Name: 通过 Caerulein 和 Lipopolysaccharide 联合腹腔注射制备严重急性胰腺炎小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解利用雨蛙肽与脂多糖联合腹腔注射在C57BL/6J小鼠中建立重症急性胰腺炎模型的方法。该非侵入性技术可诱导器官衰竭并监测HMGB1炎症基因表达，为治疗靶点研究提供高重复性的实验平台。

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本研究由淮南市卫生健康与医学科学研究项目（编号：HNWJ2023005）；淮南市市级引导科技计划项目（编号：2023151）；安徽省大学生创新创业训练计划项目（编号：S202310361254）；第九批 &#34;50·科技之星&#34; 淮南市创新团队及安徽省重点临床专科建设项目。我们谨向安徽理工大学第一附属医院检验科致以诚挚感谢，感谢其提供相关检测数据。

本方案经安徽科技大学第一附属医院（中国淮南）伦理委员会审核批准（伦理编号：2023-KY-905-001）。研究遵循公共卫生服务政策或《实验动物照护与使用指南》中关于实验动物操作的规定。本研究采用6至8周龄、体重20–30 g的雄性C57BL/6J成年小鼠。小鼠在受控条件下（温度约21 °C，12小时昼夜循环）的动物实验室中饲养一周。实验期间小鼠可自由摄食和饮水。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 动物准备
<ol>
	<li>将84只健康的C57BL/6J小鼠分为六组，包括对照组、胰腺损伤（PI）I、PI II、PI III、PI IV和PI V组。</li>
	<li>在开始建模程序之前，用耳缘缺口标记每组小鼠，并使其禁食12小时。</li>
</ol>
2. 诱导药物稀释液的制备
<ol>
	<li>将胆囊收缩素（Caerulein，1 mg）溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并于 -20 °C 冷冻保存。</li>
	<li>在对实验小鼠进行腹腔注射药物前 1 小时，测量并记录其体重。</li>
	<li>根据所有小鼠的总重量，按 50 µg/kg 的比例计算并提取所需胆囊收缩素（Caerulein）的总质量。</li>
	<li>再次用 PBS 稀释所获得的胆囊收缩素（Caerulein）药物。 
	注意：PBS 稀释后的总体积应等于所有小鼠总重量数值的 5 倍。确保所使用的 LPS 和 PBS 均为无菌状态。所有配制步骤均应在生物安全柜中进行，以维持无菌条件。注射前将溶液储存于无菌、密封的容器中，防止污染。</li>
</ol>
3. 腹腔注射
注意：根据补充表1中所述方案，对每组小鼠进行腹腔注射以建立模型。另设10只小鼠分组处理，用于观察7天存活率。整个实验过程中，密切监测 humane endpoints（人道终点），以确保符合动物福利法规。当达到特定标准时，将实施安乐死，包括体重减轻30%-50%、严重嗜睡或运动能力显著受损。这些指标将作为人道干预的依据，以最大程度减少动物痛苦。
<ol>
	<li>抓握小鼠，使其腹部朝上，头部位置低于尾部，以防止注射时损伤内脏器官。</li>
	<li>使用75%酒精棉球对小鼠腹部进行消毒。</li>
	<li>右手持注射器（使用长度≤0.5/≥0.3的针头），将针头插入腹白线左侧的皮下组织。 
	注意：下次注射时更换至右侧。</li>
	<li>当针头到达皮下层后，向前推进约3-5 mm，然后以45°角将注射器针头插入腹腔。此时应能感觉到一定阻力。</li>
	<li>保持针头静止，缓慢注入药液。 
	注意：最大注射体积不得超过0.15 mL。</li>
	<li>注射完成后，拔出针头，并用无菌棉签轻轻按摩并按压注射部位，使药物充分扩散至小鼠腹腔内。</li>
	<li>使用新的注射器对下一只实验小鼠重复操作。</li>
</ol>
4. 开放旷场行为能力测试
注意：末次腹腔注射后 12 小时，进行旷场行为能力测试，以评估小鼠的总活动距离和静止时间。
<ol>
	<li>将四个相同的白色箱子直接放置在摄像头下方。</li>
	<li>使用视频线缆将摄像头连接到计算机。</li>
	<li>实验开始前，确保实验箱清洁且无任何气味残留。</li>
	<li>将动物置于网格中央，使其背对实验操作者，并让其适应环境 10 分钟。</li>
	<li>启动视频追踪软件，点击 文件 菜单以创建新实验。</li>
	<li>设置对四个同步视野区域的监测。</li>
	<li>在实时监控画面中标记实验对象在箱内活动范围的长度和宽度（30 cm × 30 cm）。</li>
	<li>完成设置后，开始视频监控与录制。</li>
	<li>记录小鼠的活动持续 15 分钟。</li>
	<li>测试结束后，将动物从网格中移出并放回笼中。使用含二氧化氯的消毒剂彻底清洁网格。</li>
</ol>
5. 收集和检测小鼠外周血
<ol>
	<li>处死小鼠（按照机构批准的方案进行）。
	<ol>
		<li>在腹腔注射后36小时对实验小鼠实施安乐死。安乐死前测量并记录小鼠的体重。</li>
		<li>用左手固定小鼠，右手持剪刀剪除小鼠一侧的胡须。</li>
		<li>轻压眼球周围皮肤，使眼球充血并突出。</li>
		<li>使用弯头镊夹住眼球并迅速摘除，同时将外周血收集至微量离心管中。 
		注意：使用两种不同的微量离心管，一种含有抗凝剂，另一种不含抗凝剂。</li>
		<li>同时，用左手的中指轻轻按压小鼠心脏区域，以加快心脏泵血速度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将不含抗凝剂的外周血在室温下静置30分钟。</li>
	<li>采用全自动生化分析仪，通过酶速率法和酶循环法测定血清淀粉酶（Amy）和脂肪酶（Lip）的浓度（按照试剂盒说明书操作）。</li>
	<li>使用商用化学发光成像仪，通过化学发光法检测血浆中降钙素原（PCT）等炎症指标水平（按照试剂盒说明书操作）。</li>
	<li>使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中HMGB-1、IL-6和TNF-α的水平（按照试剂盒说明书操作）。</li>
	<li>使用全自动血细胞分析仪分析经抗凝处理的外周血，评估相关参数。</li>
</ol>
6. 收集胰腺组织并制备石蜡切片
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位，并固定在泡沫板上。</li>
	<li>剃毛并消毒手术区域，沿腹部正中线做切口，将小肠管翻向右侧，充分暴露胰腺。</li>
	<li>分离十二指肠和幽门管，找到胰腺下方的小肠，沿肠管完全游离胰腺组织。</li>
	<li>使用无齿镊夹住脾脏，轻轻向上牵拉。 
	注意：切勿直接接触胰腺组织，整个解离过程中应避免施加过大力量。</li>
	<li>锐性解剖至胰头处的胰腺后方韧带组织，并切断胆管和血管。</li>
	<li>取出胰腺组织，用吸水纸轻轻吸干表面水分，称重并记录。</li>
	<li>将一半胰腺组织用4%多聚甲醛固定，另一半保存于-80 °C冰箱中。</li>
	<li>按以下步骤制备胰腺石蜡切片。
	<ol>
		<li>用75%酒精清洗固定后的胰腺组织，并修剪至约0.5 cm × 0.5 cm大小。</li>
		<li>将组织依次浸入70%乙醇20分钟、80%乙醇20分钟、90%乙醇15分钟。</li>
		<li>用95%乙醇处理两次，每次15分钟；再用100%乙醇处理两次，每次5分钟。</li>
		<li>用二甲苯溶液透明处理两次，时间分别为12分钟和5分钟。</li>
		<li>将透明后的组织在65 °C的蜡缸中浸泡1小时。</li>
		<li>将组织包埋于熔化的石蜡中，冷却后使用切片机获取胰腺石蜡切片（厚度：5 µm）。</li>
		<li>将所得石蜡切片置于45 °C水中展平，贴片后干燥（烘烤条件：40 °C，14–16小时）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将胰腺石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各30分钟，然后依次放入无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中各5分钟，再放入超纯水中5分钟。</li>
	<li>用苏木精染细胞核160秒，然后用流水缓慢冲洗。</li>
	<li>加入盐酸乙醇分化液处理5–10秒，然后迅速用流水冲洗。</li>
	<li>用无水乙醇处理切片5分钟。</li>
	<li>用伊红染色胞质30秒，然后用流水冲洗。</li>
	<li>将切片依次浸入75%、85%、95%和100%乙醇中各10秒，然后用二甲苯处理5分钟以脱水透明。</li>
	<li>最后用中性树胶封片，并在显微镜下观察。</li>
	<li>进行病理学评分并参照相关标准13。 
	注意：根据水肿、腺泡坏死、出血、出血灶和脂肪坏死以及炎症和血管周围炎症等指标判断胰腺炎的严重程度。评分时请参考已发表的实施指南13。</li>
</ol>
8. 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>将胰腺组织的石蜡包埋切片置于二甲苯中脱蜡，随后用梯度乙醇溶液进行水化。</li>
	<li>经30分钟膜破裂处理后，使用3% H2O2阻断内源性酶活性，作用20分钟。</li>
	<li>用5%牛血清在室温下封闭抗体30分钟，然后在4 °C条件下与1:1500稀释的兔抗HMGB1抗体孵育过夜。</li>
	<li>用PBS缓冲液冲洗切片，随后在37 °C下与相应二抗孵育30分钟。之后进行DAB显色、苏木精复染，并用中性树胶封片。</li>
</ol>
9. 胰腺切片中检测细胞凋亡的TUNEL法
<ol>
	<li>将胰腺石蜡切片置于二甲苯中脱蜡 5 分钟，重复两次，然后用梯度乙醇洗涤（100% 乙醇 5 分钟，90% 乙醇 2 分钟，70% 乙醇 2 分钟，蒸馏水 2 分钟）。</li>
