+and+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本实验方案的第1步旨在清除生物样本中不需要的唇瓣。为此，需在唇瓣上进行切口，但不得切到位于唇瓣正下方的细束（图1）。由于唇瓣与细束在其交界处并未连接（即唇瓣可沿细束滑动，仅通过其与蚊子头部的附着而固定位置），因此所进行的切口旨在将部分唇瓣从蚊子头部分离，从而便于去除外部覆盖物。当从样本中牵拉唇瓣时，操作人员会感受到轻微阻力，这是由于唇瓣下半部分仍附着在蚊子身上所致。这种阻力应能相对容易地被释放，因为切口会促进生物材料的裂纹扩展，导致未切割部分的唇瓣撕裂，从而使整个唇瓣在牵拉过程中从细束上滑脱。如果切口不足，操作人员在牵拉时可能会遇到过大阻力，建议在继续后续步骤前重新进行切口。
在操作第1步和第4步时，处理盂唇需手法轻柔并保持耐心 通过 用镊子夹取时需小心。尽管唇基相对坚韧，但如果镊子施加的压力过大，仍可能造成损伤。操作人员应轻轻夹住唇叶/唇基，即仅施加足以固定唇叶/唇基的最小力度。可在第1步和第4步结束时，在显微镜下检查样本，评估是否存在损伤。建议沿喙的全长检查有无异常（如凹陷、撕裂、节段分离）。若怀疑唇基尖端受损，应弃用该样本并重新开始实验流程。
该实验方案的关键步骤（如步骤3和步骤6）需要特别注意。在执行步骤3时，必须使用解剖刀手动切割唇须的尖端。若切割过短，会导致后续实验难度显著增加，因为其尺寸过小而难以操作。相反，若尖端长度超过300 µm，则会因唇须尖端与原子力显微镜（AFM）悬臂之间产生过大的垂直偏移而无法顺利安装到AFM悬臂上。这种偏移主要由安装过程中的不完美或样品本身可能存在的弯曲所引起，且在唇须较长时问题更为突出。此外，带有过长尖端的悬臂在AFM下也极难操作。在步骤3中，需注意所有束状口针结构（包括唇须、上颚口针、下颚口针和舌下针）在此过程中均可能被切断。在步骤4中，由于步骤2中已进行人工分离，因此可轻松定位并从其余口针中分离出唇须。在步骤6中，尽管在光学显微镜下几乎无法确保尖端与悬臂完全垂直，但仍需尽量减小倾斜角度，以避免在后续使用中产生不必要的加载条件。
选择合适的环氧树脂将 sting 与原子力显微镜（AFM）悬臂梁连接也至关重要。曾测试多种慢固化双组分环氧树脂，但后续发现这些材料并不理想，因为在固化过程中实验室地面的任何微小振动都可能导致实验失败。因此，最终采用了紫外光（UV）固化环氧树脂。所使用的胶粘剂是一种低粘度、快速固化的环氧树脂，可在紫外光照射下5秒内完成固化。固化后，胶体变得非常坚硬且具有优异的强度，使制备的唇瓣-悬臂梁探针如同一个整体，不会在粘接处发生断裂或变形。该方案在固化前提供了充足的时间，以便将装置调整至正确位置，从而将 sting 粘接到 AFM 悬臂梁上（步骤6.3），同时因其可按需固化的特性，有效避免了环境振动带来的问题。
本方案中其余关键设备包括探针台、尖头镊子和悬臂梁。所使用的探针台配备有安装在相机上的5倍镜头；然而，本方案并不必须使用完全相同的探针台型号。在选择探针台时，唯一需要优先考虑的是确保原子力显微镜（AFM）悬臂梁和唇瓣的清晰且易于观察的视野。所用尖头镊子的尖端尺寸为0.5 mm × 0.1 mm。必须使用具有此类尖端尺寸或相近规格的镊子，因为若使用精细度较低的镊子，可能在操作唇瓣时造成困难。本方案中使用的悬臂梁来自商业来源（见材料表）。选择该型号悬臂梁的原因在于其具有较高的刚度，因为必须将较大的力传递至蚊子探针的尖端，以模拟真实的皮肤穿刺过程。通常情况下，所有基于刺针的探针所使用的AFM悬臂梁均不能过于柔软，因为刚性不足会导致在AFM测试过程中悬臂梁发生弯曲，进而导致刺针探针尖端无法产生足够的压力。这将导致探针无法准确模拟刺入过程，因此本方案要求必须使用高刚性的无针AFM悬臂梁。
总之，与需要活体蚊子和人类志愿者来开展类似研究的其他方法相比，使用基于蚊子口器的生物杂化原子力显微镜（AFM）探针进行定量力学穿刺/叮咬研究具有独特的优势4,11,12。AFM 具有超高的传感分辨率，可实现前所未有的测量精度，而生物杂化探针能够高度逼真地模拟实际叮咬过程，并可在无需人类志愿者参与的情况下完成具有统计学意义的大量测量4,11,12。此外，用于制造工程化微针的材料通常容易发生断裂或屈曲3,4，无法真实反映蚊子口器的力学特性。直接使用蚊子自身结构部件更能准确再现真实的叮咬场景。本实验方案未来有望进一步优化并实现自动化，以支持高通量生产。最后，该方法还可拓展应用于制备其他类型的生物杂化 AFM 探针，例如利用不同动物的刺器官来定量研究多种多样的叮咬或穿刺行为。

