Name: 揭开查加斯病小鼠模型的体内生物发光成像的神秘面纱，用于药物疗效研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解查加斯病小鼠模型中体内生物发光成像技术，用于实时追踪Trypanosoma cruzi寄生虫负荷并评估抗寄生虫药物的疗效。该方法可区分抑制寄生虫血症与实现寄生虫学治愈的药物，为药物发现提供非侵入性监测框架。

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作者感谢Amanda Franscisco、John Kelly和Fanny Escudié在药物功效检测方面提供的BLI培训与支持，感谢John Kelly和Simone Calderano提供寄生虫，以及Gabriel Padilla在动物实验方面的支持。A.C.S.获得了巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）PSDE奖学金，用于在伦敦卫生与热带医学院（英国）进行培训。作者还感谢圣保罗大学科研核心设施（CEFAP-USP）的流式细胞术与成像研究（FLUIR）平台在IVIS Spectrum设备分析方面提供的技术支持，以及圣保罗大学生物医学科学研究所（ICB-USP）遗传学与卫生控制实验室在实验后为小鼠进行的特定病原体阴性（specific pathogen-free）质量控制检测。本项目由DNDi资助。DNDi感谢自2003年成立以来为其各项活动提供资金支持的公共和私人捐助方。DNDi捐助方的完整名单可访问&#160;https://dndi.org/about/donors/ 查询。

