Name: 利用 Cell Factory 平台生成高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化和标准化程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学习利用Cell Factory平台大规模生产高滴度、高纯度腺相关病毒载体的标准化流程。该方法通过优化培养条件和两步纯化工艺，实现超过90%的病毒纯度，为基因治疗临床前研究提供可靠的技术基础。

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TZ 设计了实验。TZ、VD、SB 和 JP 进行了实验。TZ 和 VD 生成并分析了数据。TZ 和 YX 撰写了手稿。TZ 和 GG 修改了手稿。本研究由匹兹堡UPMC儿童医院资助。

本研究中所用试剂、质粒和设备的详细信息见材料表。所用缓冲液的成分见补充文件1。
1. 质粒制备
<ol>
	<li>将质粒（pAAV-GOI、pHelper、pAAV-Cap）转化至 E. coli 中。 
	注意：质粒扩增可使用任何 E. coli 菌株。对于某些质粒，使用特殊感受态细胞（如 NEB stable）可提高质粒产量。本实验方案中使用的三种质粒分别为 pAAV-GOI：pAAV-CMV-GFP，pHelper：pAdDeltaF6，以及 pAAV-Cap：pAAV-RC6。</li>
	<li>在含有适当选择性抗生素的 LB 培养基中，以适宜体积于 37 °C 培养细菌 16–18 小时。 
	注意：若使用 NEB stable 细胞，则应在 30 °C 培养 18–20 小时。</li>
	<li>将 E. coli 培养液在 4000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟，收集质粒 DNA。</li>
	<li>小心将离心管中的上清液倒入废液容器，使用大规模无内毒素质粒纯化试剂盒从沉淀中纯化质粒 DNA。 
	注意：倾倒时应缓慢进行，避免溅洒。</li>
	<li>使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。 
	注意：通过检测 OD260/OD280 比值评估 DNA 纯度，纯 DNA 的比值约为 1.8。后续共转染步骤要求 DNA 浓度高于 1 µg/µL。通过将 500 µL 过夜培养物与 500 µL 50% 甘油混合于冻存管中，制备细菌甘油菌种，并于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 准备 HEK293T 细胞
<ol>
	<li>将HEK293T细胞接种于含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中，置于10层细胞工厂（CF10）中，于培养箱中过夜培养。 
	注意：为获得高效腺相关病毒（AAV）生产的最佳条件，293T细胞的传代次数应少于10代。如有可能，此时培养基中不要添加抗生素。CF10的生长表面积约为150 mm细胞培养皿的42倍。以相同细胞密度接种150 mm细胞培养皿，以便在显微镜下观察细胞生长情况。制备1075 mL细胞悬液，取25 mL加入150 mm培养皿中，其余加入CF10中。</li>
	<li>转染前一天检查细胞汇合度。 
	注意：通过显微镜观察，转染时细胞应达到80%–90%的汇合度。</li>
</ol>
3. AAV 质粒的三重转染
<ol>
	<li>计算每种质粒所需的量（pAAV-GOI、pHelper、pAAV-血清型），以获得1.2:1:1的摩尔比，且每份CF10的总DNA量为2.5–5 mg。 
	注意：三种质粒的摩尔比可能因转染效率最优化的需求而有所不同。在进行本CF10实验设置之前，建议先在小规模条件下进行测试。以制备AAV6-CMV-GFP病毒为例，使用pAAV-CMV-GFP、pAdDeltaF6和pAAV-RC6三种质粒。PEI计算器公式如下所示 表1.</li>
	<li>将350 mL OptiMEM分装至一个无菌的500 mL瓶中。</li>
	<li>将三种质粒DNA全部加入含有Opti-MEM的瓶子中，充分混匀。</li>
	<li>加入15 mL浓度为1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）溶液（DNA与PEI的质量比为1:3 µg:µg）。将OptiMEM/DNA/PEI混合液上下剧烈振荡30秒。 
	注意：产生气泡是允许的。</li>
	<li>室温孵育混合物10-15分钟。 
	注意：较长的孵育时间可能会降低转染效率。</li>
	<li>将OptiMEM/DNA/PEI溶液加入含有700 mL DMEM低糖培养基（含10 mM HEPES和2% FBS）的1 L瓶中，充分混匀。 
