Name: 小鼠上行阴道感染、早产和新生儿发病率的建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: 了解利用大肠杆菌建立小鼠上行阴道感染模型以研究早产机制的方法。该模型通过生物发光成像追踪感染进程，为分析新生儿发病率和死亡率提供可靠实验基础。

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Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE 由伦敦大学学院 Peter Taylor 教授惠赠。图1 和 图3 使用&#160; BioRender.com&#160;绘制。本研究获得惠康基金会临床&#160;研究职业发展奖学金 222970/Z/21/Z&#160;（N.S.）、Action Medical Research 与&#160;Borne 基金会资助 GN2647（N.S.、S.N.W. 和&#160;D.P.），以及 Wellbeing of Women 基金会资助 RG2365&#160;（A.K.B.、N.S.、M.H.、S.N.W. 和 D.P.）的支持。

作者无相关利益冲突披露。

本文描述了一种通过细菌经阴道上行感染诱导早产及新生儿发病的新型小鼠模型。我们选用E. coli K1，因其是新生儿败血症和脑膜炎的常见病因，并可由母体垂直传播给胎儿38,39,40。该模型成功的关键在于使用Pluronic温敏凝胶，该凝胶可防止细菌悬液从阴道泄漏，从而促进感染建立并上行至子宫。由于本模型使用来源于败血症分离株的活菌，因此必须密切监测母鼠状态27。若动物出现拒动、拒食或无法照顾仔鼠（如忽视筑巢和哺乳）等情况，应立即实施人道处死。
通常，与感染相关的症状在分娩后24小时内会消退。还需要注意的是，不同血清型的大肠杆菌（E. coli）及其他细菌菌株对妊娠时长、感染/炎症程度以及新生儿结局的影响各不相同。我们建议在使用新的细菌血清型或菌株时，先进行不同菌落形成单位（CFU）的预实验，以确定产生目标表型所需的最低浓度，并设定严格的伦理终点，以防止动物遭受不必要的痛苦。在递送活体病原体时应格外谨慎；在建立上行性感染模型时，应参考已有文献以确保这些生物体的合理使用。
小鼠品系同样重要，因为它们的免疫系统存在差异。例如，在 C57BL/6 小鼠中进行该模型时，所使用的感染时间和菌落形成单位（CFUs）所产生的结果并不相同。我们选择使用 C57BL/6 Tyrc-2J 小鼠，因为时间进程实验显示，与 CD-1、BALB/c 和 C57BL/6 小鼠相比，该品系表现出显著更高的感染程度。此外，有证据表明黑色毛发会淬灭生物发光信号，而生物发光信号是本模型中一个有用的可测量指标29。细菌接种的最佳妊娠天数也可能因病原体和小鼠品系的不同而有所差异。目前早产前胎膜破裂（PTB）的临床前模型存在极大的异质性；因此，为了获得可重复的结果，必须充分考虑这些变量17。
另一个需要考虑的因素是动物暴露于麻醉剂的时间长度。由于妊娠期间过长时间的麻醉暴露与幼崽的神经毒性相关，因此必须尽量缩短麻醉时间（例如，最长不超过5分钟），并始终设置对照组，使其暴露于相同的环境并接受载体物质处理41,42,43。适用于该模型的其他对照组包括：未处理组、仅进行阴道给予Pluronic凝胶组，以及仅进行麻醉组。
免疫组织化学作为一种实验工具被广泛用于鉴定不同的蛋白质和细胞，可用于表征脑组织的结构与连接性。本文介绍了如何分析与神经炎症及神经系统损伤相关的关键细胞类型，同时提供了评估细胞凋亡的方法以及可用于测量脑和肺组织形态的组织学染色技术。为确保这些实验方案成功实施，需注意若干关键因素：首先应谨慎使用PAP笔，若PAP笔接触组织，染色将失败；而若画圈范围过宽，则切片可能在过夜过程中干燥。同样，湿盒必须保持湿润，以防止切片脱水。
进行尼氏染色时，冰醋酸步骤最为关键，需要持续观察切片。当脑部主要结构变得可见时，应立即把切片转移至乙醇中以终止反应。我们选择评估大脑皮层和海马体，因为在人类早产新生儿及其他动物模型中已有报道显示皮层变薄和海马体积减小，但其他脑区也可用于形态学变化的评估44,45,46,47。此外，还需密切注意DAB染色的显色过程，显色时间应严格控制，并在不同实验间保持一致。
由于免疫组织化学结果难以量化，通常被认为具有主观性，因此数据分析是其最常见的局限性。尽管胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分析采用计算机辅助的光密度测量来完成，但染色结果的不一致性仍可能影响这些测量。此外，脑和肺组织形态学评估依赖于观察者主观判断的手工徒手测量。为避免不一致，我们会在短时间内重复这些评估两次。为进一步减少任何偏倚，评估者必须对处理分组保持盲法至关重要。免疫反应性过低也是一个限制因素。信号缺失可能提示目标抗原不存在，也可能源于实验方案失败。为解决这一问题，我们尽可能包含一个可作为阳性对照的组织样本，并在观察到信号微弱或缺失时重复染色步骤，以确保该结果并非由实验误差所致。
除了上述描述的实验方案外，还可通过qPCR和ELISA对母体、胎儿及新生儿组织进行免疫学分析。我们观察到，暴露于感染的动物体内炎症相关的mRNA和蛋白质水平升高25,31,48。我们推测，我们在组织学上所展示的新生儿神经病理学改变可能是胎儿脑、肺和肠道炎症所致25,31。我们已开展的其他神经病理学评估包括使用髓鞘碱性蛋白（MBP）检测髓鞘形成情况，以及使用NeuN标记神经元细胞核25,31。此外，还可检测中性粒细胞和小胶质细胞的其他标志物，以更深入地了解这些细胞在宫内感染暴露后的表型特征和行为变化in utero49,50。另外，还可进行行为学测试，以评估感染对子代的长期影响。
该模型并非没有局限性。例如，我们观察到不同窝及同窝小鼠之间的病理学存在变异。这可能是由于使用了活的细菌，导致感染的扩散无法控制。因此，感染向上蔓延至子宫角的模式和范围各不相同，且常呈不对称分布。另一个局限性在于大肠杆菌（E. coli）的致病性，有时会导致母鼠病情过重而无法照顾幼崽。此外，小鼠并非肺损伤的最佳模型，因为小鼠的肺泡形成发生在出生后，而人类则发生在产前51。我们在采集样本时未能充分膨胀肺组织，这可能影响了实验结果。然而，我们的结果与新生儿支气管肺发育不良（BPD）动物模型中观察到的变化一致52,53。
该模型重现了假定的人类病理状态，即细菌感染从阴道上行至子宫，从而诱发早产。在我们首次发表该模型后，其他研究者已成功复制或建立了类似模型，进一步凸显了该方法的可重复性与相关性19,54。至关重要的是，与其他模型不同，该模型能够表现出早产新生儿常见的多种并发症。这可能归因于所使用的细菌菌株与新生儿败血症具有特异性关联。脂多糖（LPS）是动物模型中最常用于诱导早产的物质，但其对仔鼠具有致死性，因而无法评估新生儿结局18。其他上行感染模型在产生存活仔鼠或展示新生儿发病方面也存在困难19,20,21,22,23,24,55,56。像我们所描述的这类具有临床相关性的动物模型，对于理解早产的病理生理机制以及开发可改善新生儿结局的创新干预措施至关重要。

