Name: 从全血中分离和冷冻保存高活力的人外周血单核细胞:初学者指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学习从全血中分离和冷冻保存高活力人外周血单核细胞（PBMCs）的标准方法。本方案涵盖密度梯度离心、血浆和白膜层收集，以及细胞复苏流程，适用于免疫学和细胞生物学研究。

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我们感谢那些自愿提供知情同意、时间并捐献血样的患者。我们还要感谢堪萨斯大学医学中心的 Dr. Patrick Moriarty、Julie-Ann Dutton 和 Mark McClellen，感谢他们在远程站点合作实施本方案。CY 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1K08HL150271 的研究支持。

该研究方案已获得加州大学圣地亚哥分校（UCSD）和堪萨斯大学医学中心（KUMC）人类保护项目批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有受试者均知情同意参与研究并提供血液样本。
1. PBMC 的处理与冷冻保存
<ol>
	<li>在采血前一天，打印出 表2 中列出的材料和试剂清单，并相应地进行准备和标记。 
	注意：本方案设计用于收集6根密度梯度离心管。每根管可获得约1200万个外周血单个核细胞（PBMCs），其中约50%和20%分别为活淋巴细胞和单核细胞。请根据实验需求按比例调整。请注意，不同患者或处理条件下细胞的绝对数量可能存在显著差异。</li>
	<li>采用标准静脉穿刺技术，将全血采集至6根密度梯度离心管和1根EDTA管中，直至充满，每管约6 mL体积。 
	注意：若需采集多个患者或不同处理条件的样本，收集后的样本管可在4小时内保存，并随后同时处理。</li>
	<li>采集后，在室温下以1,800 × g 离心20分钟。 
	注意：操作离心机的方法可参见 补充视频1 的演示。</li>
	<li>离心后，小心打开密度梯度离心管。使用移液管移除并弃去含有血浆的淡黄色透明层。注意不要扰动位于密度梯度介质上方的模糊细胞层。为稳妥起见，宁可残留少量血浆，也不要误弃PBMCs。对所有试管重复此步骤。 
	注意：含有密度梯度介质的试管离心后，血浆和PBMCs将位于密度梯度介质上方；红细胞和粒细胞则沉降至底部。具体结构可参见 图1A 的示意图。</li>
	<li>使用新的移液管，在每根试管中密度梯度介质上方，轻轻吹吸含有细胞和残余血浆的剩余液体数次，以充分混匀。</li>
	<li>重悬后，将每根试管中的重悬液转移至已标记的50 mL锥形管中。对所有试管重复此操作。</li>
	<li>将溶液1（RPMI培养基）倒入50 mL管中，直至液面达到50 mL刻度线。</li>
	<li>根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤1.4至1.7&#160;。 
	注意：确保不同样本之间不发生混合，并使用新的移液管以避免交叉污染。</li>
	<li>将50 mL管在室温下以300 × g 离心10分钟。 
	注意：在此期间可同时完成第2节所述的血浆和白膜层收集方案。</li>
	<li>尽可能弃去上清液。必要时轻敲管壁以去除残留液滴。 
	注意：离心后，沉淀物中含有PBMCs，上清液中含有血小板和残余血浆。</li>
	<li>将15 mL溶液2（RPMI培养基 + 12.5%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol）倒入含有PBMC沉淀的50 mL锥形管中。轻轻颠倒混匀，使细胞沉淀重悬。</li>
	<li>用移液管吸取15 mL溶液3（RPMI培养基 + 11.25%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol + 10% DMSO），逐滴加入50 mL管中。 
	注意：溶液3含有DMSO，在室温下对细胞具有毒性。请确保在即将立即处理时再加入溶液3。</li>
	<li>轻轻颠倒混匀3次。</li>
	<li>使用多通道分液器，将1 mL PBMC悬液分装至每个预先标记并预冷的冻存管中。 
	注意：操作多通道分液器的方法可参见 补充视频2 的演示。</li>
	<li>将冻存管放入预冷的冻存盒中，然后将冻存盒转移至-80 °C超低温冰箱中。</li>
	<li>根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤1.9至1.13。</li>
	<li>将冻存管在冻存盒中至少保存12小时，然后转移至-80 °C的标记储存盒中。 
	注意：也可将冻存管转移至液氮（&#60;-135 °C）中进行长期保存。</li>
</ol>
2. EDTA 管中血浆和血沉棕黄层的处理
<ol>
	<li>在室温下以 1,800 x g 离心 10 分钟。&#160; 
	注意：离心后，上层为血浆，下层为红细胞，中间界面为白膜层。白膜层的示意图见图 1B。</li>
	<li>使用新的移液管，尽可能吸取血浆，避免扰动白膜层。然后将 0.5 mL 分装至预先标记的冻存管中。吸取白膜层并转移至相应标记的冻存管中。 
	注意：白膜层收集过程中可能混入少量血浆和红细胞。</li>
	<li>根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤&#160;2.2。</li>
	<li>收集完成后，将冻存管存放于 -80 °C 冰箱中。 
	注意：如需长期保存，可选择存放于液氮中（&#60;-135 °C）。</li>
</ol>
3. 解冻外周血单个核细胞（PBMCs）
<ol>
	<li>解冻前一天，打印出表3中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。 
	注意：本方案适用于解冻1个含有1 mL PBMCs的1.5 mL冻存管。每管大约可获得200万个PBMCs，其中约50%和20%分别为活淋巴细胞和单核细胞。请根据实验需求按比例调整。请注意，不同患者或处理条件下细胞的绝对数量可能存在显著差异。</li>
	<li>使用干冰将冷冻保存的PBMCs转移，并在37 °C培养箱中解冻4分钟，或直至最后一颗冰晶即将融化为止。 
	注意：如需要，可取部分样品进行细胞计数和活力检测，具体方法见第4节。</li>
	<li>解冻后，向每个冻存管中加入1 mL溶液4（PBS + 2 mM EDTA）。然后将内容物倒入已预先标记的50 mL离心管中，每解冻1管PBMCs对应加入含10 mL溶液4的50 mL管中。轻敲以去除残留液滴。</li>
	<li>将细胞筛置于空的50 mL离心管上，然后将细胞悬液通过细胞筛过滤。 
	注意：如有需要，可轻轻敲击以打破表面张力。</li>
	<li>将含有过滤后细胞的每根离心管在室温下以400 × g 离心7分钟。</li>
	<li>离心后，倒去含有DMSO的上清液。根据需要轻敲以去除残留液滴。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于适合后续实验需求的适当培养基中（例如细胞培养基、流式细胞术抗体混合液等）。</li>
</ol>
4. 细胞计数与活力检测
<ol>
	<li>在步骤 3.2 中解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）后，立即用移液器将 20 µL 细胞转移至 1.5 mL 离心管中。加入等体积的 0.4% 台盼蓝溶液，轻轻吹打 3–4 次以混匀。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪，按照制造商的说明书进行细胞计数和活力评估。注意将稀释倍数 2 计入计算。 
	注意：如其他文献所述，可使用血细胞计数板作为评估细胞数量和活力的替代方法23。</li>
</ol>

