Name: 高通量生物打印方法，用于模拟具有尺寸和图案灵活性的标准六孔板中的血管通透性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习高通量3D生物打印技术，用于在标准六孔板中构建血管通道模型。该方法整合多材料打印与计算机控制技术，实现可重复的体外人血管模型制备，支持实时分析并与酶标仪及显微成像系统兼容，助力血管通透性相关疾病治疗研究。

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本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由韩国政府（科学技术信息通信部，MSIT）资助 [编号 NRF-2019R1C1C1009606；编号 2020R1A5A8018367；以及编号 RS-2024-00423107]。本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的生物与医学技术发展项目资助，该项目由科学技术信息通信部（MSIT）资助 [编号 NRF-2022M3A9E4017151 和编号 NRF-2022M3A9E4082654]。本工作还获得了产业通商资源部（MOTIE，韩国）资助的技术创新项目 [编号 20015148] 和炼金术士计划 [编号 20012378] 的支持。本工作也得到了韩国食品医药品安全处食品农业林业技术规划与评价院（IPET）通过农业食品融合技术研究人才培育项目的支持，该项目由农业食品农村事务部（MAFRA）资助 [编号 RS-2024-00397026]。

1. 生物打印机 G 代码的生成
<ol>
	<li>为生成和可视化打印路径，请访问在线 G-code 模拟工具（例如 NCviewer）。</li>
	<li>在界面中点击 新建文件 图标，以创建一个新的 G-code 文件。</li>
	<li>通过手动编写牺牲性通道和硅胶腔室的 G-code 指令来生成打印路径。以标准六孔板的尺寸为参考，构建相应几何结构。 
	注意：此处使用的 G-code 基于计算机数控（Computer Numerical Control, CNC）代码。各指令的功能详见 补充表 S1。选择六孔板格式是因为其与商用微孔板读数仪和显微镜系统的兼容性，且能够容纳足够的培养基体积以支持内皮层的成熟，从而减少频繁换液的需求。该制备方案也可适配其他标准孔板使用。</li>
	<li>完成 G-code 编写后，在界面中点击 保存文件 图标，将文件以 .nc 扩展名下载。 
	注意：也可使用其他可用的 G-code 生成算法来创建打印路径。血管通道的几何形状可在 G-code 中进行调整。</li>
</ol>
2. 制备牺牲层油墨和硅胶腔室油墨
注意：本方案中使用的所有材料的来源均列在材料表中。
<ol>
	<li>按10:2的比例混合两种硅胶聚合物SE1700和聚二甲基硅氧烷（PDMS）。每种聚合物按聚合物与固化剂10:1的比例加入相应的固化剂。</li>
	<li>使用行星式混合器以2,000 rpm的速度充分混合并脱气聚合物混合物。</li>
	<li>用刮刀将混合好的硅胶聚合物转移至10 mL一次性注射器中。将装有混合物的注射器在5 °C条件下以400 × g离心3分钟，以确保混合物均匀一致，并避免打印过程中产生气泡。 
	注意：添加固化剂后，应在2小时内使用腔室油墨，以确保最佳打印质量。在准备打印期间，将注射器保存在5 °C环境中。此步骤有助于减缓油墨固化，否则可能改变打印参数。</li>
	<li>称取Pluronic F-127（PF127），用蒸馏水配制40%（w/v）的PF127储备溶液。</li>
	<li>在行星式混合器中以400 × g混合PF127溶液3分钟，使其均匀。将均质后的混合物置于4 °C环境中，以确保PF127完全溶解。</li>
	<li>用Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）配制1,000单位/mL的凝血酶储备溶液。 
	注意：将凝血酶储备溶液分装为100 µL等份，以避免反复冻融。分装后的溶液应保存在-20 °C，保存时间不超过6个月。</li>
	<li>打印前，通过将凝血酶按1:10比例与PF127混合，制备牺牲性油墨，最终工作浓度为PF127 36%（w/v）和凝血酶100单位/mL。配制1 mL牺牲性油墨时，将100 µL凝血酶储备溶液与900 µL PF127储备溶液混合。 
	注意：为单个培养板打印制备牺牲性油墨时，1 mL总体积已足够有余。</li>
</ol>
3. 制备工艺
<ol>
	<li>在开始 fabrication 过程之前，使用强度为 100 瓦的氧气（O2）等离子体处理六孔板，处理时间为 1 分钟。</li>
	<li>按照第 2 节所述步骤制备牺牲墨水和硅胶墨水，确保墨水中无气泡且混合均匀，以实现一致的打印效果。小心地将墨水装入生物打印机的打印头中。将生物打印机打印头的温度设定为牺牲墨水 37 °C，硅胶墨水 5 °C。</li>
	<li>在硅胶注射器上安装一个 22 G 双螺纹锥形喷嘴。对于牺牲墨水，根据所需通道直径选择合适的喷嘴尺寸。 
	注意：本实验中展示了三种喷嘴尺寸：18 G、20 G 和 22 G。最佳打印参数，包括打印压力和打印头速度，详见表 1。</li>