In Vivo Bioluminescent Model of Chagas Disease for Drug Evaluation

作者声明无利益冲突。

生物发光成像是一种突破性方法，可通过可见光和红外电磁波谱检测报告基因，因此无需使用放射性标记物来追踪样本35。该技术适用于啮齿类动物模型及其他小型物种，在临床前研究中尤为有用，因其更安全且可进行多次成像，对动物造成的不适极小。此外，由于能够将生物发光、荧光与其他技术（如正电子发射断层扫描）相结合，in vivo 成像具有很高的灵活性36。
光学成像受光学物理特性支配，例如吸收和散射。不同组织对不同波长的光具有各异的吸收和散射特性37一个关键步骤是在选择报告基因时未考虑化学反应所产生光的发射波长。尽管报告基因的表达水平可能很高 体外 在生物发光检测中，当进行到下一步时，可能无法达到相同的表达水平 体内 设置。在本方案中，我们使用了红移的 Photinus pyralis 荧光素酶（PpyRE9H）38 为锥虫科生物优化的密码子版本9，其在617 nm处发光，是其中最适合的波长之一 体内 研究39波长超过600 nm的光被体内内源性发色团（尤其是血红蛋白和黑色素）吸收和散射的程度较低。因此，红光可穿透数厘米厚的组织，使光子即使来自内脏组织内部也能到达CCD相机39,40.
成像领域的一个关注点是，人们对成像技术的功能和效应缺乏全面的理解。像素合并（Binning）是一种预处理技术，可将相邻探测器获取的信息整合为更大的像素。该过程能够提高信噪比，降低背景噪声，增强灵敏度。然而，它会降低空间分辨率的准确性，导致图像出现像素化现象41,42。&#160;这种权衡是在制定成像策略时需要重点考虑的因素。
根据恰加斯病的目标产品概况和目标候选药物概况34，概念验证研究的重点是检测克氏锥虫（T. cruzi）的敏感性，并帮助确定新的候选药物是否能够实现无菌性治愈（表现为经过多轮免疫抑制后无复发）。因此，我们采用最高的分箱因子进行生物发光成像（BLI），但避免图像过饱和。当图像出现过饱和时，将使用较低的分箱因子重新进行成像采集。在分析过程中，对使用了不同分箱因子的图像应用数学校正方法。通过这种方式，最终数据应以相同的分箱因子呈现。表1展示了在同一图像和感兴趣区域（ROIs）应用不同分箱因子时获得的数值差异。
表1：分箱设置对BLI定量的影响。 对急性模型（d13）和慢性模型（d118）图像上的三个感兴趣区域（ROI）在不同分箱因子下进行定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
由于目前临床中恰加斯病的现状，药物研发的目标是彻底清除寄生虫&#160;（寄生虫学治愈）27,34因此， 体内 临床前实验方案包含多种方法，以克服生物发光成像（BLI）技术灵敏度的局限性。其中一种方法是使用环磷酰胺处理小鼠，以降低免疫反应，从而减少对寄生虫载量的控制。另一种策略是减小组织深度，去除阻碍光线到达相机的肌肉、皮肤和毛发层。通过上述方法 离体 步骤，可检测到微小的生物发光点，揭示出皮下的寄生虫病灶&#160;体内 BLI 阈值，如图所示 图5C 在 离体 Posa处理小鼠的结果
设计初步实验以评估模型本身及感染动态，对于建立准确的抗寄生虫药物疗效评价实验至关重要。因此，研究人员可提前确定合适的生物发光成像（BLI）参数和感染时间进程。在探索性实验中，一种有助于确定图像采集参数的工具是“自动曝光”功能。使用该工具时，研究人员可设定三个参数（曝光时间、二乘二合并（Binning） 和 F/Stop）的优先级，以获取最佳图像。特别需要注意的是，应确保图像采集处于CCD相机的动态范围之内，避免过饱和或曝光不足，这可通过标尺的最小值和最大值以及自动曝光功能进行检查（菜单路径：编辑 &#62; 首选项 &#62; 采集选项卡 &#62; 自动曝光选项卡）。在本方案中，相机光圈设置为最大值（F/Stop: 1），并为急性模型和慢性模型分别设定了不同的曝光时间和二乘二合并因子。这些设置有助于在同时进行多轮成像时实现时间上的可预测性。由于报告基因方法基于酶促反应，底物在小鼠体内的生物分布以及荧光素酶的动力学均会影响生物发光信号，从而影响感染程度的定量（图1B）。因此，在酶促反应的不同时间点采集图像会引入无法校正或补偿的数据变异性，进而影响总通量（光子/秒）或辐射通量（光子/秒/cm2/球面度）的计算结果。此外，T. cruzi 感染在小鼠体内具有动态的空间分布特征（不同区域和组织、深度以及寄生虫负荷）。因此，若仅依据设定的计数值进行图像采集，当某一较强信号源满足自动曝光条件时，可能会遗漏较弱的信号源（例如组织较深处某区域寄生虫数量较少），导致检测不全。