早产（PTB；分娩时间&#60; 37周）是全球新生儿死亡的主要原因1,2。早产占所有出生人数的11%，是一个重大的全球性健康问题，其病因复杂且尚未被充分理解，导致难以预测和预防3,4,5。早产存活新生儿可能出现不良的神经发育结局，包括脑瘫、呼吸系统疾病（如支气管肺发育不良，BPD）以及胃肠道紊乱（如坏死性小肠结肠炎，NEC）6,7,8。因此，迫切需要建立具有临床相关性且可重复的动物模型，以研究导致早产的生物学通路，并开发创新性干预措施。
自发性早产存在多种可能的机制，例如蜕膜衰老、母胎耐受性破坏、应激、宫颈长度过短或宫颈损伤9然而，据报道至少有40%的自发性早产与微生物感染相关10,11微生物&#160;从阴道腔经宫颈向上延伸&#160;到子宫的&#160;假设并被广泛接受&#160;由于相关性，作为一种常见的感染途径&#160;羊水分离出的微生物与阴道菌群中定植的微生物之间12,13,14与早产常相关的微生物包括以下种类： 支原体, 解脲支原体, 具核梭杆菌， 和 链球菌属 且大多数病例为多微生物感染15,16.
小鼠常被用于模拟早产（PTB），最常用的方法是给予细菌毒素脂多糖（LPS），可通过子宫内、腹腔内或羊膜内途径给药，以诱导启动分娩所需的炎症水平17。然而，LPS 并不能模拟活体微生物感染，更重要的是，由于 LPS 会引发胎儿死亡，因此在这些模型中无法测量新生儿结局18。近年来，已开发出模拟阴道细菌上行感染的动物模型，但同时重现早产及相关的新生儿结局仍具挑战性19,20,21,22,23,24。
本课题组已建立一种新型的上行性阴道细菌感染、早产及新生儿发病模型，该模型可重现人类早产（PTB）的病理生理过程25。本文演示如何评估幼鼠在母体上行性阴道感染致病性大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）后所出现的神经病理学改变及肺损伤。该模型为研究上行性感染的病理生理机制提供了独特机会，同时也可用于评估早产干预措施对改善新生儿结局的有效性。