	<li>加载所需的 G 代码，并在生物打印机的软件界面上按下servo ready功能键持续 3 秒。将六孔板放置于打印平台的 G 代码起始位置，点击start以启动打印过程。 
	注意：通常，制备一个包含六个腔室的六孔板大约需要 1 小时 10 分钟。第 3.4 步中 G 代码的加载与执行会因所使用的具体生物打印机型号而有所不同。使用生物打印机时应保持无菌条件，避免污染。</li>
	<li>将六孔板盖上盖子，转移至 37 °C 的加湿 CO2 培养箱中，孵育 72 小时以固化硅胶腔室。 
	注意：尽管硅胶在培养箱内的固化速度可能较慢，但切勿将六孔板置于干燥烘箱中。</li>
</ol>
4. 水凝胶制备与通道包埋
<ol>
	<li>准备一个50 mL的锥形管，加入20 mL的1×PBS。将0.01 g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基二苯基亚磷酸锂（LAP）加入该锥形管中，配制成0.05%（w/v）的LAP溶液。涡旋振荡至粉末完全溶解。 
	注意：用铝箔包裹锥形管以避光。将LAP储备液储存于4 °C。</li>
	<li>向20 mL LAP溶液中加入3 g甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和0.2 g纤维蛋白原，使终浓度为15% GelMA和1%纤维蛋白原（简称GelFib）。将混合物置于37 °C水浴中，并定期涡旋混匀，直至溶液完全溶解。</li>
	<li>按照第3节所述完成制备后，向每个水凝胶腔室中加入300 µL预热的GelFib，以包埋牺牲模板。使用波长为405 nm、强度为85 mW/cm2的紫外光（UV）照射120 s，快速交联GelMA。对所有其他孔重复此操作。 
	注意：纤维蛋白原在接触含有凝血酶的牺牲模板后会迅速交联。建议逐孔添加水凝胶并进行UV交联，以避免GelMA在室温下发生非预期凝胶化。此外，在UV固化过程中应保持无菌条件，防止污染。</li>
	<li>向每个孔的血管通道两侧各加入1 mL DPBS，并将培养板置于4 °C下15 min，使PF127液化。</li>
	<li>15 min后，吸除DPBS，并重复步骤4.5共3次，以彻底清洗PF127。</li>
	<li>在向通道中接种细胞前，通过通道灌注含1% Matrigel的DMEM F12培养基30 min，以增强细胞贴附。</li>
</ol>
5. 人脐静脉内皮细胞培养
<ol>
	<li>将内皮细胞生长培养基（ECGM）置于 37 °C 水浴中预热 30 分钟。</li>
	<li>同时，从液氮罐中取出一管冻存的 HUVEC 细胞，轻轻拧松管盖，再重新拧紧，以释放螺纹中的氮气。立即将冻存管浸入 37 °C 水浴中解冻 2 分钟，确保管内仍残留少量冰。用 70% 乙醇冲洗冻存管表面，防止污染。 
	注意：从液氮罐中取细胞时需佩戴安全护目镜。此过程中冻存管管盖必须保持在水面以上。</li>
	<li>准备一个 15 mL 圆锥形离心管，加入 5 mL 预热的 ECGM 培养基。使用移液器小心地将解冻后的细胞从冻存管转移至该离心管中。为确保无细胞残留，向冻存管内加入 1 mL 新鲜预热的培养基，轻轻冲洗内壁，再将冲洗液一并转移至离心管中。</li>
	<li>将离心管以 200 × g 离心 3 分钟，获得细胞沉淀。弃去上清液，用 10 mL 新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至 T75 培养瓶中，并将培养瓶置于 37 °C、含加湿 CO2 的培养箱中培养。 
	注意：此步骤通过离心去除冻存管中冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）至关重要。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合度达到 80–90%。</li>
</ol>
6. 通道的内皮化
<ol>
	<li>将 ECGM、DPBS、胰蛋白酶中和液以及含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶（TE）置于 37 °C 水浴中预热 30 分钟。</li>
	<li>当细胞融合度达到 90% 时，用 10 mL DPBS 冲洗 T75 培养瓶中的细胞，加入 1 mL 0.25% TE 溶液，孵育 3 分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶侧面，加入 5 mL 胰蛋白酶中和液以中和 TE 活性。将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。用 5 mL 新鲜 ECGM 收集残留细胞，并将其加入同一离心管中。</li>
	<li>以 250 × g 离心 3 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 ECGM 中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并重复步骤 6.4 以获得细胞沉淀。将 300 万个细胞重悬于 90 µL 新鲜 ECGM 中。</li>
	<li>在将细胞悬液引入通道前，短暂使用真空抽吸清除通道内腔。 
	注意：避免长时间抽吸通道，以免破坏其结构完整性。</li>