	注意：本研究中，在共转染后，低糖DMEM显示出更优的AAV载体产量。添加HEPES有助于维持细胞处于更佳状态。通过缓慢旋转瓶身进行混匀，避免产生过多气泡。</li>
	<li>从培养箱中取出CF10，用真空泵将培养基抽入废液容器中。 
	注意：将CF10置于生物安全柜内的台面上，并缓慢抬起一端&#160;朝上放置，缓慢抽吸培养基，避免使细胞脱落。</li>
	<li>小心地将转染混合物加入CF10中，确保所有十层均被培养基覆盖。 
	注意：将25 mL转染混合物加入150 mm培养皿中。每日观察细胞，直至收获。将剩余的转染混合物缓慢倒入CF10中。极其小心地旋转CF10，确保每层体积均等。</li>
	<li>将CF10放回培养箱中孵育72-96小时。 
	注意：通过观察150 mm监测培养皿来判断收获AAV载体的时机。当细胞因充满AAV而变得极易脱落时，即可进行收获。</li>
</ol>
4. 收获AAV载体
<ol>
	<li>转染后3-4天，通过剧烈摇动CF10收集病毒。将培养基倒入250 mL锥形管中，在4 °C条件下以4000 × g离心20分钟。
	 
	注意：在本方案所用的AAV6血清型中，约80%的AAV主要与沉淀中的细胞物质结合，而约20%的AAV分泌至培养基中。其他AAV血清型的比例可能有所不同。</li>
	<li>使用0.45 µm滤器过滤澄清的上清液，并保存用于沉淀。</li>
	<li>用500 mL 1× DPBS缓冲液冲洗CF10，在4 °C条件下以4000 × g离心20分钟。</li>
	<li>使用真空系统和移液器弃去上清液。每CF10加入20 mL AAV裂解缓冲液，并在-80 °C保存直至纯化。
	 
	注意：将AAV裂解物转移至50 mL锥形管中，用于后续AAV提取。</li>
	<li>取出过滤后的上清液，加入40% PEG-2.5 M NaCl溶液，使PEG终浓度为8%，在4 °C旋转摇床上孵育至少3小时或过夜。
	 
	注意：对于100 mL上清液，加入25 mL 40% PEG-2.5 M NaCl溶液。</li>
	<li>在4 °C条件下以4000 × g离心30分钟，使病毒沉淀。
	 
	注意：将混合物转移至250 mL锥形管中进行离心。</li>
	<li>吸除上清液，每管沉淀加入5-10 mL AAV HEPES重悬缓冲液以重悬沉淀。转移至50 mL锥形管中进行后续纯化，或于-80 °C保存。</li>
</ol>
5. AAV 提取
<ol>
	<li>将病毒沉淀物置于37 °C水浴中，使用摇床振荡10-15分钟以解冻。 
	注意：涡旋AAV裂解液以确保完全融化。</li>
	<li>在-80 °C的100%乙醇浴中冷冻20-30分钟。 
	注意：也可使用盛有冷100%乙醇并周围放置干冰的烧杯完成冷冻步骤。</li>
	<li>重复冻融3-4次，必要时在各次之间进行涡旋。 
	注意：此循环可在冷冻步骤暂停。将AAV裂解液保存于-80 °C，直至进行后续操作。</li>
	<li>将AAV裂解液（来自步骤5.3）和重悬的AAV（来自步骤4.7）置于37 °C水浴中，使用摇床振荡10-15分钟，并进行涡旋。 
	注意：确保完全融化并充分混匀。</li>
	<li>向AAV裂解液和重悬的AAV中加入苯并核酸酶（Benzonase nuclease，250 units/µL），使其终浓度为50 units/mL。涡旋混匀溶液。</li>
	<li>在37 °C水浴中振荡孵育30分钟。 
	注意：将10%脱氧胆酸钠分装液提前放入水浴中，使其充分溶解、升温并混匀。</li>
	<li>加入10%脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.5%，并在37 °C下持续振荡孵育30分钟。 
	注意：使用脱氧胆酸钠以促进AAV从细胞中释放。</li>
	<li>将粗制AAV溶液分装至2 mL离心管中，在4 °C条件下以14,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至50 mL锥形管中。 
	注意：使用1 mL移液器转移上清液。弃去沉淀。</li>
	<li>加入等体积的氯仿，涡旋1-2分钟以提取AAV。 
	注意：溶液应变为不透明、白色、乳状。</li>
	<li>将乳状溶液转移至2 mL离心管中并均匀分配。在4 °C条件下以14,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>小心使用移液器吸取上层粉红色液体，并转移至新的50 mL锥形管中。 
	注意：避免扰动氯仿/蛋白层。</li>
	<li>使用移液器测量最终体积。根据粗制AAV-PEG-硫酸铵体积对照表（表2），混合相应体积的50% (NH4)2SO4 和40% PEG溶液。涡旋2分钟。</li>