	<li>用 PBS 洗去石蜡切片周围的多余液体。每个样本加入 100 µL 蛋白酶 K，确保组织完全覆盖。在 37 °C 下孵育 20 分钟。随后将样本浸入 PBS 中 3 次，每次 5 分钟。 
	注意：蛋白酶 K 溶液通过将原始蛋白酶 K（200 µg/mL）溶液按体积比 1:9 用 PBS 稀释制得，最终浓度为 20 µg/mL，不含 DNase。必须彻底清洗蛋白酶 K，以避免干扰后续标记反应。</li>
	<li>在组织上加入适量 3% H2O2（用 PBS 稀释），使其充分渗透组织，并孵育 20 分钟。用 PBS 冲洗组织 3 次，每次 5 分钟。 
	注意：石蜡切片应保持湿润。为灭活组织内源性过氧化物酶，孵育时间不宜过长，以防 3% H2O2 引起 DNA 断裂而导致假阳性。</li>
	<li>在待检测样本的整个区域覆盖 50 µL 平衡缓冲液，并孵育 10 分钟。</li>
	<li>尽可能去除平衡缓冲液。然后向每个组织样本加入 56 µL TdT 孵育缓冲液，在室温下孵育 1 小时。 
	注意：切片不得干燥，且应避免光照。TdT 孵育缓冲液按制造商说明配制（重组 TdT 酶 : 生物素-dUTP 标记混合物 : 平衡缓冲液 = 1 µL : 5 µL : 50 µL）。</li>
	<li>立即用 PBS 洗涤组织样本，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。用滤纸轻轻吸去样本周围多余的 PBS 溶液。</li>
	<li>向每个组织样本加入 100 µL 预先稀释的链霉亲和素-HRP 反应液（链霉亲和素-HRP : TBST = 1 : 300），进行链霉亲和素-HRP 反应。孵育 30 分钟。然后用 PBS 洗涤样本，每次 5 分钟，共 3 次。</li>
	<li>通过向每张石蜡切片加入 50 µL DAB 进行 DAB 染色。在显微镜下实时观察染色情况。出现阳性染色后，立即将切片放入湿盒中，并用纯水冲洗终止反应。</li>
	<li>将切片浸入苏木精染色液中 3–5 分钟，然后用纯水冲洗。</li>
	<li>在苏木精分化液中分化约 2 秒，随即用纯水立即冲洗。</li>
	<li>用苏木精返蓝液处理数秒以实现蓝化，并用纯水将切片彻底冲洗干净。 
	注意：核染色后进行显微镜检查。若染色过深，将切片返回分化液中处理；若染色过浅，则从核染色步骤重新开始染色过程。</li>
	<li>用新鲜无水乙醇脱水 4 次，每次 5 分钟。然后依次浸入丁醇 5 分钟、二甲苯 5 分钟。最后用新鲜二甲苯再处理 5 分钟。</li>
	<li>用中性树胶封片。自然晾干或在 60 °C 烤箱中干燥。</li>
	<li>使用白光显微镜进行组织学检查。凋亡细胞核呈棕色。</li>
	<li>计算相应的凋亡指数（AI）。 
	注意：以双盲法观察切片。在 TUNEL 阳性切片中，于高倍镜（400×）下随机选取 5 个阳性区域，每个区域至少计数 100 个腺泡细胞，以确定阳性细胞百分比。AI =（凋亡细胞总数 / 细胞总数）× 100%。</li>
</ol>
10. 流式细胞术
<ol>
	<li>获取新鲜的胰腺组织，用 PBS 灌注后彻底清洗。</li>
	<li>配制 0.5% IV 型胶原酶消化液，使用无菌组织剪充分消化胰腺组织。</li>
	<li>根据胰腺组织碎片的状态和液体浑浊程度，加入 5% BSA 消化终止液，并在低温下离心 5 分钟（约 300 × g，4 °C）。</li>
	<li>弃去上清液以终止消化。</li>
	<li>配制含有苯甲基磺酰氟（PMSF）和 2.5% 胎牛血清的细胞培养基，用于重悬胰腺细胞。</li>
	<li>将胰腺腺泡细胞悬液通过 200 目尼龙筛网过滤，以获得过滤后的细胞悬液。</li>
	<li>在低温下离心胰腺腺泡细胞悬液（离心条件同步骤 3 所述）。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>用预冷的 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>通过离心重悬，将细胞轻轻重悬于预冷的 1× 结合缓冲液中。</li>
	<li>调整细胞浓度后，按照试剂盒说明书用 Annexin V-FITC/PI 对胰腺腺泡细胞进行标记。</li>
	<li>在 1 小时内使用流式细胞术检测胰腺腺泡细胞的凋亡情况。</li>
</ol>
11. Caspase-3 和 HMGB-1 的 Western 印迹检测
<ol>
	<li>提取胰腺蛋白。
	<ol>
		<li>取50 mg胰腺组织，剪成小碎片。</li>
		<li>加入1 mL RIPA裂解缓冲液（含PMSF和磷酸化蛋白酶抑制剂）。</li>
		<li>使用电动研磨器在冰上匀浆胰腺组织5分钟。</li>
		<li>将匀浆后的组织在冰上轻轻振荡孵育2小时。</li>
		<li>在4 °C、4,500 × g 条件下离心10分钟。</li>
		<li>收集上清液，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行蛋白定量。
	<ol>
		<li>将一定体积的BSA标准品（25 mg/mL）稀释至0.5 mg/mL浓度。</li>
		<li>通过将50体积的BCA溶液A与1体积的BCA溶液B混合，配制适量的BCA工作液，确保充分且均匀混合。</li>
		<li>按0、1、2、4、8、12、16和20 µL的顺序，将BSA标准品加入96孔板的标准品孔中，用蒸馏水补足各孔体积至20 µL。</li>
		<li>在样品孔中加入2 µL样品，随后依次加入18 µL蒸馏水进行稀释（1:9）。</li>
		<li>每孔加入200 µL BCA工作液，于37 °C静置约20–30分钟。</li>
		<li>在562 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。</li>
		<li>加入适量RIPA裂解液和稀释缓冲液，将样品稀释至蛋白浓度达到5–10 µg/µL，视为合适。</li>
		<li>蛋白变性（100 °C；10分钟）后，将样品于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行Western blot实验。
	<ol>
		<li>准备SDS-PAGE。
		<ol>
			<li>安装制胶模具，并检查其密封性。</li>
			<li>向10%分离胶中加入TEMED，混匀。</li>
			<li>将混合液注入模具，约占总体积的三分之二，避免产生气泡。</li>
			<li>向模具中加入异丙醇，压胶约40分钟。</li>
			<li>采用相同程序配制5%浓缩胶。</li>
			<li>倒出异丙醇，并立即加入浓缩胶。</li>
			<li>垂直插入梳子，直至胶完全聚合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行电泳操作。
		<ol>
			<li>按预期实验对照顺序的逆序，将待测样品加入SDS-PAGE胶的加样孔中。</li>
			<li>同时加入Protein Marker，以确定目标蛋白和内参蛋白的位置。</li>
			<li>加样完成后，将样品放入电泳槽中。</li>
			<li>初始以80 V运行30分钟，随后以100 V运行60分钟，使蛋白充分分离。 
			注：应注意溴酚蓝的位置，避免电泳过度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行蛋白转膜。
		<ol>
			<li>在PVDF膜的右上角剪角作为标记。</li>
			<li>将PVDF膜置于甲醇溶液中5–10秒以活化。</li>
			<li>将PVDF膜浸泡于电泳缓冲液中约15分钟。</li>
			<li>电泳结束后小心取出凝胶，修剪多余部分，确保整个过程中凝胶保持湿润。</li>
			<li>按以下顺序组装转膜夹：负极板 → 海绵 → 三层滤纸 → 凝胶 → PVDF膜 → 三层滤纸 → 海绵 → 正极板。 
			注：确保凝胶与PVDF膜之间无气泡。</li>
			<li>将组装好的转膜夹放入湿转槽中（黑面对黑面），周围放置冰块。</li>
			<li>接通电源，以400 mA电流转膜100分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行PVDF膜封闭及一抗、二抗孵育。
		<ol>
			<li>转膜完成后轻轻取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复3–5次。</li>
			<li>将PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2小时。</li>
			<li>取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复4次。</li>
			<li>将PVDF膜与稀释后的一抗共同置于4 °C冰箱中，轻轻振荡孵育过夜。</li>
			<li>次日取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复4次。</li>
			<li>将PVDF膜在HRP标记的二抗稀释液中孵育约2小时。</li>
			<li>用TBST漂洗PVDF膜10分钟，重复4次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>曝光并分析结果。
		<ol>
			<li>将配制好的ECL溶液均匀滴加至膜上。</li>
			<li>在暗室中使用曝光仪曝光约2–3分钟，随后保存图像。</li>
			<li>使用ImageJ软件进行分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Inducing Pancreatic Injury in Mice Through Intraperitoneal Drug Injection