	<li>以每孔 50 万个细胞的接种密度，轻柔地将细胞悬液加入通道中。使用微量移液器加入约 15 µL 悬液以充满通道。 
	注意：接种密度可能因通道尺寸而异。该密度适用于使用 20 G 喷嘴打印、内径约为 900 µm 的通道。</li>
	<li>将培养板水平放置于培养箱中静置 2 小时。随后将培养板翻转 180°，并保持水平状态继续培养 2 小时。</li>
	<li>4 小时后，用 DPBS 冲洗通道以去除未贴壁和死亡的细胞。向每个孔中加入 2 mL 新鲜 ECGM（通道两侧各加 1 mL）。将培养板置于摇床上，使通道方向与摇动方向平行，设置倾斜角度为 10°、转速为 5 rpm，开始动态培养。每隔一天更换一次培养基。 
	注意：动态培养可增强储液池与通道之间的培养基交换，有助于细胞在过夜期间增殖。</li>
</ol>
7. 内皮成熟度评估
<ol>
	<li>将 ECGM 和 DPBS 置于 37 °C 水浴中预热 30 分钟，CCK8 试剂置于室温下平衡。</li>
	<li>每孔用 100 µL CCK8 试剂与 1 mL 新鲜 ECGM 混合配制 CCK8 工作液。若处理一个六孔板/6 个通道，则将 600 µL CCK8 试剂与 6 mL 新鲜 ECGM 混合，配制总量为 6.6 mL 的工作液。</li>
	<li>用吸液法移除培养基，并用 DPBS 冲洗各通道。每孔加入 1 mL CCK8 工作液，将培养板平放于培养箱中孵育 30 分钟。随后，按照步骤 6.9 所述在摇床上启动动态培养，并持续此过程 3 小时。</li>
	<li>3 小时后，将培养板倾斜，吸出各孔内容物并转移至新的六孔板中。用 DPBS 冲洗通道，然后加入新鲜培养基。 
	注意：在测定吸光度前，用铝箔覆盖培养板。所有孔中应保持一致的试剂体积，以确保读数均匀。移液时需小心避免引入气泡，以免影响光密度读数的准确性。</li>
	<li>轻轻振荡培养板 15 秒，使颜色均匀混合后，使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。</li>
	<li>在预设的时间间隔重复此操作。计算每个时间点的平均光密度值，并使用绘图软件绘制生长曲线。该曲线反映了内皮层随时间推移的相对成熟程度。</li>
</ol>
8. 通透性测定
<ol>
	<li>移除一个目标孔中的培养基。 
	注意：对于通透性检测，建议分别处理每个孔，以防止其他通道干燥，从而避免其血管通透性发生改变。</li>
	<li>通过将70 kDa的FITC标记葡聚糖溶解于DPBS中，配制6 mL浓度为0.1 mg/mL的溶液。 
	注意：通过将100 mg的FITC标记葡聚糖溶解于5 mL DPBS中，配制20 mg/mL的母液。轻轻涡旋混匀后，将溶液分装为每管500 µL至1.5 mL离心管中，以避免反复冻融。这些分装样品可在-20 °C下保存最多6个月。在进行检测前，将母液稀释至0.1 mg/mL的工作浓度。</li>
	<li>将培养板牢固地放置在显微镜载物台上，调整相差模式下的物镜放大倍数，确保在视野内清晰可见目标区域的通道壁以及附近的凝胶。 
	注意：为了有效评估通透性，应尽量在视野中最大化目标区域周围凝胶的面积；这一点对于准确监测葡聚糖的运输至关重要。</li>
	<li>在聚焦至目标区域后，从相差模式切换至荧光模式。在图像采集选项卡中，将FITC添加至宽场通道，并在加入葡聚糖溶液前采集一张图像，用于计算背景荧光强度。随后，从通道一侧加入1 mL FITC葡聚糖工作溶液，使溶液在静水压差的驱动下流向孔的另一侧。</li>
	<li>按照预设的时间间隔采集图像——对于通透性较高的通道应更频繁地采集，而对于通透性较低的通道则可减少采集频率。</li>
</ol>
9. 在 ImageJ 中测量荧光强度
<ol>
	<li>在 ImageJ 图像分析软件中，测量初始时间点的强度（It1), 较晚时间点观察到的平均强度（It2），以及背景噪声引起的强度（Ib)，如下所述。使用公式（1) 以计算通透系数（Pd）。 t1 和 t2 指图像采集的初始时间点和后续时间点。 
	<img alt="用于传热分析的 Pd 方程；与热导率研究相关的数学公式。" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">        (1)
	<ol>
		<li>启动 ImageJ，打开在初始时间点获取的图像。</li>
		<li>在 ImageJ 中设置比例尺。导航至 分析 | 设置比例尺输入已知的比例尺和测量单位。</li>
		<li>选择 矩形工具 在需要测量荧光强度的凝胶区域上绘制一个矩形。</li>
		<li>导航至 分析 | 设置测量 并确保 平均灰度值 进行检查。 
		注：此选项用于测量选定区域内的平均强度。可根据具体分析需要选择其他参数。</li>
		<li>区域仍处于选中状态时，导航至 分析 | 测量 或直接按下 M. 等待一个 结果 窗口将打开，显示平均荧光强度及所选的其他参数。</li>
		<li>进行三次测量，并在电子表格中计算平均荧光强度值。</li>
		<li>对在后续时间点 t 拍摄的图像重复此操作2以及在加入葡聚糖溶液前采集的图像，用于计算后续时间点的荧光强度，以确定背景荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