Living Image 软件的一个棘手特性是所获取图像会以自动颜色标尺显示。该软件没有选项可预先设置标尺，以使新获取的图像自动按照选定的标尺值显示（参见实验方案步骤 6.2）。这种情况迫使研究人员必须手动逐个调整图像至选定的最大值和最小值。因此，缺乏经验或培训不足的用户在采集过程中无法获得正确的读数，可能在此时误导数据或丢失重要信息。为此，预实验具有重要意义。
关于概念验证实验设计最常见的问题之一是如何选择处理持续时间和剂量。对于新化学实体，这些参数通常由化合物的效价和选择性决定 体外，结合在测试前开展的药物代谢与药代动力学（DMPK）及耐受性研究产生的数据 体内 以评估其有效性。综上所述，在鉴定出能够在细胞内选择性杀灭寄生虫的化合物后，将进行首次ADME实验（吸收、分布、代谢和排泄） 体外 以评估化合物的水溶性、细胞通透性和代谢稳定性等参数。若化合物表现出良好的平衡性 体外 特性（通常在目标候选特征谱中定义），随后这些候选物将被推进至 在体 在健康小鼠中进行的药代动力学（PK）研究，可阐明化合物在血液中的暴露情况（也可能包括组织中的暴露），并初步评估不同剂量水平下的耐受性17,34,43理想情况下，大多数感染性疾病中药代动力学评估的目标是确定游离血浆浓度（已校正血浆蛋白结合率）达到并超过EC的可行性50/EC90 浓度44 -&#160;分别指在足够长的时间内，杀死或至少抑制50%或90%寄生虫生长的有效浓度。若在特定剂量水平达到足够的暴露量，则该给药方案可用于基于恰加斯病BLI模型的药效学研究。对于药物重定位研究， 体外 和 体内 应获取药代动力学数据。药物重定位的一个良好起点是化学数据库，例如 PubChem。45，这些数据可通过异速生长缩放法转换应用于小鼠46 以评估安全且无毒性的治疗方案供进一步测试。然而，实际情况并非总是如此。药代动力学（PK）研究在学术科研领域仍常被忽视，且很少有制药公司公开其PK研究结果。药物研发科学界建议，应在药物有效性检测（药效学）的同时，纳入体内药代动力学评估。47因此，临床前成像可与化合物检测同时进行，这种联合方法增强了数据的稳健性。
此外，在整个实验过程中需持续监测小鼠的操作、体重和健康状况。在临床前研究中，应记录并报告该组小鼠或个体小鼠出现的任何毒性迹象和副作用，例如弓背、颤抖、失去平衡、不愿移动、拒食或拒水、卧倒不起或其他任何异常情况。光学成像的目标之一是确保实验动物的福利。因此，对于出现“疼痛表情量表”中所描述疼痛迹象的小鼠，应实施人道终点措施48。同时，在进行生物发光成像（BLI）期间，小鼠每周&#160;称重一次&#160;，而在给药和环磷酰胺（CTX）治疗期间则需更频繁地称重。根据动物福利相关规定，若小鼠体重减轻超过20%，必须立即实施人道安乐死。
T. cruzi 生物发光模型现已成为发现&#160;和开发&#160;克氏锥虫病新疗法的前沿实验模型。该模型可模拟 T. cruzi 感染及克氏锥虫病的关键特征49，能够实时监测寄生虫血症，并区分具有不同疗效特征且作用机制已知的化合物。生物发光成像（BLI）是一种可提高感染组织识别准确性的技术，能够精确定位可用于多种研究方法的感染组织，包括所有已在 T. cruzi 研究中应用的经典方法50,51。此外，该技术还使研究人员能够探索前沿技术并开发新技术33。同时，BLI 还遵循“3R”原则，有助于改善实验动物福利并实现更合理的动物使用10,35，一举多得。
多个专注于被忽视热带病的研究团队位于缺乏体内成像设备的国家。为应对当前状况，诸如全球生物成像（Global BioImaging）及其相关联盟等新型国际网络正推动相关行动，以提供对成像核心设施的开放获取，并加强技术人员与成像科学家的培训52,53。这些举措，结合本方案等易于操作的用户协议，可为所有研究人员创造条件，使高端技术得以普及化。该方法在临床前药物发现中的应用，提供了可靠的疗效读数和对临床结果的预测价值，有助于推动恰加斯病的药物研发。