<table><tbody><tr><td>抗GFAP，兔源</td><td>Agilent Technologies</td><td>Z033429-2</td><td></td></tr><tr><td>抗IBA1，兔源&amp;nbsp;</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>抗Ly6G，小鼠源</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td></td></tr><tr><td>AVT-Horn 184 3CCD相机</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素-16-dUTP</td><td>Merck</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃矩形盖玻片</td><td>FisherScientific</td><td>12363128</td><td></td></tr><tr><td>焦油紫乙酸盐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>405760100</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 CM1900</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃比色皿&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>BR472700</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺（DAB）</td><td>Generon</td><td>40480004-3</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊，不锈钢，10 cm，带齿，弯型</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊，不锈钢，10 cm，带齿，直型</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪，10 cm长，直型</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>DPX&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>4%缓冲甲醛溶液</td><td>Merck</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG抗体（H+L），生物素标记</td><td>Vector Laboratories</td><td>BP-9100-50</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠IgG抗体（H+L），生物素标记</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9400-1.5</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.8&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（IsoFlo）</td><td>Zoetis</td><td>50019100</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 活体成像系统/活体成像软件</td><td>Perkin Elmer/Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微载片</td><td>VWR</td><td>ISO8037/I</td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.51&amp;nbsp;</td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>奎宁</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>Q0132</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes 疏水屏障笔</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Honeywell</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钠</td><td>FisherScientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>末端转移酶&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>3333574001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP试剂盒，过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（组织学级）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

Modeling Ascending Vaginal Infection, Preterm Birth, and Neonatal Morbidity in Mice

早产仍然是全球新生儿死亡和发病的主要原因，目前可用的预防性治疗手段有限。临床上迫切需要 
用于创新干预措施转化的相关且可重复的动物模型 
成为现实。目前已存在多种早产小鼠模型，但这些模型无法重现人类早产儿的多种疾病，包括神经病理学改变和 
肺损伤，这些是上行感染和早产的典型后遗症。据我们所知，我们已建立了一种模型，该模型是目前唯一能够模拟人类新生儿发生上述疾病情况的模型&#160;在活菌从阴道上行引发早产后呈现。本文展示了&#160;阴道内给予一种生物发光菌株 大肠杆菌 并详细说明了使用免疫组织化学和组织学技术评估神经病理学结果和肺损伤的方法。