<ol><li>Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+severe+acute+pancreatitis%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Management of severe acute pancreatitis: An update.</a> Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).</li>
<li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF11+ameliorates+severe+acute+pancreatitis+through+modulating+macrophage+M1+and+M2+polarization+by+targeting+the+TGFbetaR1%2FSMAD-2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway.</a> Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).</li>
<li>Zhang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+method+of+an+ideal+model+of+multiple+organ+injury+of+rat+with+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).</li>
<li>Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+regenerating+protein+%28reg+I%29+and+reg+I+receptor+mRNA+are+upregulated+in+rat+pancreas+after+induction+of+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).</li>
<li>Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+molecular+weight+heparin+on+pancreatic+micro-circulation+in+severe+acute+pancreatitis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model.</a> Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).</li>
<li>Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemorrhagic+pancreatitis+%28massive+necrosis%29+with+fat+necrosis+induced+in+mice+by+DL-ethionine+fed+with+a+choline-deficient+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet.</a> Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+XIAP+reduces+the+severity+of+acute+pancreatitis+via+regulation+of+cell+death+and+nuclear+factor-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity.</a> Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+Protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPP4+inhibitor+attenuates+severe+acute+pancreatitis-associated+intestinal+inflammation+via+Nrf2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+protects+severe+acute+pancreatitis+by+inhibiting+HMGB-1+active+secretion+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages.</a> Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sitagliptin+activates+the+p62-Keap1-Nrf2+signalling+pathway+to+alleviate+oxidative+stress+and+excessive+autophagy+in+severe+acute+pancreatitis-related+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Schmidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+model+of+acute+pancreatitis+for+evaluating+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.</a> Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+paracentesis+drainage+attenuates+severe+acute+pancreatitis+by+enhancing+cell+apoptosis+via+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway.</a> Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+background+strain+is+essential+for+metabolic+research%3A+C57BL%2F6+and+the+international+knockout+mouse+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium.</a> Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+CHRM3+activation+causes+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice.</a> JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).</li>
<li>Sah, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerulein-induced+chronic+pancreatitis+does+not+require+intra-acinar+activation+of+trypsinogen+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice.</a> Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+AMPK+ameliorates+acute+severe+pancreatitis+by+suppressing+pancreatic+acinar+cell+necroptosis+in+obese+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models.</a> Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).</li>
<li>Jin, C., Li, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+severe+acute+pancreatitis+model+in+mice+induced+by+combined+Rain+Frog+Peptide+and+lipopolysaccharide+and+exploration+of+its+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Exp+Bio+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism.</a> Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Roy, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Ubap2+deletion+regulates+glucose+tolerance%2C+inflammation%2C+and+protection+from+Caerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis.</a> Cancer Lett. 578, 216455(2023).</li>
<li>Chen, R., Kang, R., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+HMGB1+secretion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mechanism of HMGB1 secretion and release.</a> Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).</li>
<li>Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+mechanisms+of+major+DAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Release mechanisms of major DAMPs.</a> Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+circulating+histones+in+predicting+persistent+organ+failure+and+mortality+in+patients+with+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis.</a> Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).</li>
<li>Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+high+mobility+Group+Box+1+and+Interleukin-6+levels+in+acute+pancreatitis%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis.</a> J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