恰加斯病在拉丁美洲呈地方性流行，全球约有七百万人受到感染1。每年因该疾病导致的致残性后果引发超过五万例死亡，并造成约七十亿美元的经济损失&#160;2。恰加斯病由原虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，该病原体是一种异宿生的血鞭毛虫寄生虫，可在美洲地区感染哺乳动物（野生和家养）以及锥蝽媒介（半翅目，猎蝽科）3，并在该区域建立了媒介传播循环。其他重要的感染途径包括输血、器官移植、经口途径（摄入被感染锥蝽污染的食物）4以及先天性传播。非媒介传播途径促使恰加斯病扩散至非流行地区3,5。
恰加斯病表现为两个临床阶段。在大多数情况下，急性期无症状。有症状的感染通常与非特异性体征相关，如发热、疲劳、肌痛、淋巴结病、脾肿大和肝肿大。急性期还常伴有明显的寄生虫血症和寄生虫的全身循环。在诊断病例中，死亡率可能高达10%，尤其是在经口感染的病例中6。慢性期通常表现为长期无任何症状。随着时间推移，大约三分之一在数十年前感染的患者会出现心脏表现，通常伴有纤维化和心肌炎症，和/或胃肠道紊乱，主要与巨食管和/或巨结肠综合征的发展相关3,5,6。
恰加斯病的病因治疗仅包括两种药物：苯硝唑和硝呋莫司。这些抗寄生虫药物已使用超过50年，具有明显的毒性且疗效有限5,7,8。因此，迫切需要为恰加斯病患者开发新的、安全且更有效的治疗方法。
如今，更复杂且精确的技术使得人们能够回答一些长期存在的问题，从而推动了对恰加斯病新疗法的探索。在这方面，经过基因改造的寄生虫为开展感染过程及药物疗效评价的体内研究提供了重要支持9,10,11,12。基于生物发光成像（BLI）系统的纵向检测方法可在治疗过程中及治疗结束后评估药物疗效，有助于鉴定具有锥虫杀灭活性的化合物10,13。BLI 方法通过定量检测经基因改造的T. cruzi CL Brener Luc::Neon 菌株所发出的光信号，直接测量循环系统或组织器官中的寄生虫负荷量11，该菌株可持续表达红移型萤火虫荧光素酶12。
尽管在建立恰加斯病BLI动物模型及药物疗效研究方法后已过去近10年，但目前仍仅有少数研究团队掌握并主导该技术。这一现状不仅源于成像设备获取受限，更在于缺乏系统化、详尽的操作流程以及相关培训资源。相较于依赖显微镜检测寄生血症、血清学方法或通过qPCR检测寄生虫DNA以评估器官/组织感染程度的传统手段，该方法具有多项优势：它能够通过获取更可靠且整合性更强的数据，提升实验小鼠的福利水平，并减少实验动物的使用数量。 体内此外，这种方法的灵敏度可能更高，因为它能够在药物治疗后轻松检测到内脏器官中的寄生虫病灶。10,12因此，本实验方案旨在通过详细描述技术操作步骤，指导寄生虫学及其他传染病研究团队在其实验室中建立该方法。本文分享了在巴西实施恰加斯病生物发光成像（BLI）模型的经验，这是拉丁美洲首个此类模型，作为被忽视疾病药物倡议组织（DNDi）协调的药物发现工作的一部分。