3D Bioprinting for Rapid Vascular Network Fabrication Using Vessels-on-a-Plate

作者声明不存在竞争性财务利益。

利用3D生物打印技术的精确性、自动化以及计算机控制特性，我们建立了一种在标准六孔板中制备血管通道的简化方法。选择六孔板是因为其与商用微孔板读数仪和显微镜成像系统的兼容性。该孔板设计可容纳多种尺寸的通道，并能提供足够的培养基体积以支持较大通道的生长，同时减少更换培养基的频率。该设计未来还可适配于其他市售的标准孔板，从而提高实验通量并减少材料使用。
微流控平台通常使用一种名为PDMS的硅酮聚合物，因其无毒、透气性好且高度透明28。然而，PDMS的形状保真度较低，限制了其在基于微挤出的生物打印中用于高形状保真度芯片制造的应用。另一种硅酮聚合物SE170029在构建组织制造腔室时可提供更高的精度，但其高黏度需要使用更大的喷嘴和较高的气压。我们配制了一种SE1700与PDMS的混合物，可适配更小的喷嘴，从而能够在受限空间内以高精度和高形状保真度进行制造。其他类型的聚合物，如聚己内酯（Polycaprolactone, PCL）或聚乙烯醋酸乙烯酯（Polyethylene Vinyl Acetate, PEVA），由于其较高的形状保真度，也可用于腔室打印30。
GelMA 的光学透明性也至关重要31。与其他基于细胞外基质（ECM）的水凝胶（如胶原蛋白，其在交联后会变得不透明）不同，GelMA 能保持透明，从而允许在通道内进行实时细胞分析，即使通道尺寸增大亦可实现。当构建物尺寸增加时，这一特性相较于需要制备薄切片以供观察的方法具有显著优势32。GelMA 的可生物降解性使其在降解过程中能够被新生的功能性组织逐步替代，从而为功能性组织的生长提供必要的空间33,34。此外，其已被证实具有低细胞毒性，因此非常适用于组织工程应用35,36。GelMA 优异的力学性能使其成为血管组织工程应用的理想候选材料37。已有大量研究证实，GelMA 能有效促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在血管导管上的内皮化38。
本研究中用于内皮化的细胞为 HUVECs，其分离成功率高，是研究多种心血管疾病和代谢性疾病极佳的模型39。然而，该方法可进行调整以适配不同类型的内皮细胞，包括来源于动脉或直接取自患者的内皮细胞。这种可调节性使得构建患者特异性的血管组织模型成为可能，从而有助于评估个体对特定药物的反应。
本方案中有若干关键步骤需要读者特别注意。首先，等离子体处理对于改变培养板表面特性至关重要，特别是为了增强其亲水性，因为大多数商用孔板具有疏水性。等离子体处理可在表面引入极性官能团，从而提高其与硅胶腔室及水凝胶的结合能力。其次，温度控制极为关键，因为牺牲性油墨在较低温度下会液化，而硅胶油墨则需要在较低温度下保存以防止提前固化，否则可能阻碍油墨从喷嘴中正常挤出。第三，必须彻底清除PF127的所有残留痕迹，因为任何残留的PF127都可能对细胞过程产生不利影响，例如干扰细胞黏附40。第四，在细胞培养过程中，若细胞生长至融合度超过90%，可能因空间和营养竞争而产生应激反应，这种应激可导致细胞行为改变、细胞活力下降以及细胞微环境的变化。为维持细胞健康和正常增殖，建议将培养物的融合度控制在90%以下。第五，在培养箱内放置培养板时，无论翻转前还是翻转后，均应保持其水平，以确保通道内细胞黏附均匀，最终实现内皮化的一致性。最后，在图像采集过程中，保持一致的曝光时间、激发激光强度和显微镜焦距至关重要，因为这些参数的任何变化均可能改变发射信号的强度，从而影响实验结果的准确性。
我们的方法能够创建多种构型的通道，例如本文展示的直线型、分叉型和迂曲型结构。这种适应性对于复制人体内多样化的血管网络几何结构至关重要，并且超越了传统方法的能力，例如围绕模具进行水凝胶浇铸或基于同轴喷嘴的生物打印技术用于制备管状结构30,41,42。然而，该方法的一个局限性在于无法保证通道的圆形度，因为牺牲模板是在平坦表面上构建的。
构建多种尺寸通道的优势对于克服微流控平台的局限性至关重要，因为这些平台通常仅限于微通道。这种限制在常规生化检测中可能成为缺点。例如，为了获得足量材料用于标准蛋白质表达检测（如蛋白质印迹法），必须合并多个微流控装置的输出产物。此外，在形成中空通道时，水凝胶必须具备足够的刚性以承受移除针头的过程。我们的方法采用一种可逆温敏牺牲材料，当温度降低时该材料会转变为液态，从而在不破坏凝胶完整性的前提下促进该过程的实现。此外，其他可逆温敏凝胶材料（如明胶43）也可在此方法中用作牺牲材料。
该方法能够轻松定制化培养板上的组织结构，从而为药物研发中的药理学测试提供了一种有前景的工具。该技术可通过评估药物对血管通透性的影响来促进药物筛选——血管通透性是开发针对血管功能障碍相关疾病疗法的关键因素。我们的模型可用于在特定条件（如炎症）下研究血管通透性，并制定血管正常化的策略，这对于治疗多种涉及异常血管通透性的疾病具有重要意义44，有助于深入理解该过程，并推动潜在的临床应用发展45。
为评估血管通透性，我们通过血管通道灌注了70 kDa的葡聚糖。通常情况下，健康的血管内皮可有效阻隔该分子量的葡聚糖分子46。然而，在炎症存在的情况下，紧密连接结构遭到破坏，导致这些分子发生渗漏，从而增加血管通透性30。此外，荧光标记的葡聚糖可用于评估药物在工程化组织中的分布情况47。尽管该模型存在双向流动以及通道内溢流控制有限等局限性，但我们预计终端用户可通过使用定制化的摇床来调节通道内的流动动力学，从而根据自身需求对系统进行调整。此类改进可能包括实现无泵单向流动48。
未来，这种制造方法可被放大以构建复杂的组织。通过在血管通道附近精确定位其他类型的细胞，可创建可灌注的血管化组织，从而克服了生物打印体积组织中的一个主要挑战。我们还认为，该方法可被改造用于高通量模拟其他类型的中空可灌注组织（如淋巴管和肠道），以满足多种生物医学应用的需求。