世界卫生组织（WHO）报告称，媒介传播疾病（VBDs）占所有传染病的17%以上，每年在全球造成超过70万例死亡。例如，蚊子作为世界上最致命的动物，通过吸血节肢动物传播多种病原体，如登革热、疟疾和寨卡病毒，每年导致约7亿人感染1。探索开发有效措施以预防媒介传播疾病至关重要，其中包括模拟蚊子的穿刺行为以研究其叮咬机制，以及对潜在屏障材料进行研究以验证其阻止穿刺的有效性。其中一项关键挑战在于建立适当的方法来开展此类研究。已有研究尝试开发出在几何结构上类似蚊子刺吸式口器的微尺度针头；然而，许多用于制造这些微针的材料（如粘弹性材料2、硅（Si）、玻璃、陶瓷3等）在机械性能上与蚊子口器的生物材料存在差异。工程材料可能较脆，易发生断裂或屈曲3,4，而蚊子的口器则更能抵抗断裂或屈曲4。使用蚊子的上唇（labrum）而非工程材料构建生物杂合探针的优势在于，其能更真实地再现蚊子的穿刺机制。此外，为了进行定量研究（如精确测量作用力5），必须将微针与专用工具集成，而使用定制的工程化微针装置难以实现这一目标。
基于原子力显微镜（AFM）的方法具有广阔前景，其工作原理是利用带有超细探针尖端的悬臂，将探针精确地定位在样品表面附近。该探针尖端可沿表面扫描，或向表面施加压力，因与样品相互作用而受到不同的吸引力或排斥力6。这些相互作用导致悬臂发生偏转，偏转程度通过激光束从悬臂顶部反射至光电探测器进行追踪6。该系统对微小位移具有极高的灵敏度，使AFM能够执行多种测量，包括但不限于亚纳米级精度的形貌成像、皮牛至微牛范围内的力测量，以及全面的多物理场分析7。例如，可通过AFM压痕实验精确评估样品对外加力的响应，并结合适当的分析模型测量样品的硬度、弹性及其他力学性能8。AFM探针通常由硅（Si）或氮化硅（Si3N4）制成8，长度为20–300 µm9，探针尖端半径在数纳米至数十纳米量级10。纳米级的尖端半径适用于高分辨率成像等应用；然而，在模拟生物刺入行为的研究中，其刚度、半径、形状和长径比等特性并不具备生物刺针的特征。例如，蚊子的微针结构为口器束（fascicle），其长径比约为6011（长度约1.5 mm至2 mm，直径约30 µm）12。尽管传统的AFM探针可近似模拟类似上唇（labrum）的生物刺针结构，但其材料特性和几何尺寸无法真实反映实际叮咬过程中的情况。
为了实现对模拟昆虫或其他带刺动物生物叮咬行为的穿透特性进行定量研究，本文开发了一种利用生物刺针作为探针尖端的生物杂化原子力显微镜（AFM）悬臂梁的制备方法。作为案例研究，成功制备了带有蚊子口器（labrum）尖端的AFM悬臂梁。结合文献中关于蚊子刺入宿主皮肤时典型插入力的已有数据12,13，这种生物杂化AFM悬臂梁有望在常规AFM系统中实现对蚊子叮咬行为的近真实模拟。利用微型生物刺针制备生物杂化AFM悬臂梁的该方案，也可推广应用于其他基于尖锐刺针的生物杂化AFM悬臂梁的开发，以定量研究多种叮咬机制。
术语 
