Name: 泪液来源外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变的新诊断工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解泪液外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变非侵入性生物标志物的检测方法。该方案利用液滴数字PCR和分子分析技术，有助于实现早期诊断并改善患者预后。

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本研究得到了Alcon研究学会（IF011-2020）和FOM UMSC Care博士后研究基金2021的支持。

本研究获得了马来亚大学医学中心医学研究伦理委员会的批准（参考编号：20165-2446）。所有人类受试者在入组前均签署了书面知情同意书。共有135名受试者被纳入研究，均来自吉隆坡马来亚大学医学中心（UMMC）眼科门诊的就诊患者。纳入标准包括在UMMC接受医疗服务且年龄在20至80岁之间的患者。正在接受胰岛素治疗、在过去3个月内接受过激光或抗VEGF治疗，或常规使用抗血小板药物或抗凝药物的患者被排除在研究之外。受试者随后被分为三组：（1）健康对照组（对照组），（2）无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者（DM No DR），（3）伴有糖尿病视网膜病变的糖尿病患者（DR）。研究方案的概要见图1。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
<img alt="研究流程图：采集泪液、RNA提取、cDNA合成、数字滴定PCR分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66687/66687fig1.jpg" data-altupdatedat="1773720005000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66687/66687fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 材料准备    
<ol>
	<li>准备一个无菌基础敷料包，内含两把镊子、六个棉球、四个纱布垫、一个托盘和一个生物危害袋。</li>
	<li>将 5 mL 的 0.9% w/v 氯化钠冲洗液倒入托盘中。</li>
	<li>打开一包眼睑清洁湿巾，并将其放置在无菌区域。</li>
	<li>准备一支含有 250 µL 防腐液的试管。</li>
	<li>在仍处于包装状态时，将一条 Schirmer 试纸在楔形刻度处折叠，然后将其无菌试纸条放置于无菌区域上。</li>
	<li>以无菌方式戴上外科手套。</li>
	<li>使用一把无菌镊子，用 0.9% w/v 无菌氯化钠冲洗液浸湿棉球。</li>
</ol>
2. 人类受试者的准备    
<ol>
	<li>让受试者舒适地坐着，并要求其闭上眼睛。</li>
	<li>使用浸有灌洗液的棉球擦拭眼周皮肤四次。</li>
	<li>用眼睑清洁湿巾擦拭眼周皮肤。</li>
</ol>
3. 人泪液的采集
<ol>
	<li>使用放置在颞侧下穹隆处的Schirmer试纸收集泪液。</li>
	<li>将部分折叠的试纸置于右眼时，要求受试者向左注视。下拉下眼睑以暴露下穹隆。</li>
	<li>使用无菌镊子，将Schirmer试纸置于下结膜穹隆外侧三分之二处。避免试纸接触皮肤，以防汗液或其他皮肤物质污染样本。</li>
	<li>在试纸下方放置一块纱布垫，以防止接触皮肤。</li>
	<li>让泪液被试纸吸收，直至达到20 mm标记处或最长5分钟，以先到者为准。</li>
	<li>若未达到20 mm标记线，应根据试纸上已有的刻度记录泪液上升高度，以便标准化泪液体积。</li>
	<li>使用无菌镊子小心取出Schirmer试纸，并将试纸放入含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的试管中。</li>
	<li>将试管放入冷藏盒中，运送到实验室。</li>
	<li>用纱布擦拭皮肤表面残留液体，清洁眼周区域。</li>
</ol>
4. 泪液样本的预处理    
<ol>
	<li>将含有浸有PBS的Schirmer试纸条的试管在室温下涡旋振荡5分钟。</li>
	<li>将试管在室温下于摇床上振荡5分钟。</li>
	<li>在4 °C下以2000 × g 离心15分钟。</li>
	<li>将溶液转移至新试管中，标记后于-80 °C保存，直至进行后续处理。</li>
	<li>丢弃剩余的试纸条。</li>
</ol>
5. 外泌体分离
注意：RNA 提取采用市售试剂盒，按照制造商提供的方案进行（参见材料表）。
<ol>
	<li>将裂解液置于冰上解冻10分钟。</li>
	<li>使用前于室温下平衡离心柱15分钟。</li>
	<li>取下柱子的下端出口，并将其放置于提供的废液收集板上。</li>
	<li>移除顶部密封垫，使保存缓冲液依靠重力通过柱子。</li>
	<li>加入250 µL PBS，使其通过柱子。</li>
	<li>重复步骤5.5。</li>
	<li>将110 µL样品加至每根柱子的顶部，并让样品进入柱子。</li>
	<li>将柱子转移至提供的样品收集板上。</li>
	<li>加入100 µL PBS，使其通过柱子进入样品收集板。</li>
	<li>将柱子转移回废液收集板上。</li>
	<li>向柱子中加入4次，每次200 µL PBS，并使其进入柱子，以去除第一次上样时的游离蛋白组分。</li>
	<li>向柱子中加入110 µL样品，待其进入柱子。</li>
	<li>将柱子置于样品收集板上，加入100 µL PBS，使其通过柱子。</li>
	<li>将样品收集板短暂离心（100 × g，30秒）。分离得到的外泌体现在可用于RNA提取。</li>
</ol>
6. RNA 提取
注意：RNA 提取采用市售试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行（参见材料表）。
<ol>
	<li>取200 µL分离得到的外泌体进行RNA提取。</li>
	<li>向分离的外泌体中加入60 µL裂解缓冲液，涡旋振荡5秒。</li>
	<li>室温孵育3分钟。</li>
	<li>加入20 µL抑制剂沉淀缓冲液，涡旋振荡20秒，室温孵育3分钟。</li>
	<li>在室温下以12,000 x g 离心3分钟。</li>
	<li>将澄清无色的上清液转移至新离心管中。</li>
	<li>加入等体积的异丙醇。</li>
	<li>涡旋振荡5秒，然后将溶液转移至试剂盒提供的微型离心柱中。</li>
	<li>在室温下以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>用700 µL RWT洗涤缓冲液洗涤离心柱。</li>