目前，尚缺乏有效手段来改善重症急性胰腺炎患者的高死亡率问题。研究药物在增强免疫稳定机制方面的有效性至关重要。建立理想的重症急性胰腺炎动物模型迫在眉睫。C57BL/6J遗传背景的小鼠广泛应用于生物医学研究，包括重症急性胰腺炎（SAP）病理生理学的研究。由于B6J小鼠经历了超过70年的遗传分化，导致多个外显子发生自发性缺失15，从而降低了对蓝斑素（Caerulein）诱导的胰腺损伤的敏感性16。此外，现有的急性胰腺炎动物模型存在诸如手术创伤或仅适用于较大动物等局限性，限制了这些模型在科学研究中的应用。因此，利用这一特定基因品系建立稳定、高效且便捷的动物模型具有重要价值。
胆囊收缩素类似物Caerulein通过在小鼠禁食并积聚足够量消化液后短时间内高频注射，导致胰腺消化液和酶分泌发生相对性阻塞，从而诱发胰腺组织损伤17脂多糖（LPS）是细菌细胞壁中的主要成分，可在小鼠中引发多器官功能障碍综合征（MODS）和全身性炎症反应综合征（SIRS）。18一项先前的研究表明，通过在不同频率下注射胆囊收缩素（Caerulein）并联合使用不同剂量的LPS给药 通过 腹腔注射诱导出与人类重症急性胰腺炎相似的病理改变19,20本研究采用一种非侵入性方法，通过联合不同频率的雪貂素（Caerulein）注射与不同剂量腹腔内注射脂多糖（LPS）的小鼠模型，诱导不同程度的胰腺损伤。在方案建立过程中，确保药物经腹膜均匀吸收至关重要。为满足该要求，必须严格遵循腹腔注射操作步骤，以精确控制每次给药过程。每次注射药物后，使用无菌棉签对注射部位进行轻柔揉搓并施加适当压力，对于促进药物在腹腔内的均匀分布具有重要作用。此外，将针尖准确、精准地置入腹腔，并使针头指向上腹部中央区域，极为关键。操作人员应事先接受培训，以准确感知针头进入腹腔时阻力消失的感觉。使用微量定量输注泵替代手动操作可能有助于提高药物注射质量；遗憾的是，本研究未采用此方法。尽管如此，通过采用不同的注射方案，我们在由雪貂素联合LPS注射所诱导的相同技术条件下，成功诱导出不同程度的胰腺损伤，并有效观察到不同频率与剂量所致胰腺损伤的差异。该结果为今后利用雪貂素建立非侵入性重症急性胰腺炎动物模型提供了有价值的参考依据。
Caerulein 与 LPS 联用导致血清淀粉酶和脂肪酶水平显著升高、胰腺重量增加，并出现组织学改变，包括大量炎性细胞浸润、胰腺腺泡细胞水肿、坏死和出血，苏木精-伊红（HE）染色结果证实了上述变化。此外，随着 LPS 剂量的增加，胰腺的病理改变更加明显。然而值得注意的是，PI IV 组与 PI V 组之间的胰腺病理评分无明显差异，而 PI III 组的胰腺组织细胞坏死程度较 PI IV 组更为显著。该观察结果提示，Caerulein 的给药频率可能是导致胰腺损伤的主要因素，而 LPS 则加剧其进展，引发全身性炎症损伤18,21。HMGB-1 是一种功能依赖其定位的蛋白质22。细胞外 HMGB-1 作为一种参与炎症预警信号的蛋白，与急性胰腺炎的严重程度密切相关23,24,25。本研究中，所有实验组小鼠的血清 HMGB-1 水平均显著高于对照组，其中 PI V 组升高最为显著。免疫组织化学和蛋白质电泳实验也证实了 HMGB-1 在胰腺组织中的高表达。这一重要蛋白可能成为抑制重症急性胰腺炎中炎症风暴的治疗靶点。
总之，建立一种非侵入性、操作简便的小鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型至关重要。在本实验方案中，采用雨蛙素（Caerulein）联合脂多糖（LPS）诱导胰腺损伤的方法可靠且有效。通过连续10天、每天腹腔注射50 µg/kg剂量的雨蛙素，随后单次腹腔注射15 mg/kg的LPS，可成功构建稳定、可靠、成本低且高效的SAP动物模型。