图1 展示了喙及其相关组成部分的示意图，其定义如下：（1）喙：蚊子口部的一个身体部分，使蚊子能够自行取食，具有核壳结构，由内核（束）和外壳（唇瓣）组成；（2）唇瓣：喙的深色钝状外层覆盖结构2；（3）束：位于唇瓣内部的一组细针状结构，包括两根上颚、两根下颚、一根下咽和一根上唇2；（4）下咽：负责向宿主血液中分泌唾液的结构2；（5）上颚：具锯齿状结构，协助取食机制2；（5）下颚：与上颚类似，协助蚊子完成取食过程，且具有尖锐的末端2；（6）上唇：主要负责刺入受害者皮肤的结构，其尺寸明显大于上颚、下颚和下咽。此外，它还具有感觉结构，可帮助其定位皮肤下的血管和内部通道2；（7）操纵器：一种具有三个自由度和微米级定位精度的装置，可在XYZ方向上移动；（8）夹具组件：一种定制的两部分夹具，安装在操纵器上，用于在实验过程中固定无针尖的原子力显微镜（AFM）悬臂梁。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;5-SA-SE 直锥超细尖镊子</td><td>Excelta</td><td>N/A</td><td>用于操作或解剖喙。</td></tr><tr><td>C-4D 探针台</td><td>Everbeing Int&amp;rsquo;l Corp&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>用于原子力显微镜（AFM）组装。</td></tr><tr><td>无针尖轻敲模式悬臂梁</td><td>NanoAndMore USA</td><td>TL-NCH</td><td>用于安装唇基的原子力显微镜（AFM）悬臂梁。&lt;br/&gt; 规格如下：&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;形状&lt;/strong&gt;：梁&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;力常数&lt;/strong&gt;：42 N/m（10 - 130 N/m）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;共振频率&lt;/strong&gt;：330 kHz（204 - 497 kHz）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;长度&lt;/strong&gt;：125 &amp;micro;m（115 - 135 &amp;micro;m）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;宽度&lt;/strong&gt;：30 &amp;micro;m（22.5 - 37.5 &amp;micro;m）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;厚度&lt;/strong&gt;：4 &amp;micro;m（3 - 5 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>紫外固化环氧树脂</td><td>Let's resin</td><td>ALR00146</td><td>用于螫针固定。</td></tr></tbody></table>