	<li>以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>用500 µL RPE洗涤缓冲液洗涤离心柱。</li>
	<li>以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>向样品微型离心柱中加入500 µL 80%乙醇。</li>
	<li>以8000 x g 离心2分钟，弃去穿流液和收集管。</li>
	<li>将微型离心柱放入新的2 mL收集管中。</li>
	<li>将离心柱和收集管在18,000 x g 下离心5分钟，弃去穿流液和收集管。</li>
	<li>将微型离心柱转移至新的1.5 mL离心管中，并在离心柱膜中央加入15 µL无RNase水。</li>
	<li>室温孵育3分钟。</li>
	<li>在18,000 x g 下离心1分钟以洗脱RNA。RNA即可用于后续实验。</li>
	<li>进行纳米颗粒追踪分析，以进行质量控制并验证RNA得率。</li>
</ol>
7. cDNA 合成
<ol>
	<li>按照制造商说明书，使用市售试剂盒进行 cDNA 合成（参见材料表）。</li>
	<li>根据表 1在 1.5 mL 微量离心管中配制总反应混合液。</li>
	<li>通过移液器吹打混匀溶液。</li>
	<li>将 5.1 µL 总反应混合液加入 0.1 µL PCR 管中。</li>
	<li>向含有总反应混合液的指定 PCR 管中加入 9.9 µL 样品。</li>
	<li>将 PCR 管放入热循环仪中，并按照表 2运行程序。 
	注意：cDNA 已准备好用于后续分析。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RT Buffer</td>
			<td>1.5 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100M dNTP mix</td>
			<td>0.15 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA酶抑制剂 (200U/µL )</td>
			<td>0.19 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiscribe RT 酶 (50U/µl )</td>
			<td>1 µl </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x RT 引物</td>
			<td>0.75 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNA酶水</td>
			<td>1.51 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td>9.9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>15 µL </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：从分离的RNA合成cDNA所用的PCR预混液的配制。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>逆转录</td>
			<td>16 °C</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>42 °C</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终止反应</td>
			<td>85 °C</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保持</td>
			<td>4 °C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：cDNA合成的热循环条件。
8. 数字化液滴PCR
注意：数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）使用市售试剂盒并按照制造商提供的方案进行操作（参见材料表）。
<ol>
	<li>根据表3，在1.5 mL微量离心管中配制ddPCR的预混液。</li>
	<li>将19.8 µL预混液加入0.1 µL PCR管中，再加入2.2 µL样品，通过上下吹打10次充分混匀。</li>
	<li>将20 µL样品混合液转移至ddPCR微滴生成卡的样品通道中。     </li>
	<li>向卡的油相通道中加入50 µL油相。     </li>
	<li>使用板上的卡扣将垫圈固定在卡上。</li>
	<li>将卡插入微滴生成仪中，听到“咔”声表示卡已正确插入。</li>
	<li>小心地将生成的所有微滴转移至96孔板的孔中。至少设置一个无模板阴性对照孔。</li>
	<li>使用可穿刺封板膜在封板机上密封96孔板（见材料表）。    </li>
	<li>将96孔板放入热循环仪中，并按照表4的程序运行。</li>
	<li>将96孔板转移至微滴读取仪中，计数阳性与阴性微滴。</li>
	<li>根据运行结果得到的每20 µL样品中的拷贝数，计算每毫升样品中的拷贝数。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>每反应体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x 引物/探针</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>7 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNA酶水</td>
			<td>2 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20 µL </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：用于数字PCR的PCR预混液的配制。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>升温速率</td>
			<td>循环数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶活化</td>
			<td>95  °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td rowspan="5">~2 °C/ s 每步</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶失活</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保持</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：数字滴定PCR（ddPCR）的热循环条件。