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade; X-20 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子天平（动物房用）</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Revvity（原 PerkinElmer）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJ 软件 v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrum 用 Living Image 软件 v4.7.1</td><td>Revvity（原 PerkinElmer）</td><td></td><td>可使用 Spectral Instruments Imaging（Bruker 公司）提供的免费分析软件“Aura Imaging”实现其基本功能（https://spectralinvivo.com/software/）</td></tr><tr><td>Microsoft Office 软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低糖培养基</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT 培养基</td><td>本实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B（50 mg/mL）</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;prime;s 昆虫培养基</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite D-荧光素钾盐</td><td>Revvity（原 PerkinElmer）</td><td>122799</td><td>也可使用：VivoGlo 荧光素，活体级（Promega/P1043）；D-荧光素，单钾盐（Thermo Scientific/88293）或 Pierce D-荧光素，单钠盐（Thermo Scientific/88291）；D-荧光素，钾盐（GoldBio/LUCK 或 eLUCK）；D-荧光素，钠盐（GoldBio/LUCNA 或 eLUCNA）。钠盐与钾盐在溶解度上差异极小，对活体性能无显著影响。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>环磷酰胺（CTX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>羟丙基甲基纤维素（HPMC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>苯硝唑</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泊沙康唑（Noxafil 商品制剂）</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌胃针（不锈钢直头）- 22GA</td><td>Aton</td><td>&amp;nbsp;CA2003</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器及 31G 针头</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器及可拆卸 26G 针头</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器及可拆卸 24G X&amp;frac34; 针头</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器 0.2 &amp;micro;m</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A4 哑光黑纸 120 克或更厚</td><td>Paper Color / Canson（可从多家供应商处获得）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 计数室）</td><td>可从多家供应商处获得</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

为了控制并降低恰加斯病、利什曼病和人类非洲锥虫病等人源原虫病对公共卫生的影响，亟需加快新药和疫苗的研发进程。然而，这一过程面临诸多困难，例如寄生虫生物学和疾病发病机制的高度复杂性，以及与大多数被忽视的热带病一样，研发领域的科研经费相对有限。因此， 体外 和 在体 能够充分再现感染和疾病关键特征同时合理利用资源的研究模型，对于推进这些疾病的研究至关重要。一个例子是 体内 用于克氏锥虫病的生物发光成像（BLI）小鼠模型，可高灵敏度检测由长波长光产生的信号 克氏锥虫 表达荧光素酶的寄生虫。尽管该技术已成为药物疗效评估的标准方法 体内 研究，即使在生物发光成像（BLI）设备易于获取的情况下，研究团队仍可能因缺乏关于设备操作和质量控制程序应用的充分实践培训而难以实施该技术。鉴于这一现状，本实验方案旨在从实验设计、数据采集到数据分析各个环节提供详细指导，以帮助那些在查加斯病或其他传染病小鼠模型研究中缺乏或仅有少量BLI使用经验的研究团队顺利建立并实施相关实验流程。