	<li>将混合液转移至2 mL离心管中并均匀分配。在4 °C条件下以14,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>使用22 G针头和3 mL注射器收集底层液体。将AAV收集至50 mL锥形管中，并于4 °C保存，用于后续碘克沙醇梯度超速离心。</li>
</ol>
6. 利用碘克沙醇梯度超速离心法纯化 AAV
<ol>
	<li>根据所使用的超速离心管数量，在加载腺相关病毒（AAV）前新鲜配制碘克沙醇梯度（表3）。 
	注意：使用酚红以观察各层。</li>
	<li>使用连接16 G钝头长针头的10 mL注射器，将每种溶液缓慢地叠加至圆底聚丙烯超速离心快速封口管中。避免产生气泡。</li>
	<li>用22 G注射器将最多17 mL的AAV溶液小心地加在梯度顶部。使用AAV透析缓冲液将离心管加满。 
	注意：将AAV溶液沿超速离心管管壁逐滴加入，避免扰动梯度层。</li>
	<li>使用电动封管机密封超速离心管。 
	注意：送入超速离心机前，确保各管之间的重量差异在±0.2 g以内。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用Ti70转子以350,000 x g离心2小时&#160;。</li>
	<li>小心地将离心管从转子中取出，并放入超速离心管架中。 
	注意：确保梯度未被扰动。</li>
	<li>按以下步骤收集AAV组分：
	<ol>
		<li>将离心管固定在支架上保持稳定。</li>
		<li>用连接10 mL注射器的19 G针头，在40%-60%界面稍下方刺穿超速离心管。 
		注意：针头开口应朝上，面向40%梯度层。</li>
		<li>用16 G针头在管顶打一个小孔。</li>
		<li>每管收集最多5 mL。避免收集25%-40%界面处的蛋白质污染部分。</li>
		<li>对每根超速离心管重复上述操作。 
		注意：将收集的AAV组分转移至50 mL锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 第二轮碘克沙醇梯度超速离心
注意：此步骤为可选步骤。此步骤旨在降低空载 AAV 的比例，以获得更高纯度的完整 AAV 衣壳。
<ol>
	<li>用AAV透析缓冲液将AAV稀释&#62;1:1。 
	注意：从第一轮超速离心收集的AAV位于40%碘克沙醇层。应至少稀释50%，以便能够加样至30%碘克沙醇层上方。</li>
	<li>使用16 G钝头针将各溶液（表4）缓慢加入超速离心管中，并连接10 mL注射器。避免产生气泡。</li>
	<li>用22 G注射器将20 mL稀释后的AAV溶液小心地加至梯度液上方。用AAV透析缓冲液补满离心管。</li>
	<li>重复步骤6.4至6.7。</li>
</ol>
8. AAV 透析与浓缩
<ol>
	<li>使用新的18 G针头和10 mL注射器将AAV病毒转移至透析盒中。缓慢将病毒注入透析盒，并排出其中的空气。</li>
	<li>在装有AAV透析缓冲液的烧杯中加入搅拌子，并将其置于搅拌台上。</li>
	<li>将透析盒放入含有浮子的AAV透析缓冲液中，在4 °C下搅拌。更换AAV透析缓冲液2-3次。 
	注意：使用足量缓冲液以确保透析盒能够漂浮并完成缓冲液置换。用铝箔覆盖烧杯。</li>
	<li>使用连接18 G针头的10 mL注射器，从透析盒中收集病毒至离心过滤装置中。</li>
	<li>在4 °C下以4,000 × g 离心15-30分钟。 
	注意：用AAV透析缓冲液冲洗AAV 2-3次。浓缩AAV直至滤膜上方剩余体积约为200 µL。</li>
	<li>从过滤装置中收集浓缩后的AAV。用另外300 µL的AAV透析缓冲液冲洗滤膜，并将冲洗液转移至浓缩的AAV中。</li>
	<li>使用1 mL结核菌素鲁尔滑动注射器，通过0.22 µm注射式滤器过滤病毒。为尽量减少体积损失，可用10 mL注射器将空气通过滤器2-3次。</li>
	<li>将纯化的AAV病毒暂时储存在4 °C以进行滴定。 
	注意：应在1周内完成病毒滴定、分装并储存于-80 °C。</li>
</ol>
9. AAV 病毒滴度测定
注意：采用 TaqMan 定量聚合酶链式反应（qPCR）对纯化的 AAV 进行滴定。
<ol>
	<li>用DNase I处理AAV载体，37 °C孵育30分钟，然后95 °C孵育10分钟。 
	注意：以10 µL反应体系为例，包含2 µL AAV病毒样品、1 µL DNase、1 µL DNase缓冲液和6 µL H₂O2O 被使用。可在配备 PCR 管的 PCR 仪中进行。</li>
	<li>制备靶向 AAV 插入区域的引物组。 
	注意：靶点可以是 AAV 构建体中的启动子、转基因和报告基因。引物列于 表5.</li>
	<li>制备DNA质粒标准品（10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 pg/µL）以及阴性对照（H2O</li>