作者声明不存在利益冲突。

眼底镜检查、光学相干断层扫描和荧光素眼底血管造影是目前可用于糖尿病视网膜病变检测的技术。这三种技术通常联合使用，以对多种视网膜和脉络膜疾病进行全面评估。眼底镜检查是糖尿病视网膜病变评估过程中常规进行的临床检查，由经过培训的眼科医生操作，是诊断糖尿病视网膜病变的金标准。该方法可对视网膜进行详细评估，并能够记录视网膜外观以供后续比较，具备对照片中特定感兴趣区域进行电子放大、以及对图像进行电子存档和传输的能力4,23。光学相干断层扫描利用光波生成视网膜和视神经的高分辨率横断面图像。荧光素眼底血管造影则需要注射特定染料并进行照射，以检测视网膜循环中的异常4。然而，这些检测技术仅适用于疾病发生之后。随着全球糖尿病患者人数预计持续上升24，亟需一种便捷的筛查技术，能够在疾病发生前检测出糖尿病视网膜病变，从而实现密切监测并预防失明。已有若干研究强调了血浆和血清来源的miRNA作为糖尿病诊断工具的潜力25<...

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，威胁着全球数百万人的视力。根据国际糖尿病联合会（IDP）2019年 Atlas 的人群数据，全球糖尿病患者中 DR 的总体患病率估计为 22.7%，且新发病例数量持续上升，尤其在发达国家和发展中国家1。临床上，DR 可分为早期 DR 或非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）、晚期 DR 或增殖性糖尿病视网膜病变（PDR），以及是否存在黄斑水肿。NPDR 常见的病理改变包括血管通透性增加和毛细血管阻塞，而 PDR 则表现为虹膜、黄斑、视盘或视网膜的异常新生血管形成2,3。进展至 PDR 阶段可能导致玻璃体出血和视网膜脱离，从而引起显著的视力损害3。在所有情况下，经过培训的眼科医生均可通过检眼镜检查或眼底摄影检查发现这些病理改变4。采用标准眼底摄影方法，糖尿病视网膜病变的检出敏感度为 78%–96%，特异度为 86%–97%5。然而，该方法仅能在视网膜已发生损伤后才能检测到病变。目前仍迫切需要在出现临床可见的视网膜体征（如斑点状视网膜出血、微动脉瘤、渗出物和新生血管增殖）之前，实现对 DR 的早期检测。
分子工具的进步使得外泌体被发现可作为多种疾病（包括癌症和心血管疾病）的潜在诊断工具6,7。外泌体是由大多数细胞分泌到细胞外囊泡（EV）空间中、由脂质双分子层膜包裹的纳米级颗粒。这些外泌体可通过血液、泪液、唾液和尿液等生物流体进行运输，使其能够方便地用于无创或微创诊断程序8。外泌体携带多种来源细胞的标志物，包括蛋白质、脂质和核酸。其中特别受关注的是存在于细胞外囊泡内的小分子非编码RNA。尽管这些RNA不编码蛋白质，但它们在基因调控中发挥关键作用，并已被证实参与多种生理和病理过程，包括在糖尿病发生中具有重要意义的胰岛β细胞中的相关过程9,10。&#160; &#160; &#160;
已有研究表明，miR-15a 与糖尿病的发生发展密切相关，主要通过调控胰岛素的生成及胰腺β细胞功能实现11。我们课题组近期证实，糖尿病视网膜病变患者的血浆中 miR-15a 水平发生改变。此外，miR-15a 也被证实由胰腺β细胞分泌，并可通过血液循环到达视网膜12。泪液是一种易于获取的体液，可通过非侵入性、低成本的方式从眼部采集13。其成分包含多种蛋白质、脂质、电解质及其他分子，能够反映眼表及周围组织（包括视网膜）的生理状态14。在泪液中检测到的 miRNA 数量多于血清和房水15,16。泪液成分会随多种全身性疾病状态（包括糖尿病）而发生变化17。事实上，已有研究显示，泪液分析在监测和诊断多发性硬化症、乳腺癌等非眼部相关疾病方面具有良好的应用前景18,19。鉴于糖尿病视网膜病变与眼部的直接关联，探索泪液在此类疾病中的潜在诊断价值更具相关性。研究发现，糖尿病视网膜病变患者泪液中 IL-1RA、IL-8、IL-6 和 TNF-α 的水平发生改变，且其变化程度与疾病的严重程度相关20,21。与传统的眼底检查相比，泪液分析在可及性、非侵入性、特异性方面具有潜在优势，且可在疾病发生前实现早期检测22。
因此，本研究的主要目的是通过分离和定量糖尿病视网膜病变人群泪液中的miRNA，探讨泪液来源外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变新型诊断标志物的潜力。该方法将建立一种通过泪液筛查检测糖尿病视网膜病变的新手段，可在视网膜并发症出现之前即实现早期检测，从而为采取预防性或治疗性干预措施提供可能。

