从全血中分离并低温保存高活力人外周血单个核细胞：初学者指南

本方案旨在提供一份简明易懂、逐步指导的操作教程，介绍如何从全血中采集并保存高活力的外周血单个核细胞（PBMCs）。PBMCs 包括淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞。大量 PBMCs 可进一步处理以分离特定细胞类型，广泛应用于多种实验与检测，包括RNA测序和流式细胞术。

除了PBMCs外，我们还演示了如何收集EDTA血浆和完整的白膜层。在开始本方案之前，请准备好表2中列出的材料和试剂。请注意，本方案适用于从六个密度梯度离心管中收集PBMCs，每根离心管可获得约1200万个细胞。

根据需要进行相应调整。采用标准静脉采血技术，将全血分别收集至六支密度梯度离心管和一支EDTA管中，直至充满。将所有试管在室温下以1800g离心20分钟。

如有需要，收集的试管可保存长达4小时，之后再进行批量处理。有关离心机操作方法的演示，请参见补充视频1。离心含有密度梯度介质的试管后，血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）将位于密度梯度介质的上方。

红细胞和粒细胞将沉降至底部。有关示意图，请参见图1A。离心后，小心打开密度梯度离心管。

使用移液管移除并弃去含有血浆的半透明黄色层。切勿扰动位于密度梯度介质上方的、呈浑浊状的细胞层。宁可残留过多血浆，也不应弃去外周血单个核细胞（PBMCs）。

对所有试管重复此操作。使用新的移液管，将每根试管中含细胞和残留血浆的剩余液体在密度梯度介质上方轻轻吹打数次。重悬后，将试管中重悬的液体转移至已标记的50 mL锥形管中。

对所有试管重复此操作。将50 mL试管用溶液1加至50 mL刻度线。在室温下，以300g离心50 mL试管10分钟。

在此期间，可完成第2节中详述的血浆和白膜层收集方案。离心后，沉淀物中含有外周血单个核细胞（PBMCs），上清液中含有血小板和残余血浆。尽可能弃去上清液。

根据需要轻敲以去除残留液滴。将15 mL溶液2倒入含有PBMC沉淀的50 mL锥形管中。轻轻颠倒混匀以重悬沉淀。

用移液管吸取15 mL溶液3，逐滴加入50 mL离心管中。溶液3含有DMSO，室温下对细胞具有毒性。

在准备立即处理前，不要加入溶液3。轻轻翻转试管三次以混匀。使用多通道移液器将1 mL PBMC加入每个预先标记并预冷的冻存管中。

请参阅补充视频2，了解如何操作多通道分液移液器。将冻存管放入预冷的冻存盒中，然后将冻存盒转移至-80摄氏度冰箱中。

将冻存管置于冻存盒中至少12小时。然后转移至标记好的储存盒中，于负80摄氏度保存。或者，可将已冷冻的冻存管转移至液氮中进行长期保存。

离心后，上层为血浆，下层含有红细胞，中间界面为白细胞和血小板层（buffy coat）。参见图1B以了解示意图。使用一支新的移液管，尽可能吸取全部血浆，同时避免扰动buffy coat层。

然后，将0.5 mL等分试样加入预先标记好的冻存管中。吸取白膜层并转移至相应标记的冻存管中。请注意，部分血浆和红细胞可能会污染白膜层的收集。

收集后，将冻存管置于负80摄氏度冰箱中保存。如需长期保存，可选择液氮储存。在开始PBMC解冻实验方案之前，请准备好表3中列出的材料和试剂。

本方案适用于解冻一支含有约200万个细胞的1.5 mL离心管。请根据实际需要按比例调整。需要注意的是，不同患者之间以及不同处理条件下，细胞的绝对数量可能存在显著差异。

使用干冰将冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）从储存处转移，并在37摄氏度培养箱中解冻约4分钟。如需要，可取一部分样品用于细胞计数和活力检测，具体步骤详见书面方案的第4节。解冻后，向每个冻存管中加入1 mL溶液4。

然后，将内容物倒入预先标记的 50 mL 离心管中，每解冻一管 PBMC 对应加入 10 mL 溶液 4。轻敲以去除残留液滴。将细胞筛置于空的 50 mL 离心管上，随后将细胞悬液通过细胞筛过滤。

如有需要，可轻轻敲击以打破表面张力。将含有过滤后细胞的每个离心管在室温下以 400g 离心 7 分钟。离心后，倒出含有 DMSO 的上清液。

根据需要轻敲以去除残留液滴。将细胞沉淀重悬于适合后续实验需求的适当培养基中，例如细胞培养基或流式细胞术抗体混合液。继续进行实验。

在采集外周血单个核细胞（PBMC）并进行冻存后，使用表4所列试剂，按照图2A至2F所示的制造商说明书，通过流式细胞术评估了56个独立样本解冻后PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力。如图2G所示，PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均活力及标准差分别为94 ± 4%、98 ± 1.1%和93 ± 5.6%。通过台盼蓝排斥法测得的活力平均值为88 ± 7.5%，细胞计数为2.3 × 10⁶ ± 1.9 × 10⁶。流式细胞术分析还显示，活单核细胞占总PBMC的17 ± 5.9%，活淋巴细胞占53 ± 13%。

随后，通过流式细胞术从59个不同样本的冻存PBMCs中分选出单核细胞，并按照 elsewhere 所述方法进行文库构建和RNA测序。测序总读段数平均值为1800万，标准差为1630万，读段比对率平均为93%，标准差为6.3%，GC含量平均为49.6%，标准差为1.4%，如图3A和3B所示。在56个不同样本的子集中，唯一比对读段百分比平均为88%，标准差为3.6%。这些参数表明，采用本方案，无论操作者实验室经验水平如何，均可获得高质量且适用于下游应用（包括高质量RNA测序）的高活性PBMCs。

进行本方案时，关键是要快速操作，以避免细胞死亡，尤其是在加入对室温下细胞具有毒性的溶液3之后。此外，必须轻柔处理细胞，以尽量减少损伤。本方案提供了一种高效且易于操作的方法，用于分离PBMCs、EDTA血浆和白膜层。

这些免疫细胞可用于多种实验和检测，以研究免疫系统在不同生物学背景下的作用。