人体内的血管网络通过动态调节血液与周围组织之间的分子和细胞交换，发挥着关键的运输屏障功能。这种调节对于防止组织水肿以及实现选择性营养物质和细胞交换至关重要，从而支持组织代谢和稳态1。内皮通透性的改变是多种健康状况中的一个影响因素，会影响疾病的严重程度和治疗效果2。血管内皮作为选择性屏障，促进血管、组织和器官之间的物质转运。这种调控涉及多种机制，例如对溶质和小分子的基础过滤、血管屏障的主动破坏，以及前列腺素和生长因子等分子对通透性水平的影响3。
这一调控过程中的关键因素包括内皮细胞连接、白细胞迁移以及血脑屏障的功能4。由于其复杂性，该过程在不同环境中存在差异，涉及多种类型的血管，并利用不同的解剖通路。理解血管通透性的生物学基础对于制定治疗与异常血管通透性相关疾病的方法至关重要。维持血管通透性的稳定对血管系统及其周围组织的健康至关重要；因此，该功能的受损将导致内皮功能障碍，即内皮层失去其正常功能的状态。
内皮功能障碍是多种常见人类疾病的前兆，包括高血压、冠状动脉疾病、糖尿病和癌症5,6,7。该状况可表现为多种形式，如血管舒张能力下降、血管通透性增加以及倾向于产生促炎状态。这种病理状态是多种重要心血管疾病（如冠状动脉疾病、脑卒中和外周动脉疾病）的最早阶段8，而这些疾病至今仍是美国死亡的主要原因1。内皮功能障碍不仅影响心血管健康，还影响血脑屏障（BBB），并在多种神经系统疾病的发展过程中起重要作用。功能障碍可增加血脑屏障的通透性，从而使毒素、病原体和免疫细胞侵入中枢神经系统，进而促进脑卒中、阿尔茨海默病、多发性硬化症和脑部感染等神经系统疾病的发生发展9。
糖尿病中的内皮功能障碍表现为内皮调节血管张力和产生一氧化氮等血管舒张介质的能力受损，导致血管舒张功能下降10。高血糖诱导的通路（如蛋白激酶C激活和氧化应激）会加剧这一状况，显著促进糖尿病血管病变的进展11。此外，已有研究发现，炎症环境可增强肿瘤细胞与脑微血管内皮细胞的黏附，而内皮通透性增加被报道是癌症转移的重要因素12,13。血管的几何结构也被发现直接影响脑部癌症的转移，肿瘤细胞优先附着于血管曲率较大的区域7。这一发现凸显了血管几何结构在癌症转移中的重要性。更重要的是，在纤维化和癌症等疾病中，内皮屏障功能的破坏不仅参与疾病的发生发展，还因阻碍药物的有效递送而降低治疗效果14。关于血管通透性的研究对于推动心血管疾病治疗以及理解其他涉及血管功能受损疾病的管理具有重要意义。
鉴于血管通透性在健康与疾病中的关键作用，大量研究致力于通过动物模型以及传统的二维（2D）和三维（3D）体外（in vitro）检测平台，探讨内皮屏障的选择性，以推动治疗手段的开发。然而，动物模型因存在物种特异性差异、伦理问题以及高昂的成本而具有局限性15,16。例如，辉瑞公司于2004年指出，在此前的10年中，其在药物研发上投入超过20亿美元，这些药物在动物模型中显示出良好的效果，但在后续的人体高级别测试阶段最终失败17。此外，传统的2D模型无法准确模拟血管通道的三维（3D）结构及其复杂的几何构型。
随着生物制造技术的进步，人们已投入大量努力用于构建血管通道并同时重现三维结构。利用软光刻技术，可在微流控芯片内有效制造微尺度血管通道，从而实现实时分析的优势18,19。其他方法，如水凝胶浇铸或将细胞片包裹在模具或芯轴周围，可用于构建具有理想直径的自支撑管状结构20,21。然而，这些方法存在局限性；例如，微流控芯片受限于微通道构型，而围绕模具进行水凝胶浇铸则难以有效复制多种几何形状。
随着3D生物打印技术的出现22，通过精确沉积多种基于细胞外基质（ECM）的水凝胶材料来复制复杂几何结构已成为可能23,24一些生物打印方法，例如使用同心排列喷嘴的方法，如同轴和三轴打印方法25,26，无法形成分叉的管状结构；然而，通过牺牲图案化方法可实现复杂结构27这些生物打印方法均未实现高通量生产。 体外 建模——药物发现中药理学研究的关键要求。本文介绍一种高效构建内皮化血管通道的方法，可精确控制其尺寸。
我们建立了一种简便的方法，利用市售的六孔板，结合牺牲图案化技术，通过生物打印机制备在细胞外基质水凝胶内具有特定尺寸和图案的血管通道。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于这些通道中，以实现内皮化，并通过通透性实验评估内皮层的功能性。该设计通过在通道两侧创建培养基储液池，实现无泵灌注，借助常用的二维摇床产生重力驱动流，模拟动态培养环境。该方法无需蠕动泵，有利于平台向高通量应用扩展。3D生物打印技术的计算机控制特性也简化了制备流程，从而降低了制造过程中的出错概率。血管类器官平台（VOP）模型在药物发现中的药理学测试方面展现出良好的应用前景。