<table><tbody><tr><td>0.9% w/v 氯化钠</td><td>Ain Medicare Sdn Bhd</td><td>GB16165967618</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 探针用Supermix（不含dUTP）</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板</td><td>BioRad Laboratories</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 微流控芯片</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 密封垫圈</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>探针用微滴生成油</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Exospin-96 外泌体分离试剂盒</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>EX07-96</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy 血清/血浆高级提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>&amp;nbsp;217204</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜仪</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX100 微滴数字PCR系统</td><td>BioRad Laboratories</td><td>QX100</td><td></td></tr><tr><td>QXDx 微滴生成仪&amp;nbsp;</td><td>BioRad Laboratories</td><td>12001049</td><td></td></tr><tr><td>Schirmer试纸条</td><td>Optitech</td><td>SCH-100</td><td></td></tr><tr><td>T100 梯度PCR仪</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 检测试剂盒 MTOMED 20（检测ID：000389）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440887</td><td>靶序列：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG</td></tr></tbody></table>

基于泪液外泌体mir-15a的糖尿病视网膜病变新型诊断工具

Tear-Derived Exosomal miR-15a as New Diagnostic Tool for Diabetic Retinopathy

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的主要并发症之一，影响着相当大比例的糖尿病患者。早期诊断和干预对于预防不可逆的视力丧失至关重要。目前的诊断方法虽然有效，但仍存在局限性。miRNA 是一种小分子非编码 RNA，可通过与靶 mRNA 的 3'-非翻译区（3'-UTR）结合，抑制 mRNA 的稳定性和/或翻译，近年来被越来越多地认为与糖尿病密切相关，并且可从泪液中获取。本研究探讨了泪液来源的外泌体 miR-15a 作为 DR 新型诊断标志物的潜力。研究共收集了 135 例糖尿病患者（其中 36 例患有糖尿病视网膜病变 [DR]，50 例无 DR）和 49 例健康对照者的泪液样本。分离外泌体后，采用微滴数字 PCR（ddPCR）检测外泌体 miR-15a 的表达水平。结果显示，与健康个体相比，糖尿病及 DR 患者中外泌体 miR-15a 的表达水平发生改变。这些发现表明，来源于泪液的外泌体 miR-15a 可能在糖尿病及其并发症的分子机制中发挥一定作用。此外，它有望成为一种无创、可靠的糖尿病视网膜病变诊断生物标志物，具有高灵敏度和特异性。