本方案介绍了一种上行性阴道感染的小鼠模型，并描述了评估新生鼠神经病理学和呼吸系统结局的方法。诱导上行性阴道感染的操作应迅速（在5分钟内完成），小鼠在数分钟内即可恢复。母鼠在接种后约24小时出现感染症状25，包括活动迟缓、竖毛和蜷缩姿势。感染组小鼠的平均分娩时间约为大肠杆菌（E. coli）接种后40.3小时（PBS对照组平均为52.7小时），发生在妊娠第18.5天（E18.5），而PBS对照组则在妊娠第19.5天（E19.5）足月分娩31。每窝活产仔鼠比例因感染而下降（从100%降至71.4%），其出生后7天内的存活率也相应降低（图5）25。当使用生物发光细菌时，可通过成像技术追踪母鼠及仔鼠体内感染的扩散情况。接种后18小时内，可在子宫、胎膜、胎盘以及部分胎儿体内检测到细菌（图6）；通过qPCR和ELISA检测发现，这些组织以及围产期仔鼠的脑、肺和肠道等组织中的炎症介质表达上调25,29,31。
采用组织学和免疫组织化学方法，对胎儿和新生仔鼠进行了一系列神经病理学评估，包括形态学、细胞死亡、小胶质细胞活化和星形胶质细胞活化等25,31,33。肺组织也可进行评估（图4 和 图7）。TUNEL染色阳性提示DNA降解，是细胞死亡的晚期阶段34。在孕期暴露于E. coli感染的仔鼠脑中，我们观察到皮层、梨状皮层、外囊、海马和丘脑区域的TUNEL染色显著增加（图8A、B）31。IBA-1标记的小胶质细胞是脑内的常驻免疫细胞，可根据其形态学状态进行分类：分支状形态提示静息表型，而活化和吞噬状态的细胞则呈阿米巴样或圆形35。因此，我们并未仅定量小胶质细胞数量，而是提出一种通过评估其表型来反映其活化状态的策略。与PBS组相比，E. coli处理组仔鼠的外侧皮层和纹状体中IBA1+细胞的分支结构增加（图8C、D）31。GFAP标记的反应性星形胶质细胞通常与炎症和神经系统损伤相关，在E. coli处理组仔鼠的梨状皮层和外囊区域表达增加（图8E、F）31,36,37。尼氏染色可用于评估脑结构的总体形态学变化；焦油紫（Cresyl violet）是一种标准的神经元组织学染色方法，可标记细胞核外RNA颗粒和细胞核。在E. coli处理组中，我们观察到皮层厚度减小（图9）31。同样，H&amp;E染色可分别标记细胞核和细胞质，用于评估肺组织的形态学变化（图4）31。在暴露于E. coli的小鼠中，我们观察到肺泡腔增大，以及Ly6G+中性粒细胞数量增加，提示存在炎症反应（图7）31。
对于数据分析，若数据呈正态分布，则采用非配对 t-检验分析分娩时间。对于活产仔鼠百分比数据，需首先进行反正弦平方根转换，将范围限定在0至1之间的比例分布转换为正态分布，这是进行 t-检验的前提条件之一。仔鼠存活率采用Log-rank（Mantel-Cox）检验进行分析。对于组织学和免疫组织化学分析，根据数据类型及其是否呈正态分布，采用Mann-Whitney U 检验或采用Welsh校正的多次t检验。为确保足够的统计效能，建议每处理组至少使用五只孕鼠。
<img alt="小鼠实验流程图：大肠杆菌阴道给药，暴露后时间线研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 1"> 
图 1：阴道内给予Escherichia coli及处理时间线，用于在小鼠中诱导早产和新生儿发病。 (A) 使用无菌 200 µL 移液器吸头将E. coli [1] 和 20% Pluronic gel F127 [2] 注入小鼠阴道。将奎宁粉末添加至阴道口 [3]。(B) 在胚胎第 16.5 天将E. coli 送入阴道。可在胎儿期或新生儿期采集肺和脑等组织。缩写：EN = 胚胎第 N 天；PN = 出生后第 N 天；PBS = 磷酸盐缓冲盐水。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示皮层、海马、丘脑的脑组织学切片示意图；解剖学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于评估神经病理学的脑区。新生幼鼠脑组织尼氏染色示例及可用于评估神经病理学的脑区。所有脑区均可用于TUNEL、IBA-1和GFAP检测。我们选择使用尼氏染色评估皮层和海马的形态学。放大倍数：1x。比例尺 = 1.5 mm。缩写：TUNEL = 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法；IBA-1 = 同种异体移植炎症因子1；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元网络示意图；显示用于神经生物学研究的细胞体及分支结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：IBA-1阳性染色及分支指数评估。为量化IBA-1+细胞的分支指数，需统计网格内的细胞体数量，以及穿过水平和垂直网格线的平均分支数。缩写：IBA-1 = 同种异体移植物炎症因子1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肺组织分析；组织学图像、图表；气道空间比较，PBS 与大肠杆菌实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：仔鼠肺部气道空间测量（H&amp;E 染色）。 (A) 使用 ImageJ 中的徒手工具勾勒气道空间并进行测量。(B) 与 PBS 组相比，暴露于 E. coli 的仔鼠气道空间平均面积增加。(C) 子宫内暴露于 PBS 和 E. coli 的仔鼠肺部代表性 H&amp;E 染色图像。放大倍数：40×。比例尺 = 59.5 µm。缩写：H = 苏木精；E = 伊红。n = 2，来自 4 窝仔鼠。*p &lt; 0.05。本图改编自 Boyle 等人31。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大肠杆菌对分娩时间、仔鼠存活率的影响；数据图表；统计分析；生物医学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：阴道内接种 E. coli 对分娩时间及仔鼠存活率的影响。（A）在存在 E. coli 的情况下，分娩时间缩短。（B）活产仔鼠的比例显著降低，且（C）暴露于 E. coli 的仔鼠存活率下降。分娩时间：每组 n = 8–10 窝；活产仔鼠：每组 n = 10–17 窝；仔鼠存活率：每组 n = 10–12 窝。*p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001。本图改编自 Boyle 等人31。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠发光成像；胎儿组织分析；示意图显示随时间变化的辐射强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig6.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图6"> 