重症急性胰腺炎具有起病急骤、进展迅速和在消化系统疾病中病死率高的特点1。其高死亡率一直是临床研究的重点。由于临床病情变化难以预测、疾病表现异质性强以及人体标本获取有限，建立动物模型在疾病研究中变得愈发重要。
将牛磺胆酸钠逆行注入胆总管是建立大鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型的常用方法2。该建模技术通过模拟胰胆管梗阻并诱导胆汁与胰液反流，能够高效复制SAP动物模型。然而需注意，侵入性手术本身会对动物模型产生一定影响。此外，该方法仅适用于大鼠和犬等体型较大的实验动物。其他常用的建模技术还包括十二指肠插管法3、直接十二指肠穿刺法4以及胆总管-胰管直接穿刺法5。
腹腔注射和饮食诱导建模方法具有非侵入性优势，可适用于任何体型的动物。通过喂食胆碱缺乏-乙硫氨酸（CDE）诱导的重症急性胰腺炎小鼠模型6 会引发一些并发症，例如难以控制的高血糖和低钙血症，因此不适合用于评估新的诊断和治疗方法。另一方面，腹腔注射Caerulein联合L-arginine7 是目前在小鼠中诱导急性胰腺炎最常用的方法。具体而言，重复腹腔注射铃蟾肽（Caerulein）——一种胆囊收缩素类似物——为研究该破坏性疾病的多个方面（包括发病机制、炎症反应及再生过程）提供了极为合适的手段。由于铃蟾肽在结构上与胆囊收缩素（CCK）高度相似，可有效刺激胆囊收缩和胰酶分泌，导致酶分泌失衡，进而引发自身消化性损伤8脂多糖（LPS）作为一种广泛存在且被深入研究的病原体相关分子模式分子，可与雨蛙素（Caerulein）联合使用 通过 腹腔注射以建立有效的SAP小鼠模型。该组合可迅速触发并释放大量炎性细胞因子，导致显著的局部和全身炎症反应。已有多个研究报道通过腹腔注射雨蛙素（Caerulein）联合脂多糖（LPS）诱导小鼠SAP模型。这可能是因为腹腔注射雨蛙素可引起小鼠胰腺水肿和出血，而添加LPS可立即诱导胰腺坏死，并加剧全身炎症反应、脓毒症甚至器官衰竭。目前，腹腔注射雨蛙素的剂量与频率尚不统一，附加LPS的剂量也存在差异，因此在小鼠SAP模型中实现一致性仍具挑战性9,10,11,12因此，建立标准化的操作流程以获得理想模型十分必要。本文介绍了一种小鼠腹腔注射的操作方案，并探讨了脂多糖（LPS）的最佳注射频率及附加剂量。