标准曲线 
建立标准曲线以确定从每位患者收集的泪液确切体积。具体而言，将不同体积（3 µL 至 25 µL）的防腐剂滴加到Schirmer试纸上，并测量Schirmer试纸上湿润区域的长度。每种体积重复操作三次，取平均值。绘制泪液体积与Schirmer试纸湿润长度之间的标准曲线（图2），作为测定收集泪液体积的参考依据。
<img alt="线性回归图，体积(μL) 对 湿润长度(mm)，Y=1.245X+2.530，R²=0.9931。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66687/66687fig2.jpg" data-altupdatedat="1773720005000" data-alt="图2"> 
图2：泪液收集量与Schirmer试纸上湿润区长度的标准曲线。<...

本文介绍了一种从泪液中收集和检测miR-15a的实验方案，作为一种用于糖尿病视网膜病变的新诊断工具。

基于泪液外泌体miR-15a的糖尿病视网膜病变新型诊断工具

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的主要并发症之一，影响着相当比例的糖尿病患者。早期诊断和……

本研究探讨了泪液来源的外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变无创生物标志物的潜力，旨在改善糖尿病相关眼病的早期诊断和患者预后。目前的研究利用液滴数字PCR、外泌体分离技术以及基于泪液的microRNA分子谱分析，以提高糖尿病视网膜病变的诊断准确性和生物标志物的发现。当前面临的挑战包括泪液样本量有限、缺乏专用的泪液外泌体分离试剂盒，以及尚无经过验证的内源性参考microRNA，这些因素使得基于泪液的检测在标准化和定量一致性方面存在困难。我们将泪液来源的细胞外囊泡或外泌体生物标志物确定为糖尿病视网膜病变的一种无创检测工具，尽管糖尿病视网膜病变组与非糖尿病视网膜病变组之间存在重叠，但研究结果支持泪液在早期疾病检测中的潜在应用价值。我们将重点关注其他微小RNA如何调控糖尿病视网膜病变，探索其作为无创生物标志物的应用，并研究其在其他疾病中的作用，以预防视力丧失。首先，取一支含有经PBS浸泡的Schirmer试纸条的离心管，在室温下涡旋振荡五分钟。将离心管置于摇床上，室温下轻轻振荡 5 分钟。然后，在 4°C 条件下，以 2,000 G 离心 15 分钟。将上清液转移至一个新的已标记离心管中，并于 -80°C 保存，直至后续处理。进行外泌体分离时，将泪液溶液置于冰上解冻10分钟。将离心柱在室温下平衡15分钟。然后取下柱子的下端出口，并将其置于提供的废液收集板上方。取下顶部的盖垫，让储存缓冲液依靠重力流过层析柱。然后加入 250 µL 的 PBS，使其流过层析柱。将 110 µL 样品加至每根层析柱的顶部，并让其进入层析柱。将层析柱转移至提供的样品收集板上。在柱子顶部加入100 µL PBS，使其流经层析柱并进入样品收集板。随后将层析柱放回废液收集板上。向柱中加入 200 微升 PBS，重复四次，每次均让液体进入柱中，以去除第一次上样时的游离蛋白组分。然后向柱中加入 110 微升样品，并让其进入柱中。将柱置于样品收集板上。加入 100 微升 PBS 并使其流经层析柱。将样品收集板在 100 ×g 下短暂离心 30 秒。分离得到的外泌体现在可用于 RNA 提取。取200微升分离得到的外泌体，加入60微升裂解缓冲液。涡旋振荡5秒，将混合物在室温下孵育3分钟。加入20微升抑制剂沉淀缓冲液。室温孵育3分钟前，再次涡旋振荡20秒。在室温下以12,000 G离心3分钟。将澄清无色的上清液转移至新管中，并加入等体积的异丙醇。涡旋振荡5秒后，将溶液转移至试剂盒中提供的微型离心柱中。在室温下以8,000 G离心15秒，弃去滤过液。用700 µL RWT洗涤缓冲液洗涤离心柱。离心15秒后，弃去滤液。然后向柱中加入500 µL RPE洗涤缓冲液，再次离心15秒。弃去滤液，再向样品微型离心柱中加入500 µL 80%乙醇，随后再次离心。弃去流穿液和收集管后，将微型离心柱放入一个新的2 mL收集管中。在18,000 G下离心5分钟，弃去流穿液和收集管。将微型离心柱放入一个新的1.5 mL离心管中。然后在离心柱膜的中央加入15微升无RNase的水。室温孵育3分钟后，在18,000 G离心1分钟以洗脱RNA。采用纳米颗粒追踪分析来评估从泪液样本中分离的外泌体的粒径分布和浓度。从泪液中分离出的外泌体平均大小约为142.4纳米。将样本稀释至1:20后，每毫升含有3.9 × 10¹⁰个外泌体颗粒。与健康对照组相比，无视网膜病变的糖尿病患者中miR-15a的拷贝数显著升高，提示该生物标志物在糖尿病发病早期即出现上升。与对照组相比，糖尿病视网膜病变患者的 microRNA-15a 拷贝数进一步显著升高，进一步支持其与糖尿病状态的相关性。在无视网膜病变的糖尿病患者与糖尿病视网膜病变患者之间，microRNA-15a 水平未发现具有统计学意义的差异，表明 miR-15a 虽可反映糖尿病的存在，但无法区分视网膜病变的不同阶段。