图6：利用生物发光成像监测大肠杆菌（E. coli）的扩散。（A）在48小时内，具有生物发光性的大肠杆菌（E. coli）从阴道上行至子宫角。（B）解剖显示，18小时内子宫角已发生大肠杆菌（E. coli）感染，（C）胎盘和胎儿膜也出现感染。本图改编自 Suff 等人25 和 Boyle 等人31 的研究。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="大肠杆菌与PBS处理组中中性粒细胞浸润的显微图像、Ly6G+细胞图示数据及炎症分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig7.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图7"> 
图7：胎儿肺组织中性粒细胞的Ly6G染色。（A）PBS组与E. coli暴露组胎儿肺组织中Ly6G染色（阳性：箭头所示），用于评估中性粒细胞浸润情况。（B）E. coli暴露组胎儿肺组织中Ly6G+细胞的平均数量显著增加。放大倍数：40×。比例尺 = 59.5 µm。每组n = 10，来自5窝胎鼠。*p &lt; 0.05。缩写：Ly6G = 淋巴细胞抗原6复合物基因座G6D。本图改编自Boyle等人的研究31。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="TUNEL 检测显微镜图像及 GFAP、IBA1 免疫染色图；细胞死亡、分支分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig8.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 8"> 
图 8：TUNEL、IBA1 和 GFAP 染色示例。 （A）经 PBS 或 E. coli 处理的新生幼鼠脑组织中用于检测细胞死亡的 TUNEL 染色。（B）在皮层、梨状皮层、外囊、海马和丘脑中，TUNEL+ 细胞的平均数量增加。（C）PBS 组与 E. coli 组中小胶质细胞的 IBA1 免疫组织化学染色。（D）作为小胶质细胞活化指标的分支指数，在 E. coli 处理组幼鼠的外囊和纹状体中升高。（E）星形胶质细胞的 GFAP 染色，（F）在 E. coli 处理组幼鼠的梨状皮层和外囊中表达增加。比例尺 = 59.5 µm。缩写：GFAP = 胶质纤维酸性蛋白；TUNEL = 末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记法；Pyr = 梨状皮层；EC = 外囊；Str = 纹状体；Hip = 海马；thal = 丘脑；total = 所有区域；CA = 阿蒙角；OLV = 光学亮度值。免疫组织化学分析：每组来自 5 窝，n = 5–7。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，n.s. — 无显著性差异。本图改编自 Boyle 等人31。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="脑组织染色比较；示意图和图表显示PBS与大肠杆菌对脑部指标的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig9.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图9"> 
图9：尼氏染色及形态学评估的阳性与阴性示例。（A）对新生幼鼠脑组织进行尼氏染色，以评估组织结构和形态。（B）脑宽度未受影响，但（C）暴露于E. coli的幼鼠皮层厚度降低。（D）海马体积无显著差异。放大倍数：1x。比例尺 = 1.5 mm。每组n = 5–7，来自5窝幼鼠。**p &lt; 0.01。本图改编自Boyle等人的研究31。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>一抗</td>
			<td>稀释比例</td>
			<td>二抗/稀释比例</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP</td>
			<td>   1:6000 </td>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-IBA1</td>
			<td>   1:1000 </td>
			<td>Goat anti-rat</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Ly6G</td>
			<td>   1:1000 </td>
			<td>Goat anti-rabbit</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫组织化学所用抗体。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>试剂</td>
			<td>时间（分钟）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>尼氏染色液</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>新鲜蒸馏水</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>新鲜蒸馏水</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>70% 乙醇</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>90% 乙醇</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>96% 乙醇</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>含3-5滴冰醋酸的96% 乙醇</td>
			<td>2-5（需持续观察）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>100% 乙醇</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>异丙醇</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>二甲苯</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>二甲苯</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>二甲苯</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：尼氏染色步骤。