利用基于组成型表达荧光素酶的转基因寄生虫的合适小鼠模型，能够重现关键的人类T. cruzi感染特征，同时对宿主造成的伤害最小，从而可通过全身体内生物发光成像（BLI）对宿主中的寄生虫进行长达数月的实时、纵向（终生）追踪12。
图3展示了一项初步实验，显示了CL Brener Luc::Neon株在BALB/c小鼠体内从感染后第1天至感染后150天（dpi）的感染时间进程。在前20天内，基于生物发光信号推断的寄生虫负荷上升，表现为典型的寄生虫血症高峰，随后由于小鼠免疫系统的控制作用，寄生虫负荷急剧下降。因此，感染的急性期定义为前50天。当感染达到稳定的生物发光水平时，即进入慢性期，通常出现在100至150 dpi之间。
<img alt="慢性感染研究，生物发光成像，通量图；感染进程分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3理解模型。 动力学 克氏锥虫 CL Brener Luc::Neon 感染 BALB/c 小鼠（n = 11）。上图：通过腹腔注射 1 × 10³ 个血液型动基体鞭毛体，感染后 150 天内不同时间点的腹侧与背侧生物发光图像。热图标度（以 Log 为单位）10) 以辐亮度（p/s/cm²/sterad）表示的生物发光信号2/sr）。颜色代码：紫色 = 5 × 103；红色 = 1 × 107下图：小鼠整体生物发光信号以总通量（p/s）进行定量。数据以均值（线条）和标准差（阴影区域）表示。该小鼠模型中感染急性期与慢性期的时间段以橙色标出。非感染小鼠（n = 3）的发光均值作为阈值（浅灰色线）显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
由于感染的主要阶段在小鼠模型中得到了良好重现，因此也可以预测治疗效果。因此，生物发光成像（BLI）现已被应用于转化科学研究，通过概念验证研究支持有关化合物疗效潜力及其在研发管线中推进决策的判断10,27。在急性小鼠模型中，口服治疗应在感染达到寄生血症高峰时开始（约感染后14–21天），此时血液中含有大量上鞭毛体（约1 × 105 个上鞭毛体/mL——数据未显示），并表现为全身性感染。在慢性阶段，小鼠治疗始于感染后100天，此时寄生虫负荷相对低得多，且寄生血症处于稳定的隐性水平。
为展示上述方案在抗寄生虫药物评价中的应用，我们比较了苄硝唑（BZ）——目前治疗恰加斯病的标准药物，与泊沙康唑（Posa）——一种甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）抑制剂，后者在恰加斯病的临床试验中已显示无效，且已被证实作为抗寄生虫药物针对 T. cruzi 体外培养 和 体内，包括在本方案所述的BLI模型中13,18,28,29,30.
在急性小鼠模型中，每组6只小鼠，分别通过口服灌胃31给予波沙（Posa）20 mg/kg 或苯硝咪唑（BZ）100 mg/kg，每日一次，持续20天。另设小鼠给予BZ 100 mg/kg 每日一次，连续治疗5天，以评估短期治疗的效果。在药物清除期（停药后10天），将生物发光成像（BLI）阴性小鼠进行免疫抑制处理，该条件可在未实现寄生虫学治愈时促进感染复发（图4A）。波沙治疗在疗程结束时使基于生物发光推断的寄生虫负荷减少了99.49% ± 0.27%（均值 ± 标准差），并在药物清除期间维持与非感染小鼠相似的水平（仅小鼠#3在40 dpi时出现短暂信号，小鼠#2在44 dpi时显示微弱的BLI信号）。与未治疗组相比，BZ连续治疗20天在疗程结束时使基于生物发光推断的寄生虫负荷减少了100% ± 0.01%。相比之下，BZ短期治疗5天在19 dpi时实现了99.98% ± 0.03%的减少（接近检测阈值水平）。然而，此种BLI信号的降低是短暂的，在后续检测中，所有小鼠均出现感染再激活（图4B）。
<img alt="CD急性模型时间线与数据；感染、治疗；实验结果；示意图、图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：利用生物发光成像在恰加斯病急性模型中开展的概念验证实验设计及结果。 (A急性克氏病小鼠模型用于化合物疗效临床前评估的时间线流程示意图。黑点：成像时间点。药瓶和橙色条：分别表示治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射。dpi：感染后天数。颜色编码：灰色 = 未治疗感染；橙色 = 治疗期；蓝色 = 化合物清除期；黄色 = 免疫抑制期。B) 处理时间进程 克氏锥虫左图：BALB/c小鼠的腹侧生物发光成像结果，(i) 未处理组，或经20天处理的 (ii) 泊沙康唑（Posa）20 mg/kg组、(iii) 苯硝唑（BZ）100 mg/kg组（连续给药20天）和 (iv) 苯硝唑（BZ）100 mg/kg组（给药5天）（每组n = 6）。所有药物均通过灌胃途径每日给药一次（10 mL/kg）。Log10 色阶热图表示从低（蓝色）到高（红色）的生物发光信号强度。右侧图表：全身体内生物发光成像数据的定量分析。数据以均值（线条）和标准差（阴影区域）表示。图注：药瓶图标：治疗开始（感染后第14天）；橙色竖线：治疗结束（感染后第18天/第33天）；注射器图标：环磷酰胺注射（第44–53天）；橙色圆点：用于分析的小鼠 离体 步骤；§ 由于尿液中 D-荧光素泄漏，相关数据已被排除。C) 离体 操作步骤 T. cruzi 器官和组织中病灶检测。图底部展示了孔板分布图例（由 BioRender.com 制作：ZY26LG8AOF）。采用相同的辐射强度标度 体内 面板 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在此模型中，抗寄生虫治疗可能将寄生虫负荷降低至BLI检测下限（1000个寄生虫）以下，因此小鼠表现为BLI阴性10为确保实现寄生虫学治愈，有必要通过环磷酰胺处理对小鼠进行免疫抑制。29,32. 经药物治疗后寄生虫负荷仍不可检测的小鼠，在免疫抑制后将转为生物发光成像阳性。在急性模型中，Posa处理更广泛地展示了这一效应，其可促进寄生虫复发。本实验中，e离体 在生物发光信号最低的小鼠中进行该操作，以评估寄生虫的组织趋向性（图4C）。未经治疗的小鼠显示出强烈的生物发光信号，尤其是在胃肠道（TGI）及内脏脂肪和肠系膜等相关组织中。此外，皮肤也是寄生虫持续存在的部位之一。接受泊沙康唑（Posa）治疗的小鼠表现出强度较低的生物发光信号，且信号更局限于结肠、肠系膜和内脏脂肪。另一方面，采用治愈性治疗方案（如每日给予BZ 100 mg/kg，持续20天）处理的小鼠，即使在免疫抑制条件下也未检测到生物发光信号。因此，在考虑促进生物发光信号上升至超过1000个寄生虫阈值水平的条件下10，并通过暴露内脏器官以提高检测灵敏度，认为连续20天给予100 mg/kg的BZ可实现无菌治愈。此前已采用多种技术对无菌治愈的评估方法进行了验证10,13,17,33,34.