<table><tbody><tr><td>20&amp;times; 柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>G1202-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>淀粉酶</td><td>迈瑞，中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>&amp;nbsp;G1511</td><td>&amp;nbsp; 1:20 稀释</td></tr><tr><td>兔源抗HMGB1多克隆抗体</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>GB11103</td><td>&amp;nbsp; 1:1800 稀释</td></tr><tr><td>BCA蛋白定量检测试剂盒</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G2026-200T</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 流式细胞仪</td><td>BD生命科学公司，美国加利福尼亚州圣何塞市，邮编95131</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>GC305010-100g</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>中国常州 Cavion 实验动物有限公司</td><td></td><td>许可证编号 SCXY (苏) 2011&amp;ndash;0003</td></tr><tr><td>Ceruletide</td><td>&amp;nbsp;美国新泽西州 MCE</td><td>17650-98-5&amp;nbsp;</td><td>50 &amp;micro;g/kg</td></tr><tr><td>化学发光成像仪</td><td>Cytiva 公司；美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸抗原修复液（干粉，pH 6.0）</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1201-5 L</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>&amp;nbsp;GC305014</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>DAB（SA-HRP）Tunel细胞凋亡检测试剂盒</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1507-100 T</td><td></td></tr><tr><td>Dimension EXL 配备 LM 一体化化学分析系统</td><td>西门子医疗诊断公司，美国布鲁克菲尔德</td><td>YZB/USA 8311-2014</td><td></td></tr><tr><td>ECL 显影液</td><td>中国武汉，Servicebio 技术有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊红染料（醇溶性）</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1001-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>&amp;nbsp;Noldus，荷兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的山羊抗兔IgG</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>GB22303</td><td>&amp;nbsp; 1:50 稀释</td></tr><tr><td>全自动血细胞分析仪</td><td>Zybio公司 中国</td><td>&amp;nbsp;Zybio-Z3 CRP</td><td></td></tr><tr><td>GapDH</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>GB11103</td><td>&amp;nbsp; 1:1500 稀释</td></tr><tr><td>苏木精返蓝液</td><td>中国武汉，Servicebio 技术有限公司</td><td>G1040-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>苏木精分化液</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1039-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染料</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1004-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>HMGB-1 ELISA试剂盒</td><td>中国nj jc生物有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>KZ-III-F；IC111150 100222</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗兔IgG</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>GB23303</td><td>&amp;nbsp; 1:1500 稀释</td></tr><tr><td>IL-6 ELISA试剂盒</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>GEM0001</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酶&amp;nbsp;</td><td>迈瑞，中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂多糖&amp;nbsp;</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>GC205009</td><td>15 mg/kg</td></tr><tr><td>低温高速离心机</td><td>长沙平凡仪器&amp;安普&仪器有限公司，中国</td><td>TGL-20M</td><td></td></tr><tr><td>膜破裂液</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>中国杭州金华东创仪器有限公司</td><td>CR-601ST</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td></td><td>200目</td></tr><tr><td>一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（DAB染色法）</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G1507-100T</td><td></td></tr><tr><td>石蜡组织包埋机</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD；中国江苏常州</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>病理组织干燥装置</td><td>PRECISION MEDICINE INSTRUMENTS CO.,LTD；中国常州</td><td>PHY-III</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G4202-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>G2008-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>正荧光显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社，日本东京</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>降钙素原</td><td>迈瑞，中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>美国默克密理博公司</td><td></td><td>0.22 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>中国武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>G2002-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>碧云天生物技术，中国</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α&amp;alpha;ELISA试剂盒</td><td>中国武汉服务生物技术有限公司</td><td>GEM0004</td><td></td></tr><tr><td>超声波水浴</td><td>中国东莞科桥超声波设备有限公司；中国</td><td>KQ-200KDE</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质印迹法</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western blot 成像系统</td><td>全球生命科学知识产权控股有限责任公司，日本</td><td>Amersham ImageQuant 800&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>漩涡混合器</td><td>SCILOGEX；美国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

重症急性胰腺炎（SAP）死亡率较高，其治疗面临重大临床挑战。利用动物模型研究SAP相关的病理变化，有助于发现潜在的治疗靶点并探索新的治疗方法。以往的研究主要通过逆行胆管注射牛磺胆酸钠诱导胰腺损伤，但手术操作本身对动物模型质量的影响尚不明确。本研究采用不同频率的腹腔注射雨蛙素（Caerulein）联合不同剂量的脂多糖（LPS）在C57BL/6J小鼠中诱导胰腺损伤，并比较了五种腹腔注射方案下损伤程度的差异。针对小鼠急性胰腺炎的建模，本文提出一种可在5天内导致高达80%死亡率的腹腔注射方案：小鼠每日接受10次腹腔注射雨蛙素（50 µg/kg），末次注射雨蛙素后1小时再给予LPS（15 mg/kg）注射。通过调节药物注射的频率和剂量，可有效调控胰腺损伤的严重程度。该模型具有良好的可控性，复制周期短，可由单名研究人员独立完成，无需昂贵设备。该方法能够便捷、准确地模拟人类SAP的关键疾病特征，且具有高度可重复性。