	<li>根据制造商说明书配制包含引物的qPCR预混液。</li>
	<li>将标准品和样品各设三个复孔，加入PCR板中。向标准品和样品中加入qPCR反应混合液。密封反应板，按照试剂盒说明书要求进行qPCR反应。 
	注意：反应条件取决于材料/试剂和仪器。可采用快速和常规的PCR循环。</li>
	<li>计算 AAV 病毒滴度。 
	注意：本方案中样品的浓度为原始样品的1/10稀释。</li>
	<li>将AAV病毒分装至1.5 mL离心管中，4 °C可保存一个月，长期保存需置于-80 °C。 
	注意：储存时避免冻融循环。当用于体内 体内 实验过程中，切勿将分装样品解冻超过两次。</li>
</ol>
10. AAV 的质量控制
注意：使用 SDS-PAGE 凝胶和市售染色试剂盒，通过 SDS-PAGE 银染法对 AAV 病毒的纯度进行表征。
<ol>
	<li>变性 3 × 109 AAV 病毒样品与 Laemmli 缓冲液混合。 
	注意：使用参考性 AAV 病毒作为对照。采用 AAV6-CMV-GFP 参考完整衣壳。</li>
	<li>将变性的 AAV 加样至 4%-20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶中，以 180 V 电压电泳 50 分钟。</li>
	<li>从电泳板上取下凝胶。根据生产商说明书，使用银染试剂盒对凝胶进行染色。</li>
	<li>检测AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。 
	注意：纯化的AAV病毒仅含有VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。若纯度不足，则凝胶电泳中可见其他蛋白条带。 
	注意：通过负染透射电子显微镜（TEM）对重组腺相关病毒（AAV）病毒颗粒进行观察，以评估其形态完整性和全/空颗粒比例。</li>
	<li>用镊子夹取电镜载网，放置于实验台面上，使载网的光面朝上。</li>
	<li>将5 µL AAV样品移液至载网上，使其自然蒸发干燥。 
	注意：如有需要，可稀释 AAV。1012 vg/mL 为平均滴度。网格干燥可能需要 30–60 分钟。</li>
	<li>用移液枪逐滴加入约 200 µL 的 H2O 点样到载网上。</li>
	<li>通过将层析滤纸垂直缓慢地放置在载网旁边，吸去多余的水分。</li>
	<li>用移液器将5 µL的2%醋酸铀溶液滴加到载网上。孵育5分钟，然后如上所述用滤纸吸去溶液。让载网自然干燥。</li>
	<li>在透射电子显微镜下观察AAV颗粒（放大50,000倍）。含有病毒基因组的病毒衣壳呈均一的白色六边形，而空衣壳则呈白色边缘、中心为深色的六边形。</li>
	<li>随机计数至少100个颗粒，以确定完整颗粒的大致百分比 与空的 AAV 颗粒</li>
</ol>

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol><li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li>
<li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li>
<li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+%28AAV%29+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).</li>
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<li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本文介绍了一种利用细胞工厂平台（CF10）大规模生产高滴度、高质量腺相关病毒（AAV）载体的技术先进方案，相较于传统的细胞培养皿方法具有显著改进。使用细胞工厂可简化大体积细胞培养过程，从而更高效地实现AAV病毒的生产1。此外，通过优化培养条件，特别是采用添加10 mM HEPES和2% FBS的低糖DMEM培养基，病毒产量显著提高，表明细胞环境在病毒产出中起着关键作用。