在慢性模型中采用了类似的研究设计（图5A），其中小鼠（每组 n = 6）从感染后第100天开始治疗。此时，每日口服给予泊沙康唑（Posa）20 mg/kg、BZ 100 mg/kg 或 10 mg/kg，持续20天。在药物清除期结束后，对生物发光成像（BLI）阴性的小鼠进行免疫抑制处理。此外，为了评估无菌治愈情况，在免疫抑制阶段结束时仍保持BLI阴性的小鼠接受离体（ex vivo）分析。
在慢性感染中，使用20 mg/kg的Posa治疗，治疗结束时通过生物发光推断的寄生虫负荷降低了95.03% ± 6.18%，且在药物清除期间维持在与未感染小鼠相似的水平。免疫抑制后，大多数小鼠表现出不同程度的BLI信号和分布图5B). 离体 实验结果显示，一只经泊沙康唑处理且全身生物发光成像呈阴性的 小鼠，通过成像检测可在结肠部位发现一处生物发光信号 离体 检查（图 5C).
<img alt="CD慢性模型时间线、生物发光成像、治疗效果、感染实验结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5慢性模型中的药物评估实验设计及取得的结果 克氏锥虫 通过生物发光成像检测感染。 (A慢性恰加斯病小鼠模型实验设计示意图。黑点：成像时间点。药瓶图标和橙色条：分别表示治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射。dpi：感染后天数。颜色编码：灰色 = 未治疗感染；橙色 = 治疗期；蓝色 = 化合物清除期；黄色 = 免疫抑制；淡紫色 = 复发。B) 克氏锥虫病慢性模型中治疗效果的纵向评估。左图：BALB/c小鼠的腹侧生物发光成像（BLI），（i）未治疗组，或经20天治疗组：（ii）口服20 mg/kg泊沙康唑（Posa）；（iii）口服100 mg/kg苯硝咪唑（BZ）；（iv）口服10 mg/kg苯硝咪唑（BZ）（n = 6/组）。所有药物均通过灌胃每日给药一次。右图：腹侧与背侧总荧光通量原始数据之和。图示：药瓶图标：治疗开始（感染后第102天）；橙色条：治疗结束（感染后第121天）；黄色条与注射器图标：环磷酰胺注射（第131至142天）。橙色圆点：经分析的小鼠 离体 操作过程中！小鼠在麻醉期间死亡。 <img alt="静力平衡，ΣFx=0 示意图，用于说明受力平衡，是物理与工程教育中的关键内容。" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 小鼠表现出腹部异常。热图刻度（Log10) 表示以辐射单位计量的生物发光强度，从低水平（3 × 10⁻⁹）开始5 为蓝色）到高（1 × 107 如红色所示）。(C) 离体 分析 T. cruzi 组织趋向性。免疫抑制小鼠离体器官的生物发光检测 体内 经Posa和BZ（100 mg/kg）处理后BLI呈阴性的动物，或未经处理组及BZ（10 mg/kg）组中信号最低的动物。图底部显示了孔板分布示意图（由BioRender.com制作：ZY26LG8AOF）。辐射度标尺单位相同 体内 面板 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
以100 mg/kg剂量给予BZ处理，在122 dpi时将生物发光降低至阈值水平（93.87% ± 2.14%），并持续至实验结束。考虑到 离体 分析显示，BZ治疗组达到了100%的治愈率（6/6只小鼠），即使在免疫抑制状态下且对内脏器官进行检测后，也未发现生物发光信号的复发，表明无复发迹象。然而，较低浓度的BZ治疗方案仅使生物发光信号轻微降低（85.95% ± 18.43%），但未能实现治愈，因为小鼠在后续所有时间点仍持续显示可检测到的生物发光信号病灶。因此，该模型能够对无效治疗（如泊沙康唑及苯并咪唑次优治疗）与有效治疗（如苯并咪唑的最佳剂量和疗程）进行定量区分。
补充图1：通过报告基因mNeonGreen荧光检测克氏锥虫（T. cruzi）群体在感染前的荧光素酶表达分析。 对CL Brener Luc::Neon寄生虫持续表达的mNeonGreen荧光蛋白进行流式细胞术分析。图中为寄生虫数量（Y轴）相对于mNeonGreen荧光强度（X轴）的归一化直方图。内部图例显示了所分析的菌株与形态、荧光中位值以及荧光群体百分比。门控线由CL Brener野生型（WT）菌株作为非荧光对照确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：BLI 测量中分析表格的示例。 从代表性结果中所示急性模型感染后第 19 天的生物发光成像定量获得的原始数据，该结果见于 图 4B。组别说明：对照组为未感染小鼠（n = 3/组）；溶剂组为感染但未治疗小鼠；泊沙康唑（Posa）剂量为 20 mg/kg，连续给药 20 天；苯硝唑（BZ）剂量为 100 mg/kg，连续给药 20 天；苯硝唑（BZ）剂量为 100 mg/kg，给药 5 天（n = 6/组）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细描述了在Trypanosoma cruzi感染的生物发光模型中开展药物疗效研究的具体步骤，重点介绍数据采集、分析与解读。同时提供了故障排除和质量控制程序，以尽量减少技术问题。