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泪液来源外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变的新诊断工具

本文介绍一种利用患者来源的手术切除纤维血管组织进行三维原生组织表征和离体培养，以研究增殖性糖尿病视网膜病变病理生理学的实验方案。该离体培养模型还可用于测试或开发新的治疗方法。...

增殖性糖尿病视网膜病变中纤维血管并发症的离体组织培养模型

外泌体来源的疾病及恶性细胞生物标志物在临床转化中受到缺乏快速且准确定量方法的限制。本报告描述了利用低倍暗场显微镜图像对外泌体特定亚型在少量血清或血浆样本中进行定量分析的方法。...

利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素 上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。...

一种新型人类类器官视网膜培养技术的表征

糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一。组织学、血-视网膜屏障破坏检测以及荧光血管造影是研究视网膜病理生理学的宝贵技术，这些技术可进一步提高针对糖尿病视网膜病变的高效药物筛选能力。...

大鼠模型中视网膜病理生理学评估

已建立一种保护性检测方法，用于监测视网膜血管对糖尿病或糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）导致的细胞死亡的抵抗能力。...

一种检测小鼠视网膜血管免受糖尿病相关死亡的保护作用的实验方法

我们展示了一种标记视网膜血管壁及黏附白细胞的方法。随后可在荧光显微镜下计数这些黏附的白细胞，作为炎症程度或炎症对治疗反应的评估指标。...

视网膜血管中糖尿病诱导的黏附白细胞定量

我们介绍一种简单的琼脂糖覆盖平台，用于利用神经内分泌癌细胞系培养三维多细胞球体。该方法为研究治疗药物对神经内分泌肿瘤细胞的作用提供了一种非常便捷的途径。同时也有助于我们建立用于癌症治疗的人源神经内分泌肿瘤球体模型。...

人源神经内分泌肿瘤细胞系作为研究人神经内分泌肿瘤治疗的三维模型

肺炎是美国十大主要死因之一。在肺炎治疗中，可将骨科手法治疗（OMT）作为辅助疗法，以增强生物力学功能和免疫功能，最终减少住院时间、缩短抗生素使用时长、降低呼吸衰竭发生率及死亡率。在本视频文章中，我们将回顾关于在肺炎患者中应用OMT的随机对照研究，并演示骨科医师在治疗肺部感染时常规使用的具体手法操作技术。...

骨科手法治疗作为肺炎辅助治疗的有效工具

视网膜图像分析是一种用于可视化微循环的无创性操作。心血管疾病危险因素的影响可能导致视网膜血管管径发生变化。本文描述了获取眼底图像的操作流程以及计算血管管径的具体步骤。...

眼底摄影作为流行病学研究中用于观察心血管疾病危险因素对微血管反应影响的便捷工具

为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。...

利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

了解泪液外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变非侵入性生物标志物的检测方法。该方案利用液滴数字PCR和分子分析技术，有助于实现早期诊断并改善患者预后。

基于泪液外泌体miR-15a的糖尿病视网膜病变新型诊断工具

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