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>SPL</td><td>SPL 91010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3D 生物打印机&amp;nbsp;</td><td>T&amp;R Biofab</td><td>3DX-Printer</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板&amp;nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>明场倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒（CCK8）</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒（CCK8）</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶 75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无LDEV，10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，细胞培养级</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>道康宁 PDMS-Sylgard 184a 试剂盒</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 透明 W/C 1.1 KG 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 MV 2（即用型）</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量移液器（1000、200、100、20、10）</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇 99.9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤维蛋白原</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记葡聚糖 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球（1.0 &amp;mu;m，绿色）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA 粉末（明胶甲基丙烯酰胺）50 g</td><td>3D Materials&amp;nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 细胞冻存液（无血清），50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs（人脐静脉内皮细胞）</td><td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)磷酸锂粉末&amp;nbsp;</td><td>Tokoyo Chemical Industry CO.</td><td>85073-19-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior 计数板盖玻片</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior 血细胞计数板，细胞计数室</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>eppendorf</td><td>Centrifuge 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氮气罐</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure 紫外激光器</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（100x）</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>行星式混合器</td><td>THINKY CORPORATION, japan</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>等离子体处理仪</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>预配缓冲液，(P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>试剂储存柜</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>实时活细胞成像显微镜</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D 数字摇床</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>CacheBy</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 胰蛋白酶-EDTA 溶液，0.25%</td><td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>注射器筒端帽</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>计数器</td><td>Control Company</td><td>&amp;nbsp;C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>锥形喷嘴（18 G）</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>锥形喷嘴（22 G）</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>锥形喷嘴 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源凝血酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>定时器，4 通道</td><td>ETL</td><td>SL.Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL UG 软膏瓶</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL UG 软膏瓶</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量生物打印方法用于在标准六孔板中灵活构建具有可调尺寸与图案的血管通透性模型

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

血管通透性是开发与内皮功能受损相关疾病疗法的关键因素，例如冠状动脉内皮功能障碍和血脑屏障功能受损。现有的制备技术无法充分模拟人体血管网络中的几何结构变化，而这些变化对疾病进展具有显著影响；此外，这些技术通常涉及多步骤的制备流程，限制了药物筛选所需的高通量生产。本文介绍了一种生物打印方案，可在标准六孔板上直接构建具有特定图案和尺寸的多个血管组织，从而克服了当前生物打印技术在分辨率和生产效率方面的挑战。本研究建立了一种简化的制备方法，用于在水凝胶中构建六条中空且可灌注的通道，并随后以人脐静脉内皮细胞进行内衬，形成具有功能性和成熟特性的内皮层。3D生物打印的计算机控制特性确保了高重复性，且相比传统方法所需的人工操作步骤更少。这凸显了VOP作为高效高通量平台在模拟血管通透性和推动药物发现方面的潜力。