实验小鼠模型构建过程如图所示 图1注射完成后12小时，使用旷场视频记录仪监测各实验组小鼠在5个周期内的移动距离和静止持续时间。图2A）。在5个循环期间，PI V组小鼠在3分钟内的运动距离保持在较低水平，而3分钟内的不动比例在后续每个循环中逐渐增加（图2B，C）。此外，对不同实验组小鼠在5个周期内的总移动距离进行了统计学分析。PI V组的总移动距离最小，与其他实验组相比差异具有统计学意义（p &lt; 0.001) (图 2D，E）。除对照组和PI I组外，其他实验组小鼠的D值体重均呈现负增长。其中，PI V组的体重变化最为显著，与其他实验组相比，其体重变化差异具有统计学意义（图2F）。在额外评估了每组10只小鼠的存活率后，结果显示，PI V组小鼠在第5天的死亡率达到80%th 天。然而，其余四个实验组与对照组小鼠之间的死亡率差异无统计学意义（图2G).
使用高倍显微镜观察到，PI IV组和PI V组小鼠出现明显的细胞肿胀、坏死以及炎性细胞浸润（图3A，B）。根据补充表2中提供的评分标准，对不同实验组小鼠的胰腺病理变化进行评估，结果显示各实验组小鼠的胰腺病理评分与对照组相比存在显著差异（p &lt; 0.001）（图3C；补充图1）。此外，与对照组相比，PI II至PI V实验组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平显著升高，差异具有统计学意义。有趣的是，PI I组小鼠与对照组之间未观察到具有统计学意义的差异（图3D，E）。采用ELISA方法检测小鼠血清中炎症标志物14（包括TNF-α和IL-6）的水平。结果表明，PI V组小鼠的TNF-α和IL-6水平显著高于其他实验组，且差异具有统计学意义（图3F，G）。与对照组相比，四个实验组小鼠的PCT水平均有所升高，但仅PI V组的差异具有统计学意义（p &lt; 0.05）（图3H）。
不同实验组小鼠胰腺组织的细胞凋亡状态 
通过对各组小鼠胰腺组织进行TUNEL染色，观察不同实验组小鼠胰腺组织中的细胞坏死情况（图4A）。采用Image J软件对胰腺组织切片单位面积的灰度值（OD）及细胞坏死阳性率进行半定量分析。结果显示，与其它实验组相比，PI V组小鼠胰腺组织中细胞坏死水平显著升高，差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）（图4B、C）。通过蛋白质免疫印迹实验检测了不同实验组小鼠胰腺组织中细胞坏死标志物——半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）的表达水平（图4D）。Caspase-3表达量的定量分析显示，PI V组小鼠胰腺组织中caspase-3蛋白的表达水平显著上调，差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）。蛋白表达水平经内参GapDH标准化后进行量化分析（图4E）。此外，将新鲜的胰腺腺泡细胞悬液用Annexin V-FITC/PI标记后进行流式细胞术分析。结果发现，与其他实验组小鼠相比，PI V组细胞死亡阳性率显著升高，差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）（图4F、G）。
外周血清中HMGB-1的含量及胰腺组织中HMGB-1的表达水平 
为探讨HMGB-1蛋白与胰腺损伤之间的关系，对各实验组小鼠的胰腺组织进行了免疫组织化学染色及定量分析。实验组与对照组之间差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）（图5A、B）。采用ELISA法检测不同实验组小鼠血清中HMGB-1的水平，结果显示，与对照组相比，各实验组小鼠血清中HMGB-1水平均显著升高，其中PI V组水平最高，差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）（图5C）。此外，Western blot分析检测到各实验组小鼠胰腺组织中HMGB-1蛋白表达均升高，与对照组相比差异具有统计学意义（p &lt; 0.001）（图5D、E）。
<img alt="胰腺研究时间线示意图；注射、监测、安乐死；存活率观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验流程图。 第2天和第3天：腹腔注射。第4天：末次腹腔注射后12小时开始旷场实验。第5天：腹腔注射后36小时实施安乐死。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胆囊收缩素处理效果、统计图表 A-G、运动分析、存活率、实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：PI 小鼠模型的宏观变化。（A）显示小鼠的实时运动轨迹图。（B）不同实验组小鼠在各监测时段内的总运动距离。（C）不同实验组小鼠在各监测时段内的静止时间百分比。（D,E）分析了不同实验组小鼠在15分钟内的总运动距离和静止时间百分比。（F）显示建模前后小鼠体重的差值（D值）。（G）腹腔注射后连续7天观察每组10只小鼠的存活情况。数据以均值 ± 标准误表示，n = 4。“ns”表示无显著性差异，*P &lt; 0.05，****P &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用胆囊收缩素和脂多糖处理的胰腺组织病理学；显示病理评分的数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：不同实验组小鼠胰腺炎的病理变化。 （A）不同实验组小鼠胰腺组织的苏木精-伊红（H&amp;E）染色组织切片（石蜡包埋胰腺组织切片经苏木精和伊红染色，放大倍数分别为100倍，比例尺为200 µm，以及400倍，比例尺为50 µm。黄色长箭头指示胰岛；红色长箭头指示腺泡细胞；棕色长箭头指示血管；蓝色长箭头指示导管）。 （B）小鼠胰腺重量与体重比值的计算。 （C）小鼠胰腺的病理评分。 （D,E）小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平的检测。 （F-G）ELISA法测定小鼠血清中TNF-α和IL-6水平。 （H）PCT水平的评估。数据以均值±标准误表示，n = 4。“ns”表示无显著性差异，*P &lt; 0.05，****P &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TUNEL 检测结果、Western blot、细胞凋亡实验分析中的流式细胞术数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：小鼠胰腺组织的细胞凋亡。（A）TUNEL 染色的代表性图像来自小鼠胰腺石蜡切片及放大区域图像。（400×，比例尺 50 µm，棕黄色为阳性细胞）。（B,C）小鼠胰腺组织 TUNEL 染色切片单位面积灰度值及阳性染色死亡细胞百分比的定量分析。（D）通过 Western blot 检测胰腺组织中 Caspase-3 的表达水平。（E）胰腺组织中 Caspase-3 表达的定量分析。（F）采用流式细胞术评估小鼠胰腺腺泡细胞死亡程度。（G）小鼠胰腺腺泡细胞晚期死亡细胞的计数。数据以均值 ± 标准误表示，n = 4。“ns”表示无显著性差异，*P &lt; 0.05，****P &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HMGB1 表达的免疫组织化学和蛋白质印迹；caurelin 和 LPS 处理的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：小鼠胰腺组织中 HMGB-1 的表达。（A）胰腺切片 HMGB-1 免疫组织化学染色的代表性图像及放大图像（×400，比例尺 50 µm）。棕黄色表示阳性细胞（n = 4）。（B）胰腺组织切片中 HMGB-1 阳性细胞所占百分比（n = 24）。（C）小鼠血清中 HMGB-1 的水平（n = 4）。（D,E）通过蛋白质印迹检测胰腺组织中 HMGB-1 的表达水平，并获得定量结果（n = 4）。数据以均值 ± 标准误表示，“ns”表示无显著性差异，*P &lt; 0.05，****P &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：PI V组小鼠模型的多器官损伤。（A）通过H&amp;E染色分析CON组和PI V组小鼠胰腺、肺、肝和肾组织的组织学变化的代表性图像（200倍放大，比例尺为50 µm）。黑色箭头指示与腺泡细胞坏死相关的病理改变。黄色箭头指示以肺泡间质出血和水肿为特征的病理变化。绿色箭头指示肝细胞水肿和坏死。红色箭头标记与肾小球出血相关的病理改变。（B）对来自CON组和PI V组小鼠的胰腺、肺、肝和肾组织进行组织学评分计算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/supplementary%20FIG%203.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表1：腹腔注射方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/Supplementary%20Table%201_Updated.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表2：胰腺炎严重程度的病理评分标准。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

腹腔内给药是一种安全有效的非侵入性方法，可用于诱导胰腺损伤。本研究比较了五种不同的小鼠腹腔注射方案，以诱导不同程度的胰腺损伤，并建立重度胰腺损伤模型，用于探讨重症急性胰腺炎（SAP）的病理变化及治疗策略。