改进后的纯化方案通过整合来自细胞沉淀和培养基中的腺相关病毒（AAV），解决了现有许多方案中常见的病毒产量低和纯度不足的问题。氯仿萃取和水相两相分离步骤能有效去除大部分蛋白质污染物，而AAV仍可溶于硫酸铵相中。与传统的梯度超速离心法相比，采用聚乙二醇（PEG）/水相两相分离结合碘克沙醇梯度超速离心的方法，在AAV载体的产量和纯度方面均有提升，这可能归因于PEG/水相两相分离增强了初始分离效果，碘克沙醇梯度超速离心进一步提高了纯度，并减少了污染物的共纯化12。首先，在超速离心前引入PEG/水相两相分离，可显著改善AAV颗粒与细胞碎片及其他污染物的初步分离。聚乙二醇（PEG）是一种高分子量聚合物，当其与水溶液混合时会形成两个不同的相13。AAV载体倾向于选择性地分配到其中一个相中（通常为富含PEG的相），而许多污染物和杂质则分配到另一相中13。这种选择性分配在超速离心前即可有效浓缩AAV颗粒并去除大量杂质，从而提高产量，并减少进入超速离心步骤的污染物负荷13。其次，碘克沙醇梯度超速离心进一步提高了AAV载体的纯度。碘克沙醇是一种非离子型、等渗的梯度介质，相较于传统的氯化铯（CsCl）梯度，能够实现更温和且可控的分离过程14。在此梯度中，AAV颗粒迁移至与其浮力密度相对应的位置14。重要的是，该过程能够有效区分装载完整基因片段的AAV衣壳（含遗传载荷）与空衣壳（无遗传物质），这是决定载体质量的关键因素。碘克沙醇的等渗特性也比高渗试剂（如CsCl）更有利于保持AAV衣壳的完整性，从而可能获得更高产量的功能完整载体14。最后，传统的超速离心方法，尤其是使用CsCl梯度的方法，有时会共纯化出与AAV载体浮力密度相近的污染物15。通过将PEG分配作为预处理步骤，可在超速离心前大幅降低此类污染物的负荷13。污染物负荷的减少意味着碘克沙醇梯度可在纯化AAV载体时更高效、更具选择性地发挥作用，从而获得更高的纯度15。
通过银染色和透射电子显微镜对AAV载体的纯度和质量进行严格评估11观察到对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的三条主要条带，纯度超过90%，表明这些AAV载体适用于后续应用 体内 使用透射电子显微镜（TEM）分析确定完整与空壳衣壳的比例尤为关键，因为空壳衣壳比例过高可能导致基因递送效率降低以及潜在的免疫反应。11这一质量检查虽然至关重要，但会增加操作的复杂性，并可能需要额外的技术专长。
综上所述，该方案在腺相关病毒（AAV）载体的制备方面提供了重要的技术进步，尤其体现在可扩展性和纯度方面。然而，纯化过程的复杂性以及对专用设备和技术专长的需求，可能仍会限制其在某些研究环境中的应用。对这些技术的进一步优化和简化，有望使该方法在基因治疗研究领域中更具可及性并得到更广泛的应用。

腺相关病毒（AAV）载体已成为基因治疗研究中不可或缺的工具，因其在基因递送方面兼具高效性与安全性1。传统的实验室AAV制备方法在推动基因治疗的理解与应用方面发挥了关键作用2。然而，这些方法尽管具有基础性意义，仍存在某些局限性与挑战，尤其是在产量、时间效率以及所产生载体的质量方面，特别是完整颗粒与空颗粒的比例3。
腺相关病毒（AAV）生产的常规方法主要涉及对HEK293细胞的转染4该过程通常在细胞培养皿中进行，需要将含有目的基因的质粒以及辅助质粒共同转染至细胞中。&#160;和 AAV 衣壳质粒5,6转染后，细胞会产生AAV颗粒，随后对其进行收集和纯化5,6纯化过程通常包括超速离心，这是获得高纯度AAV载体的关键步骤7超速离心，特别是使用氯化铯（CsCl）或碘克沙醇梯度，是分离腺相关病毒（AAV）颗粒与细胞碎片及其他杂质的标准方法8此步骤对于获得所需纯度和浓度的腺相关病毒（AAV）载体至关重要，直接影响其在基因递送中的有效性8尽管超速离心法被广泛使用，但其存在一些缺点。例如，该方法获得的腺相关病毒（AAV）载体产量可能不稳定且通常较低，这在需要大量高滴度病毒载体时带来了重大挑战，尤其是在 体内 研究或大型动物模型9.
AAV 载体质量的另一个关键方面是完整颗粒与空颗粒的比例10。AAV 制剂通常包含这两类颗粒的混合物；然而，只有完整颗粒含有治疗性遗传物质。空颗粒比例过高会显著降低基因递送效率10。因此，评估并优化完整颗粒与空颗粒的比例是评价 AAV 载体功效的关键参数。传统方法虽然能够生产 AAV 载体，但往往难以稳定控制这一比例，导致载体效价出现波动10。
在此介绍一种独特的方法，该方法通过使用细胞工厂平台，无需在细胞培养皿中进行耗时费力的HEK293T细胞培养，结合聚乙二醇/水相两相分配与碘克沙醇梯度超速离心，简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程。通过SDS-PAGE及银染法验证AAV载体的纯度，并利用透射电子显微镜（TEM）测定完整颗粒与空壳颗粒的比例，结果符合高质量标准 体内 研究11.

<table><tbody><tr><td>293T/17 细胞</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324506-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Henke-Ject 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-211</td><td></td></tr><tr><td>10% 普流罗尼克 F68 