基于生物混合蚊子刺针的原子力显微镜探针的开发

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

蚊子因其传播疾病的能力而被认为是人类最致命的动物，对公共卫生构成长期挑战。目前主要的预防策略依赖于化学驱蚊剂，但由于蚊子会迅速产生抗性，这些驱蚊剂往往效果有限。因此，开发新的预防方法至关重要。此类方法的研发依赖于对蚊子叮咬行为的深入理解，需要建立一种能够准确模拟真实叮咬场景、具备可控测试参数并可进行定量测量的实验体系。为填补这一空白，研究人员设计了一种生物混合型原子力显微镜（AFM）探针，其探针尖端采用生物结构—— specifically，蚊子的上唇（labrum）作为感应元件。这种生物混合探针可与标准AFM系统兼容，能够近乎真实地模拟蚊子的刺入行为。该方法标志着在叮咬机制定量研究方面迈出了重要一步，有望推动有效阻断媒介传播疾病（VBDs）策略的开发，并为防治蚊媒传染病开辟新途径。

所制备的生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的扫描电子显微镜（SEM）图像见图7。唇瓣末端已成功粘接到无针尖的悬臂梁上。由于蚊子口针具有天然曲率，且本方案依赖手动操作，因此很难获得口针针尖与悬臂完全垂直的探针。口针与垂直于悬臂的假想中心线之间的偏心角通常约为10度。尽管在将探针安装到AFM悬臂时这一问题较为常见15，但在进行力/应力分析时必须考虑这种非预期的倾斜。未来的研究可着重优化制备工艺，并利用该生物杂化探针开展相关实验。这是首次尝试利用昆虫口针制备生物杂化AFM探针。
<img alt="昆虫口器解剖结构，喙与口针束的示意图，含标注结构，用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：蚊子喙的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示镊子和手术刀片在蚊子喙器解剖过程中关键位置的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：蚊子喙器中唇须的去除。（A）具有完整喙器的蚊子，显示尖端完整且呈锥形。（B）在去除唇须过程中，于唇须上进行切口及放置镊子的位置。（C）去除唇须时镊子拉动的方向。（D）去除唇须后最终解剖得到的口针束，其顶端保持完整，锥形的上唇尖端仍存在且完好无损。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="昆虫口器束显微图像分析；突出显示上唇及口器束各组成部分、镊子操作方向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：分离上唇与不需要的口器束组分。（A）使用镊子分离喙部口器束组分时，镊子放置的位置及推动方向示意图。（B）经操作后分离出上唇的喙部结构。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="头皮刀片放置位置及唇瓣尖端刺穿皮肤的显微解剖示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：分离目标唇瓣尖端以安装至原子力显微镜悬臂。 （A）为切除唇瓣尖端而进行唇瓣切口的位置。比例尺：200 µm。（B）从唇瓣主体上切割下来的唇瓣尖端，长度约为 200–300 µm。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像；用镊子夹住上唇末端；研究昆虫刺入过程；生物结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：在粘合前将上唇末端固定到镊子上。 上唇末端粘附在镊子尖端，上唇未切割的一端自由伸展，方向远离镊子本体。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="悬臂梁测量序列：微观悬臂梁接触分析；上唇相互作用过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：将上唇尖端安装至无尖悬臂梁的步骤序列。（A）将无尖悬臂梁调整至与上唇垂直的位置。（B）将无尖悬臂梁与上唇合并，并固化用于固定两者连接处的环氧粘合剂。（C）最终固化完成的生物杂化原子力显微镜探针，此时上唇已不再由镊子支撑。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="悬臂梁示意图，含下唇突尖端细节；用于纳米级分析的显微镜装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：生物杂化原子力显微镜探针的扫描电子显微镜图像。 （A）下唇突尖端与无尖端悬臂梁的整体视图。比例尺：200 µm。（B）下唇突尖端的放大视图。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

对昆虫叮咬行为进行定量且受控的研究，对于制定有效策略以应对虫媒传播疾病至关重要。在此背景下，本文介绍了一种用于制备生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的方法。