重症急性胰腺炎（SAP）死亡率较高，其治疗构成重大的临床挑战。研究其病理学……

由于使用动物模型（特别是选择C57BL/6J背景的小鼠）治疗重症急性胰腺炎的死亡率较高，因此治疗该病较为困难。我们正在研究重症急性胰腺炎（SAP）的病理机制，以确定治疗靶点并开发新的治疗方法，同时为SAP研究提供多小鼠实验方法。本研究发现，在损伤性胰腺炎中HMGB1基因表达显著升高，提示其与重症急性胰腺炎的炎症机制密切相关。本方案采用雨蛙素（Caerulein）诱导小鼠胆囊收缩并打破禁食状态，通过阻断消化液分泌导致胰腺组织损伤。结合脂多糖（LPS）注射，可在小鼠中成功诱导伴有器官功能衰竭的重症胰腺炎。该方法具有无创、操作简便、周期短且重复性高的优点。[演示者] 首先，测量并记录实验小鼠的体重。进行腹腔注射雨蛙素（Caerulein）时，抓取并固定小鼠，使其腹部朝上，头部位置低于尾部。右手持注射器，将针头插入腹部白线左侧皮下皮肤处。向前推进针头约3至5毫米，以45度角刺入腹腔。保持针头静止，缓慢注入雨蛙素。拔出针头后，用无菌棉签轻轻按摩并按压注射部位，使药物充分扩散至腹腔内。注射后12小时，将小鼠置于实验箱网格中央，使其背向实验操作者。启动视频追踪软件，设置同时监测四个视野。在实时监控屏幕上标定箱内可移动实验对象的长度与宽度。记录小鼠15分钟内的活动情况。在五个循环周期中对胰腺损伤小鼠模型进行宏观指标检测，结果显示：胰腺损伤第5组小鼠在3分钟内的移动距离持续保持在较低水平，且每一轮循环中3分钟内的静止比例逐步上升。与其他实验组相比，胰腺损伤第5组的总移动距离最小，差异具有统计学意义。除对照组和胰腺损伤第1组外，其余各组均呈现负值体重增长，其中胰腺损伤第5组的变化最为显著。生存率分析显示，至第5天时，胰腺损伤第5组的死亡率达到80%，而其他组与对照组相比无显著差异。腹腔注射雨蛙素36小时后，对小鼠实施安乐死，并将其仰卧位固定于泡沫板上。行腹部正中切口，将小肠袢翻向右侧以暴露胰腺。分离十二指肠及幽门管。定位胰腺下方的小肠，沿肠管完全游离胰腺组织。使用无齿镊夹住脾脏，轻柔向上牵拉。锐性解剖至胰头部位，切断胰腺后方的韧带组织。随后切断胆管及血管。将胰腺组织从腹腔中取出，用吸水纸轻轻吸干表面水分。测量并记录胰腺组织的重量。制备石蜡切片后，将胰腺组织在二甲苯中脱蜡两次，每次5分钟。每张切片加入100微升蛋白酶K溶液，37摄氏度孵育20分钟。向组织中加入适量3%过氧化氢溶液，孵育20分钟，确保充分渗透。每张样本加50微升平衡缓冲液，覆盖整个组织区域，孵育10分钟。然后每份组织样本加56微升TdT孵育缓冲液，孵育1小时。用PBS洗涤组织切片，每次5分钟，共洗四次，随后加入100微升链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）反应液，孵育30分钟。DAB染色时，每张组织切片加50微升DAB溶液。将切片浸入苏木精染色液中染色3至5分钟，然后用纯水冲洗。依次使用新鲜无水乙醇脱水四次，每次5分钟。在白光显微镜下进行组织学检查。对小鼠胰腺组织进行TUNEL染色，结果显示胰腺损伤第5组细胞坏死增加，其灰度值和阳性坏死率显著高于其他组。通过蛋白质免疫印迹法检测细胞坏死标志物Caspase-3的表达水平，发现胰腺损伤第5组组织中该蛋白表达显著升高。对胰腺腺泡细胞悬液进行流式细胞术分析，使用Nexin 5 fit CPI标记，结果显示胰腺损伤第5组的细胞死亡率明显高于其他组，且差异具有统计学意义。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

通过 Caerulein 和 Lipopolysaccharide 联合腹腔注射制备严重急性胰腺炎小鼠模型

本视频介绍了通过胰腺输注牛磺胆酸钠建立急性胆源性胰腺炎小鼠模型的操作步骤。该模型有助于研究牛磺胆酸钠在胰腺中诱导的病理生理学变化。...

急性胆源性胰腺炎模型：通过胰管灌注建立小鼠急性胆源性胰腺炎模型的方法

重症急性胰腺炎的动物模型可用于研究疾病初始阶段的病理生理变化，有助于观察炎症事件的发展过程。本文提供了一种通过逆行输注牛磺胆酸钠至麻醉C57BL/6小鼠胰管以诱导重症急性胆源性胰腺炎的实验方案。...

C57BL/6小鼠中牛磺胆酸钠诱导的重度急性胰腺炎

慢性胰腺炎（CP）是一种以胰腺炎症和纤维化为特征的疾病，常伴有难以缓解的腹痛。本文重点优化通过胆管输注2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）建立小鼠CP模型的技术。...

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通过逆行注射牛磺胆酸钠至胆胰管建立小鼠重症急性胰腺炎模型

本实验方案描述了一种新型的慢性阻塞性胰腺炎建模方法，该方法通过可视化胰管并对其实施电凝，从而导致胰管阻塞。...

通过电凝法建立的梗阻性慢性胰腺炎模型

本视频展示了如何在SJL小鼠中诱导自身免疫性垂体炎，以及如何通过组织病理学评估其严重程度。...

在SJL小鼠中诱导实验性自身免疫性垂体炎

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。...

监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

腺病毒颗粒被改造为含有非天然氨基酸类似物叠氮高丝氨酸或叠氮糖O-GlcNAz。通过“点击”化学反应，每种分子中的叠氮基团可发生化学选择性连接，从而实现病毒表面的修饰。...

通过生物正交点击化学实现病毒表面的化学选择性修饰

多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C.

4D 多模态成像 鼠伤寒柠檬酸杆菌 小鼠感染

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。...

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

了解利用雨蛙肽与脂多糖联合腹腔注射在C57BL/6J小鼠中建立重症急性胰腺炎模型的方法。该非侵入性技术可诱导器官衰竭并监测HMGB1炎症基因表达，为治疗靶点研究提供高重复性的实验平台。

通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型

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