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>24-040-032</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液</td><td>Biorad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>2% 醋酸铀溶液</td><td>电子显微科学公司</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20% 预制蛋白凝胶</td><td>biorad</td><td>4561094</td><td></td></tr><tr><td>40% PEG 溶液</td><td>Sigma</td><td>P1458-50ML</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 参考完整衣壳</td><td>查尔斯河实验室</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Sigma</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 细胞培养处理培养皿 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-003</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤单元</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;PES 注射式滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>透析盒，10 K 分子量截留</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI66810</td><td></td></tr><tr><td>一次性 PES 过滤单元 1 L 0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566506</td><td></td></tr><tr><td>一次性 PES 过滤单元 1 L 0.45 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566507</td><td></td></tr><tr><td>一次性 PES 过滤单元 500 mL 0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-569-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>10567022</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>甲酸/碳 300 目，铜</td><td>电子显微科学公司</td><td>FCF300-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Sigma</td><td>L2897-250G</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9732-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M9272-100G</td><td></td></tr><tr><td>NEB 稳定感受态细胞</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Nest Biofactory 10 孔板</td><td>MidSci</td><td>771302</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556-250ml</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-GFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-420-DJ</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC6</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-426</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6</td><td>Addgene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>PEI Max</td><td>Polysciences, Inc</td><td>49553-93-7</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-163</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.07242.0100</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 银染试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td><td></td></tr><tr><td>QuickSeal 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9144589</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>1162245000</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti 固定角钛转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot 底物</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>32209</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

临床前基因治疗研究，尤其是在啮齿类和大型动物模型中，需要高产量和高纯度的腺相关病毒（AAV）载体。传统实验室方法通常需大量使用细胞培养皿来培养HEK293T细胞，该过程既费力又存在诸多问题。本文介绍一种独特的自主研发方法，利用特定的细胞工厂（或称细胞叠层，CF10）平台简化了该流程。通过结合聚乙二醇/水相两相分配与碘克沙醇梯度超速离心，显著提高了所获得AAV载体的产量和纯度。AAV载体的纯度通过SDS-PAGE和银染进行验证，完整颗粒与空壳颗粒的比例则通过透射电子显微镜（TEM）测定。该方法提供了一个高效的细胞工厂平台，可实现高产量AAV载体的生产，并结合改进的纯化工艺，满足基因治疗研究对载体质量的要求。 体内 研究。

在本详细逐步操作方案中，展示了一种在大规模研究实验室环境中利用 CF10 制备高滴度、高质量 AAV 病毒的标准平台。与传统的细胞培养皿相比，CF10 为大量细胞的培养和 AAV 病毒的生产提供了更为便捷的方法（图 1）。通过测试多种培养条件，以确定处于最佳环境中的细胞是否能够促进病毒的产生。结果表明，添加 10 mM HEPES 和 2% FBS 的低糖 DMEM 培养基可实现最佳的 AAV 产量。
已测试多种纯化腺相关病毒（AAV）的方案。大多数方法的病毒产量较低，且AAV衣壳存在杂质。本文建立了一种改进的纯化方案，联合使用细胞沉淀和培养基中的AAV（图2）。我们发现，约80%的AAV存在于细胞内，另外20%的AAV由细胞分泌至培养基中。两部分AAV均经DNase处理以去除游离DNA。使用脱氧胆酸钠进一步促使AAV从细胞中释放。随后通过氯仿抽提和水相两相分配法提取AAV，这些步骤可去除大部分蛋白质杂质。AAV在硫酸铵相中保持可溶状态。
使用不连续的碘克沙醇梯度超速离心法去除剩余的污染物（图3A）。该梯度也有助于去除空的腺相关病毒衣壳，尤其是经过第二轮碘克沙醇梯度超速离心后效果更明显。
通过银染法测定AAV病毒的纯度。当获得对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的三条主要条带，且纯度大于90%时，AAV病毒适用于后续实验。 体内 使用（图3BAAV 完整衣壳与空衣壳的比例通过透射电子显微镜（TEM）进行测定（图3C）。只有包含转基因插入片段的完整衣壳才能在靶组织中实现转基因的表达。大量空衣壳还可能引发针对AAV衣壳的免疫反应。因此，在使用前，对每批制备并纯化的AAV病毒进行这些质量检测是必要的。
<img alt="AAV 生产流程图；在 293T 细胞中进行共转染以用于基因转移研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：通过 HEK293T 细胞三质粒共转染法生产 AAV 的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="病毒纯化流程图，包含细胞裂解、DNA消化、超速离心、透析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：腺相关病毒（AAV）纯化的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="AAV纯化示意图、蛋白质凝胶电泳及用于结构分析的电子显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV及AAV病毒纯度验证。 （A）碘克沙醇梯度分层及收集时针头的位置。（B）代表性凝胶图，用于评估衣壳成分与纯度。