通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型

由于使用动物模型（特别是选择C57BL/6J背景的小鼠）治疗重症急性胰腺炎的死亡率较高，因此治疗该病较为困难。我们正在研究重症急性胰腺炎（SAP）的病理机制，以确定治疗靶点并开发新的治疗方法，同时为SAP研究提供多小鼠实验方法。

本研究发现，在损伤性胰腺炎中HMGB1基因表达显著升高，提示其与重症急性胰腺炎的炎症机制密切相关。本方案采用雨蛙素（Caerulein）诱导小鼠胆囊收缩并打破禁食状态，通过阻断消化液分泌导致胰腺组织损伤。结合脂多糖（LPS）注射，可在小鼠中成功诱导伴有器官功能衰竭的重症胰腺炎。该方法具有无创、操作简便、周期短且重复性高的优点。

[演示者] 首先，测量并记录实验小鼠的体重。进行腹腔注射雨蛙素（Caerulein）时，抓取并固定小鼠，使其腹部朝上，头部位置低于尾部。右手持注射器，将针头插入腹部白线左侧皮下皮肤处。向前推进针头约3至5毫米，以45度角刺入腹腔。保持针头静止，缓慢注入雨蛙素。拔出针头后，用无菌棉签轻轻按摩并按压注射部位，使药物充分扩散至腹腔内。注射后12小时，将小鼠置于实验箱网格中央，使其背向实验操作者。启动视频追踪软件，设置同时监测四个视野。在实时监控屏幕上标定箱内可移动实验对象的长度与宽度。记录小鼠15分钟内的活动情况。在五个循环周期中对胰腺损伤小鼠模型进行宏观指标检测，结果显示：胰腺损伤第5组小鼠在3分钟内的移动距离持续保持在较低水平，且每一轮循环中3分钟内的静止比例逐步上升。与其他实验组相比，胰腺损伤第5组的总移动距离最小，差异具有统计学意义。除对照组和胰腺损伤第1组外，其余各组均呈现负值体重增长，其中胰腺损伤第5组的变化最为显著。生存率分析显示，至第5天时，胰腺损伤第5组的死亡率达到80%，而其他组与对照组相比无显著差异。腹腔注射雨蛙素36小时后，对小鼠实施安乐死，并将其仰卧位固定于泡沫板上。行腹部正中切口，将小肠袢翻向右侧以暴露胰腺。分离十二指肠及幽门管。定位胰腺下方的小肠，沿肠管完全游离胰腺组织。使用无齿镊夹住脾脏，轻柔向上牵拉。锐性解剖至胰头部位，切断胰腺后方的韧带组织。随后切断胆管及血管。将胰腺组织从腹腔中取出，用吸水纸轻轻吸干表面水分。测量并记录胰腺组织的重量。制备石蜡切片后，将胰腺组织在二甲苯中脱蜡两次，每次5分钟。每张切片加入100微升蛋白酶K溶液，37摄氏度孵育20分钟。向组织中加入适量3%过氧化氢溶液，孵育20分钟，确保充分渗透。每张样本加50微升平衡缓冲液，覆盖整个组织区域，孵育10分钟。然后每份组织样本加56微升TdT孵育缓冲液，孵育1小时。用PBS洗涤组织切片，每次5分钟，共洗四次，随后加入100微升链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）反应液，孵育30分钟。DAB染色时，每张组织切片加50微升DAB溶液。将切片浸入苏木精染色液中染色3至5分钟，然后用纯水冲洗。依次使用新鲜无水乙醇脱水四次，每次5分钟。在白光显微镜下进行组织学检查。对小鼠胰腺组织进行TUNEL染色，结果显示胰腺损伤第5组细胞坏死增加，其灰度值和阳性坏死率显著高于其他组。通过蛋白质免疫印迹法检测细胞坏死标志物Caspase-3的表达水平，发现胰腺损伤第5组组织中该蛋白表达显著升高。对胰腺腺泡细胞悬液进行流式细胞术分析，使用Nexin 5 fit CPI标记，结果显示胰腺损伤第5组的细胞死亡率明显高于其他组，且差异具有统计学意义。