蚊子因其传播疾病的能力而被认为是人类最致命的动物，对公共卫生构成了持续的挑战。

我们旨在开发一种原子力显微镜（AFM）悬臂梁，以期对蚊子的咬合机制进行定量研究。本实验方案提供了一种新方法，用于制备精确、可控且可靠的AFM探针，以研究动物的咬合或发声过程。本方案的目标是精确模拟动物咬合过程，而现有方法往往存在难以控制、无法可靠地重复，或在某些情况下完全不准确的问题。我们的工作具有双重意义。首先，我们建立了一种实验方案，使其他研究人员能够制备属于自己的定制化生物杂化原子力显微镜悬臂梁。其次，我们的研究为开发其他将测试系统与生物材料相结合的实验方案铺平了道路，从而构建出更接近真实情况的测试环境。首先，将一只死亡的蚊子放置在载玻片上。然后，将解剖刀片轻轻置于蚊子头部附近的唇基上。沿唇基上半部分进行切口，切口应贯穿整个上半区域，且穿透深度较浅。接下来，用一对镊子牢固地夹住蚊子的头部。再用另一对精密镊子轻轻夹住唇基末端尖端与切口之间的下唇。然后将夹住下唇的镊子朝末端尖端方向拉动。将蚊子置于显微镜下，检查上唇尖端是否存在。现在夹紧并闭合一对精密镊子的尖端，并将镊子尖端紧靠上唇尖端放置。使用镊子尖端对上唇施加一个垂直于束状结构长度方向的轻柔力量。继续推动玻璃载片上的唇瓣，直至其与其他束成员分离。最后，在显微镜下检查样本，以确认分离效果。首先，取含有蚊子唇瓣的玻璃载片。将手术刀片置于距唇基尖端约 200 微米处，然后施加轻柔压力，将唇基尖端完全切断。使用精密镊子在载玻片上定位并分离唇基的尖端。然后使用同一把镊子轻轻夹住唇基。一旦标本被牢固夹住，逐渐松开夹持力度。在显微镜下检查镊子尖端，确认其中一侧镊尖上附有唇基的尖端部分。首先，在新的载玻片边缘放置少量环氧树脂。然后将载玻片置于探针台下并进行聚焦。将无针尖的原子力显微镜悬臂安装到夹具组件上。固定悬臂梁的基部，使其末端自由悬空。接着，将操纵器连接到探针台。调节操纵器的 z 轴，使悬臂梁升高至含有环氧树脂的玻片上方几毫米处。然后使用操纵器，在玻璃载片的环氧树脂上方沿 x 和 y 方向调整原子力显微镜（AFM）悬臂的位置。仔细将悬臂尖端对准环氧树脂正上方。随后，缓慢降低无尖端悬臂在 z 方向的位置，使其朝向玻璃载片上的环氧树脂移动，直至接触到环氧树脂。随后，轻轻将悬臂在 x 和 y 方向上从环氧树脂移开，确保其与载玻片分离。使用操纵器将悬臂在 z 方向上抬起。围绕悬臂的长轴将操纵器旋转 90 度，并将其侧向放置在探针台上。然后将精密镊子夹住唇瓣的尖端，并置于探针台相机下方，使其整个长度均可见。随后，将带有夹具和悬臂的操纵器组件置于相机下方，使悬臂的整个长度均可见。旋转操纵器，调整悬臂与唇瓣尖端垂直。利用操纵器的自由度，缓慢地在 x-y 方向上移动无尖端悬臂，使悬臂上的胶水接触唇瓣尖端的切割端。然后固化环氧树脂，以固定悬臂与唇瓣之间的连接。轻柔地将悬臂移离镊子，确保唇瓣尖端已牢固附着在悬臂梁上。

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基于生物杂化蚊虫叮咬的原子力显微镜探针的研制

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了解如何制备生物杂化原子力显微镜探针以定量研究蚊虫叮咬机制。该协议提供了一种准确、可控且可靠的方法，用于模拟动物叮咬过程，克服了现有方法的局限性。

基于生物混合蚊子刺针的原子力显微镜探针的开发

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