早产（分娩） &#60; 37周）是一个紧迫的全球健康问题，目前尚缺乏理想的预防和治疗手段。本文介绍了一种通过上行性阴道细菌感染诱导小鼠早产的模型，并阐述了如何分析由此导致的新生儿发病和死亡情况。

早产仍然是全球新生儿死亡和发病的主要原因，但目前可用的预防性治疗手段有限。迫切需要……

首先，将10毫升含抗生素的Luria-Bertani（LB）液体培养基加入无菌的30毫升通用容器中。从–80摄氏度冰箱中取出一管冻存的埃希氏菌（Escherichia coli）甘油菌种。使用无菌的移液器吸头轻轻刮取冻存菌种表面，使吸头表面沾上少量细菌，随后直接将该吸头投入盛有LB液体培养基的通用容器中。用封口膜密封容器，贴上生物危害标签，并将其置于设定为 200 RPM 和 37 °C 的摇床中过夜。次日早晨，通过将 0.1 毫升菌液加入 9.9 毫升新鲜 LB 肉汤中，将过夜培养的细菌培养物按 1 比 100 稀释。将稀释后的培养物重新放回 200 RPM 和 37 °C 的摇床中培养 1.5 至 3 小时。现在，用移液器吸取100微升培养物，重复加入到透明平底96孔板中，并使用带有光程校正功能的分光光度计测定吸光度。当600纳米处的光密度值达到0.5至0.7时，取出100微升细菌培养物，将其加入900微升无菌PBS中进行稀释。以 14,000g 离心样品一分钟，以洗涤细菌沉淀并去除培养基。弃去上清液，将沉淀重悬于无菌 PBS 中，然后用无菌 PBS 将悬液稀释 1 至 10,000 倍，使菌落数达到 100 至 1000 个菌落形成单位。麻醉小鼠后，使用无菌 200 微升移液枪头将 20 微升处于对数中期的 E.coli 菌液注入阴道。然后，使用新的无菌 200 微升枪头，将 20 微升 20% Pluronic F-127 凝胶送入阴道，以防止细菌泄漏。用无菌纱布蘸取奎宁粉末涂抹于外阴部，防止小鼠舔舐该区域。启动成像软件后，点击“Initialize”（初始化），并等待相机达到工作温度，此时温度条显示为绿色且处于锁定状态。48小时后，将动物置于生物发光成像仪的加热载物台上，保持仰卧位，同时维持麻醉状态。检查发光成像箱，确保激发滤光片处于关闭状态，发射滤光片处于开启状态。然后，选择自动曝光时间。该图展示了在怀孕小鼠中，发光性大肠杆菌感染从阴道向子宫及胎儿组织随时间进展的过程。感染后48小时内，发光性大肠杆菌已到达子宫角，并在胚胎第18.5天检测到强烈的发光信号，而胚胎第16.5天则未检测到信号。感染后仅18小时，解剖的子宫角即可观察到明显的生物发光信号，表明病原体迅速在子宫内定植。感染在18小时内已扩散至胎儿腔室，胎盘、胎儿膜和羊水中的发光信号证实了这一点。

modeling-ascending-vaginal-infection-preterm-birth-neonatal-morbidity

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠上行阴道感染、早产和新生儿发病率的建模

来源：Seman, B. G., et al. 一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿成像模型。J. Vis. Exp.

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本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia...

建立雌性小鼠尿路感染模型

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内...

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

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使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

我们建立了一种绒毛膜羊膜炎模型，以模拟胎儿在无活体生物并发症的情况下暴露于母体炎症（FEMI）的环境，从而研究FEMI对子代肠道发育的影响。该模型可用于探讨绒毛膜羊膜炎后肠道损伤发生机制的相关病因。...

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一种用于免疫细胞分析的坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型及固有层分离方法

本文提供了一种全面的方案，用于建立母体免疫激活（MIA）小鼠模型，以研究妊娠早期炎症对神经发育的影响，包括确保实验可靠性和可重复性的关键指标。...

建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

了解利用大肠杆菌建立小鼠上行阴道感染模型以研究早产机制的方法。该模型通过生物发光成像追踪感染进程，为分析新生儿发病率和死亡率提供可靠实验基础。

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

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