M：分子量标记物；R：参考用AAV6完整衣壳；S1：实验室自制AAV-DJ衣壳，经一轮超速离心；S2：实验室自制AAV-DJ衣壳，经两轮超速离心；S3：实验室自制AAV6衣壳。（C）AAV的电子显微镜图像。纯化后收集的病毒。含有病毒基因组的病毒衣壳呈均一的白色六边形，而空衣壳则表现为具有白色边缘但中心较暗的六边形。比例尺：100 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：AAV包装用PEI计算器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：AAV-PEG-硫酸盐原液体积表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：碘克沙醇梯度的制备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：第二轮碘克沙醇梯度的制备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：AAV滴定引物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件1：本研究中所用缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内 研究。

临床前基因治疗研究，特别是在啮齿类和大型动物模型中，需要制备高产量和高纯度的腺相关病毒（AAV）载体。

本项目旨在提供一种利用细胞工厂平台和优化培养条件进行高滴度、高纯度腺相关病毒载体大规模生产的新型方案。改进后的纯化工艺整合了来自细胞组分的腺相关病毒，采用聚乙二醇/水相两相分配法，随后进行碘克沙醇梯度离心，从而实现更高的产量和纯度。尽管近年来已有进展，学术研究实验室仍面临一些挑战——包括利用常规细胞优化可扩展的培养条件、降低空壳衣壳的比例，以及在病毒产量与纯度之间实现平衡。与其他技术相比，本方案通过细胞工厂实现了可扩展性，通过优化的培养条件提高了产量，并通过新型两步纯化工艺提升了腺相关病毒载体的纯度。该具有高腺相关病毒纯度的可扩展方案为学术研究实验室开展更大规模的临床前研究铺平了道路，有望因载体质量的提升而推动更安全、更有效的基因治疗发展。首先，将 HEK293T 细胞接种至含有添加 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基的 10 层细胞工厂中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养过夜。接着，将 350 毫升 Opti-MEM 转移至无菌的 500 毫升瓶中。将用于转染的质粒 DNA 加入瓶中，振荡混匀。现在向瓶中加入 15 毫升 PEI 溶液。剧烈振荡混合物 30 秒，以确保充分混匀。室温孵育 15 分钟后，将混合物转移至 1 升瓶中，然后加入 700 毫升低糖 DMEM。从培养箱中取出十层细胞工厂，用真空泵将培养基抽入废液容器中。小心地将 DNA 转染混合物用移液器加入细胞工厂中，然后将细胞工厂放回培养箱中培养 72 至 96 小时。培养三到四天后，将澄清的上清液通过0.45微米滤器过滤。向细胞工厂中加入500毫升DPBS进行冲洗。在4°C条件下，以4,000g离心20分钟。使用真空系统和抽吸移液管，移除并弃去上清液。向沉淀中加入 20 毫升 AAV 裂解缓冲液，并混匀以重悬沉淀。于 -80 °C 保存，直至纯化。向AAV溶液中加入40% PEG氯化钠溶液，使PEG的终浓度达到8%。将混合液置于4°C下低速旋转摇床中过夜。在4°C条件下以4,000g离心30分钟，使病毒沉淀。用移液器吸出上清液，然后向沉淀中加入5至10毫升AAV HEPES重悬缓冲液。将悬液转移至50毫升锥形管中，以继续后续纯化步骤。接着，将装有16号钝头针头的10毫升注射器固定好，并将制备好的碘克沙醇梯度液覆盖加入到圆底聚丙烯超速离心管中。使用22号针头，小心地将最多17毫升的AAV溶液加至梯度液上方。用AAV透析缓冲液补满离心管。使用电动封管机将离心管密封。将离心管置于钛转子中，在 4°C 下以 350,000g 离心两小时，然后转移至超速离心管架中。现在使用新的 18 号针头将 AAV 病毒转移至透析盒中。在将病毒注入透析盒后，去除盒内的空气。将磁力搅拌子放入含有 AAV 透析缓冲液的烧杯中，然后将烧杯置于搅拌器上，再将透析盒放入缓冲液中，并使用浮力浮标固定。用 10 毫升注射器将病毒从透析盒转移至离心过滤装置中。在 4 摄氏度条件下，以 4,000g 离心 15 至 30 分钟。从滤器单元中收集浓缩的 AAV，然后用 300 微升 AAV 透析缓冲液冲洗滤膜。最后，将冲洗液转移至浓缩的 AAV 中。分离得到的 AAV 病毒纯度超过 90%，适用于体内实验。

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