为了控制并降低恰加斯病、利什曼病和人类非洲锥虫病等人源原生动物疾病对公共卫生的影响，……

我们的研究团队致力于恰加斯病的药物发现。我们正在寻找更新、更有效的药物，同时试图阐明寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）如何在宿主体内持续存在，即使在有效药物治疗后仍能存活，且不产生耐药性。恰加斯病是一种复杂的全身性感染，必须在疾病进展至复杂阶段之前实现寄生虫学治愈，才能成功治疗。该疾病在人体中表现出多种形式，但目前的动物模型尚无法完全再现该疾病的所有重要特征。理想情况下，针对恰加斯病的新型抗寄生虫药物应能实现寄生虫学治愈，即彻底清除宿主体内的克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）。这些实验方案可实现对小鼠体内寄生虫负荷的实时追踪，并能区分仅暂时抑制寄生虫血症的化合物与能够实现寄生虫学治愈的化合物。由于使用荧光素酶作为克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的报告基因，本方案可实现对小鼠在急性期和慢性期感染过程中进行非侵入性、减少动物使用数量的纵向监测，同时还能实现实时监测内脏感染情况。通过采用类似方案，我们正在开发新方法，以研究药物治疗如何通过预防疾病发生和治疗复杂的查加斯病（Chagas disease）来使宿主受益。我们还将继续研究涉及克氏锥虫逃逸药物治疗的相关因素。首先，在桌面上启动成像软件。依次点击“Acquisition”（采集）、“Background”（背景），然后查看“Available Dark Charge”（可用电荷暗电流）以确认自动背景校正功能。在软件完成成像设置调整后，向前三只感染了克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的小鼠注射D-荧光素酶底物（D-luciferin）。将小鼠放入容器盒中，检查是否存在D-荧光素钠泄漏情况。若发生泄漏，需进行记录，并登记小鼠分组及D-荧光素钠注射时间。随后，对小鼠实施麻醉，并将其转移至成像室。进入成像软件的采集窗口，设置曝光时间和像素合并（binning）参数。然后，单击“采集”（Acquire）开始成像。如果出现图像过饱和警告提示，应降低像素合并值，然后重新采集新图像。感染后前20天内，通过生物发光推断的寄生虫负荷逐渐增加。随后在接下来的30天内寄生虫载量急剧下降，这是急性感染的结果。在感染后第100至150天观察到稳定的生物发光信号时，表明已进入慢性感染阶段。首先，在台式计算机上启动数据分析软件。依次点击“文件”和“浏览”，选择“选择文件夹”以打开包含已获取成像数据的文件夹。选中与所选图像相关的多行数据，包括未感染的对照组，同时排除过饱和的图像。在实验记录本中记下图像编号以及第二次成像过程中记录的信息。点击“加载为组”以组合所选图像。随后，点击“保存”图标，将新的序列图像保存至新文件夹中，以便在需要时对原始数据进行重新分析。接下来，单击“选项”，然后选择“显示”，并选择“合并因子”以确定每幅图像所使用的像素合并方式。采集到的合并因子将显示在序列中每幅图像的顶部。为将所有合并因子校正为相同数值，首先需双击待调整的图像。在工具选项板窗口中，单击“图像调整”选项，然后选择适当的像素合并因子。双击未感染小鼠的图像，然后在“单位”字段中选择“计数”选项。将颜色标尺调整至最小值为 600。在“单位”字段中选择辐射亮度选项，以查看生成图像的辐射亮度。激活序列窗口后，在“单位”字段中选择“辐射亮度”选项。取消勾选“颜色比例范围”区域中的独立框，以调整工具面板中的颜色比例和颜色表。标记对数尺度和手动框，然后根据未感染对照组以及信号最强区域设定最大刻度值。在为所有图像设置相同的尺度后，双击每张图像，最大化窗口，并使用“导出图形”选项以图像格式导出图像视图。文件命名方式为处理方式，后接小鼠编号和时间点。双击序列中的任意图像。在工具面板窗口中，点击 ROI 工具部分，然后按下方形图标。在整只小鼠上方绘制一个矩形。单击已创建的感兴趣区域（ROI）的边界，为每只小鼠复制并粘贴相同的 ROI。接下来，命名需要记录的 ROI。然后，单击 ROI 工具部分中的保存图标。选中“应用于序列”选项框。然后，通过点击“加载”按钮将已保存的感兴趣区域（ROI）应用到所有图像。调整每只小鼠感兴趣区域的位置，使其更精确地匹配测量区域。当所有小鼠均标记完成后，点击“测量感兴趣区域（Measure ROIs）”选项，此时应出现“感兴趣区域测量表”。将测量类型设置为辐射通量（Radiance），图像属性设置为所有可能的值，感兴趣区域尺寸设置为厘米（cm）。然后，单击“全选”选项，接着单击“复制”。将数据直接粘贴到表格分析软件中。整理数据列，以便正确排序各组。接下来，在电子表格中按组对数据进行颜色编码。将总通量值按同一只小鼠的腹侧和背侧总通量值对应排列，然后相加，得到每只小鼠的全身生物发光值。计算每组总和值的均值和标准差。将数据导入统计分析软件以生成图表。最后，创建一个生物发光图像面板，将每只小鼠按列放置，时间点按行排列，构建药物疗效矩阵。当采用生物发光法评估抗寄生虫药物时，需建立药物疗效矩阵，以比较测试化合物（本例中为泊沙康唑）与用于恰加斯病的标准药物治疗（即每日一次给予100毫克/千克的苯硝唑）。在本项纵向研究中，通过比较未治疗组与治疗组来展示感染过程的时间变化。结果表明，若寄生虫负荷减少（表现为生物发光信号降低），则提示药物有效；若寄生虫负荷增加并伴随光信号升高，提示出现复发，表明该化合物或治疗方案无效。定量的光以感染时间为函数，表示为腹侧和背侧每秒光子总数的总和。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

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移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

克氏锥虫在受精卵孵化前接种至卵内，可导致该寄生虫的动基体DNA（kDNA）小环整合到胚胎细胞的基因组中。通过杂交繁殖可观察到突变的垂直传递至后代。kDNA整合至多条染色体的编码区域，导致鸡只因炎症性自身免疫性心脏病而死亡。...

寄生虫诱导的基因驱动型自身免疫性恰加斯心脏病鸡模型

目前的临床诊断中，抗菌药物敏感性检测依赖于病原菌在营养丰富且富氧条件下的浮游生长。本研究采用一种替代性的人工痰液培养基，以模拟囊性纤维化患者肺部更具代表性的富氧及微需氧环境，从而研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对Pseudomonas aeruginosa的疗效

了解查加斯病小鼠模型中体内生物发光成像技术，用于实时追踪Trypanosoma cruzi寄生虫负荷并评估抗寄生虫药物的疗效。该方法可区分抑制寄生虫血症与实现寄生虫学治愈的药物，为药物发现提供非侵入性监测框架。

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

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