采用多喷头生物打印系统制备了具有尺寸和结构灵活性的VOP平台。在 hollow 且可灌注的通道中接种 HUVECs 以促进内皮化，并通过通透性实验进行评估（图 1A）。为展示该方法的多尺度制造能力，我们打印了三种不同构型：直形、分叉形和弯曲形（图 1B）。通过一种简便的制备方法，可在标准六孔板内生成嵌有六条 hollow、可灌注的血管通道的水凝胶基质。这些通道可进一步接种 HUVECs 实现内皮化（图 2A）。细胞迅速黏附并增殖，覆盖血管通道的管腔内表面（图 2B）。黏附于上下管腔表面的细胞在管腔内呈均匀分布（补充图 S1）。
将培养板置于加湿的培养箱中孵育3天，使硅胶油墨固化，同时确保牺牲模板图案不会脱水干燥（图3A）。为评估通道内的流动情况，引入绿色微珠进行观察，结果表明这些通道具有良好的可灌注性（补充视频 S1）。通过在打印牺牲模板时改变打印喷嘴规格（从22 G至18 G），可将通道直径从558 ± 38 µm调节至1094 ± 45 µm。此外，通过修改生物打印机的G代码（补充文件1），还可调控通道的几何构型，实现弯曲和分叉结构的打印（图3B）。
UV 交联时间优化为 120 s，可有效支持细胞增殖（补充图 S2）。该交联时间形成了更具生理相关性的环境，促进内皮细胞增殖，可能是由于水凝胶的力学性能和孔隙率达到了平衡，有利于细胞更好地黏附并进一步增殖。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在接种后第 5 天于管腔表面有效增殖，并呈现铺路石样形态。通过在接种后第 1、3、5 天进行 CCK8 检测评估内皮成熟情况（图 4A，B）。接种细胞 5 天后，通过 CD31 免疫荧光染色验证内皮成熟，结果显示 CD31 定位于紧密连接处（图 4D）。
为评估内皮细胞的屏障功能，我们在成熟后的第5天将70 kDa的葡聚糖溶液灌注通过微通道。作为对照，选择了一条无内皮细胞覆盖的通道（裸通道）。内皮化通道在血管周围凝胶区域的荧光随时间变化极小，表明内皮细胞有效地维持了其屏障功能。然而，裸通道在血管周围凝胶区域的荧光增强，表明由于缺乏内皮细胞，通透性升高（图4C 和 图4E）。
<img alt="血管类器官工艺流程图；VOP 制备、内皮化、通透性检测结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1打印血管通道及其构型的制备 (A打印血管通道的制备、内皮化及通透性检测示意图。B) 本方法中展示的三种构型示意图：直形、分叉形和迂曲形。缩写：VOPs = 器皿上的血管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="水凝胶细胞培养流程示意图，显示牺牲性图案化、腔室打印及 HUVEC 接种。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：牺牲性图案与硅胶腔室打印及血管通道内皮化的制备时间线。（A）示意图表示多孔板中的单个孔，AA' 表示沿横截面方向的视图。（B）制备过程各步骤的代表性图像。比例尺 = 5 mm（B1），200 µm（B2-4）。缩写：GelFib = 含0.05% w/v 液基苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂溶液的15%甲基丙烯酸明胶和1%纤维蛋白原；HUVECs = 人脐静脉内皮细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于颗粒分布的微流控装置设置和流动通道荧光显微镜观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：培养板上的血管结构。（A）打印牺牲模板和硅胶腔室后，培养板上血管结构的大体图像。（B）用绿色微珠灌注展示具有多种构型和尺寸的血管通道多尺度制造效果。比例尺 = 200 µm（直形通道），1,000 µm（迂曲和分支通道）。缩写：ID = 内径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用荧光显微镜进行细胞生长实验、通透性分析及CCK8图示结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：血管通道及其内皮细胞成熟与通透性。（A）接种表达绿色荧光蛋白的HUVECs后第1、3、5天的血管通道荧光显微图像，显示第5天HUVECs的增殖及铺路石样形态。（B）通过CCK-8试剂盒在接种细胞后的第1、3、5天评估内皮细胞成熟情况。（C）内皮化（内皮+）与无内皮（内皮-）血管通道的通透性实验。（D）CD31染色的代表性图像显示第5天CD31在紧密连接处的定位。（E）扩散通透性的定量分析。比例尺 = 200 µm（A, C, D）。缩写：HUVECs = 人脐静脉内皮细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；GFP HUVECs = GFP标记的HUVECs；CCK-8 = 细胞计数试剂盒8；DAPI = 4'6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>打印墨水</td>
			<td colspan="2">打印参数</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>喷嘴规格</td>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>气压 (kPa)</td>
			<td>喷头速度 (mm/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牺牲性墨水</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硅胶墨水</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：牺牲性油墨和硅油墨的打印参数。
补充文件1：包含在六孔板内3D打印牺牲模具和硅胶腔室指令的G代码脚本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S1：细胞接种后下部和上部管腔表面的代表性图像，显示 GFP-HUVEC 在上部和下部焦平面均发生黏附。 比例尺 = 200 µm。缩写：UU' = 上部焦平面；LL' = 下部焦平面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2：在不同 UV（405 nm）交联时间下 GFP-HUVEC 的增殖情况。 比例尺 = 200 µm。缩写：HUVECs = 人脐静脉内皮细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；GFP HUVECs = GFP 标记的 HUVECs。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S1：绿色微珠灌注显示直行、弯曲及分叉通道中的有效灌注情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 S1：G 代码和 M 代码命令的功能。 注意：在 G 代码中，X、Y 和 Z 分别表示沿 X 轴、Y 轴和 Z 轴移动的坐标。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们介绍一种利用3D生物打印技术在标准六孔板上高通量制备具有可调尺寸和特定图案血管通道的实验方案，该技术被称为“孔板上的血管”（vessels-on-a-plate, VOP）。该平台有望推动针对内皮功能障碍相关疾病治疗药物的研发。

血管通透性是开发针对内皮功能受损相关疾病疗法的关键因素，例如内皮功能障碍在……中的作用

开发针对血管通透性的常规疗法（动脉粥样硬化等常见疾病的先兆）需要严格的临床前测试。然而，复杂的制造方法常常阻碍了体外模型的可重复性和高通量生产，而后者是药理学测试的先决条件。在此，我们利用多材料生物打印技术的自动化来解决这一问题。通过将传统的孔板系统与计算机控制的3D打印技术相结合，我们简化了制备流程，优化了培养过程，并因其与微孔板读数仪和显微成像系统的兼容性而实现了实时分析。然而，现有方法通常涉及多步骤和手动操作的制备过程，限制了其可重复性。本研究提出了一种基于软件控制的体外人源血管模型制备方法，可构建具有复杂几何结构的血管模型。在多孔板上进行生物打印可实现按需高通量生产。这些进展表明，体外组织模型将在未来的医学发现中发挥关键作用。首先，访问诸如 NCViewer 之类的在线 G 代码模拟工具，以生成并可视化打印路径。单击界面中的“新建文件”图标以创建新的 G 代码文件。手动编写用于牺牲通道和硅腔室的 G 代码指令。完成 G 代码编写后，单击界面中的“保存文件”图标，将文件以 nc 扩展名下载。将硅胶聚合物 SE1700 与 PDMS 按 10 比 2 的比例混合。然后按聚合物与固化剂 10 比 1 的比例，分别为每种聚合物加入固化剂。使用行星式搅拌器，在 2,000 RPM 条件下充分混合并脱气聚合物混合物。现在，使用刮刀将混合好的硅胶聚合物转移至一支10毫升的一次性注射器中。将装有材料的注射器在5摄氏度条件下以400G离心3分钟，以确保材料均匀一致，并避免打印过程中产生气泡。接下来，称取一定量的泊洛沙姆F127加入蒸馏水中，配制40%的储备溶液。将Pluronic F127溶液在行星式搅拌机中以400G转速混合3分钟。将均质后的混合物置于4摄氏度条件下，以确保固体完全溶解。打印前，将100微升凝血酶与900微升Pluronic F127混合，制备1毫升牺牲性墨水。首先，在制备前，使用100瓦功率的氧气等离子体处理六孔板1分钟。将生物打印机喷头的温度设置为：牺牲墨水37摄氏度，硅胶墨水5摄氏度。接着，将一个22号双螺纹锥形喷嘴连接至硅胶注射器上。将硅胶墨水和牺牲墨水装入生物打印机打印头中。加载所需的G代码，并在生物打印机软件界面上长按“伺服准备”（Servo Ready）功能三秒钟。将培养板放置于打印平台的G代码起始位置，然后点击“开始”以启动打印过程。现在，将盖子盖在培养板上。然后，在37摄氏度的加湿二氧化碳培养箱中固化硅胶腔室72小时。VOP上的牺牲图案保持未干燥状态。首先，将0.01克LAP溶解于含有20毫升PBS的50毫升锥形管中。向LAP溶液中加入3克明胶甲基丙烯酰胺和0.2克纤维蛋白原。将混合物置于37°C水浴中。向 VOP 平台的每个水凝胶腔室中加入 300 微升预热的 GelFib，以包埋牺牲模板。使用紫外光快速交联明胶甲基丙烯酰胺。对所有其他孔重复紫外交联步骤后，向每个孔的血管通道两侧各移液 1 毫升 DPBS。将培养板置于 4 摄氏度环境中 15 分钟，以液化 Pluronic F127。在将细胞引入通道之前，先通过通道灌注含有 1% Matrigel 的 DMEM/F12 培养基，持续 30 分钟。首先，将一管冻存的 HUVECs 浸入 37 摄氏度水浴中 2 分钟。然后，用70%乙醇冲洗小瓶，以防止污染。将5毫升预热的ECGM培养基移液至15毫升锥形管中。使用微量移液器，小心地将解冻后的细胞从小瓶转移至锥形管中。然后，加入1毫升新鲜的预热培养基至冻存管中，冲洗管内壁，并将残留的细胞全部转移至锥形管中。离心后弃去上清液，用10毫升新鲜培养基重悬细胞，随后将细胞转移至T75培养瓶中。将锥形瓶置于37摄氏度、加湿的二氧化碳培养箱中孵育。用10毫升DPBS冲洗T75培养瓶中融合度达90%的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。然后，向培养瓶中加入1毫升0.25%TE。孵育后，轻轻敲击培养瓶壁，加入5 mL胰蛋白酶中和液。然后将细胞转移至15 mL锥形管中。用5 mL新鲜ECGM收集残留细胞，并转移至同一锥形管中。现在，将锥形管在250G条件下离心3分钟，以收集细胞沉淀。弃去上清液后，用1毫升新鲜ECGM重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。再次离心后，弃去上清液，将细胞重悬于90微升新鲜ECGM中。接下来，将打印好的血管置于培养板上，短暂使用真空负压抽吸清除管腔。用移液枪轻轻向通道中加入 15 µL HUVEC 细胞悬液。将培养板水平放入培养箱中孵育两小时。随后，将培养板翻转180度，并保持水平位置静置两小时。四小时后，用DPBS冲洗通道，以去除未贴壁的细胞和死细胞。然后，向每个孔中加入两毫升新鲜的ECGM培养基。将动态培养装置置于摇床上，设置倾斜角度为10度，转速为5 RPM。HUVEC细胞迅速贴附并增殖，覆盖血管器官芯片（VOP）内血管通道的管腔表面。接种细胞后第五天，通过CD31免疫荧光染色验证内皮层的成熟，结果显示CD31定位于紧密连接处。

high-throughput-bioprinting-method-for-modeling-vascular-permeability

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

高通量生物打印方法，用于模拟具有尺寸和图案灵活性的标准六孔板中的血管通透性

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

本文介绍了一种用于多孔板膜插件系统中测定通透性的方法，以及通过模拟进行扩散系数计算的in...

一种用于多孔板膜插件系统中三维组织模型渗透性和扩散性测定与模拟的方法

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。...

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

本文展示了一种易于使用的核/壳式三维生物打印装置，可一步法制备中空支架，适用于血管及其他管状结构的组织工程。...

用于管状结构组织工程的核/壳打印支架

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

工程化组织高度依赖于适当的血管网络，以提供必需的营养物质和气体，并清除代谢废物。本研究中，通过内皮细胞与支持细胞的逐步接种方案，在高通量平台上构建出高度有序的血管网络，用于在可控的三维环境中研究血管发育行为。...

在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

工程化皮瓣需要整合功能性血管网络。在本方案中，我们介绍一种制造包含分级血管网络的3D打印组织皮瓣的方法，并将其直接与大鼠股动脉进行显微外科吻合。...

利用3D打印技术制备工程化血管皮瓣

本方案介绍了新开发的3D打印生物反应器的组装与操作方法 离体 灌注条件下血管的培养。该系统设计易于被其他用户采用，具有实用性、经济性，并可适应不同的实验应用，如基础生物学和药理学研究。...

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。...

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

可溶性基底膜提取物是癌症研究中最常用的生物基质，但其复杂的流变行为使得在商业化的生物打印系统上进行生物打印十分困难。本研究提出了一种定制化的生物打印策略，能够以良好的形状保真度制备出单层和多层的纯基质结构。...

用于转化研究中可溶性基底膜提取物生物打印的容积式挤出生物打印机的设计与验证

学习高通量3D生物打印技术，用于在标准六孔板中构建血管通道模型。该方法整合多材料打印与计算机控制技术，实现可重复的体外人血管模型制备，支持实时分析并与酶标仪及显微成像系统兼容，助力血管通透性相关疾病治疗研究。

高通量生物打印方法用于在标准六孔板中灵活构建具有可调尺寸与图案的血管通透性模型

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