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<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+long-term+cryopreservation+of+pluripotent+stem+cells+at+-80+%C2%A0%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C.</a> Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).</li>
</ol>

作者无相关财务或非财务利益需要披露。

本PBMC采集与冷冻保存方案已成功应用于有无研究实验室培训背景的人员。在我们的应用中，从保存的PBMC中纯化出高活性的单核细胞，并对其进行FACS和RNA测序，获得了高质量的序列结果。
本方案的一个主要优势在于其易用性。该方案所采用的技术使用预先装有固体密度梯度介质的试管，因此全血可直接采集至试管中，并立即用于分离外周血单个核细胞（PBMC）。所需预制溶液和专用设备较少，便于试剂制备的研究实验室与样本采集和处理的临床实验室之间开展协作。书面及视频操作指南适用于各个培训水平的操作人员。
尽管本实验方案使用新鲜全血来分离外周血单个核细胞（PBMCs），因此预期产量和纯度相对较高，可达&#62;90%，但对于需要极高纯度（&#62;98%）的应用可能并不适用26,27。此外，密度梯度离心管的获取成本可能较高，尤其是在需要收集大量样本的情况下。
获取PBMC的替代方法包括使用液体密度梯度介质或免疫磁珠耗竭法28,29。简而言之，前一种方法是将预制成的密度梯度介质置于肝素抗凝全血下方，随后进行离心。后一种方法则利用磁性标记的抗体标记非PBMC细胞，这些被标记的细胞在通过磁性柱时被滞留，而未标记的PBMC则不受影响地穿过磁性柱。
与所介绍的方案相比，使用液体密度梯度介质的成本较低，且由于无需密度梯度离心管，所需材料更少；PBMC的分离可在标准的50 mL离心管中进行8。然而，该技术操作更为复杂，处理时间较长，且可能更容易出现操作误差。必须精确添加肝素以避免过度稀释，同时需小心分层加入正确体积的密度梯度介质，以确保良好的PBMC分离效果26。
与所述方案相比，免疫磁珠耗竭法具有更高的得率和纯度，由于无需离心，操作步骤更少，处理时间更短，且所需材料显著减少30,31,32。然而，该方法的主要缺点是成本最高，尤其是在大规模应用时，是三种所述方法中最为昂贵的一种。
尽管本实验方案具有较强的稳健性，但某些关键步骤可能需要额外注意。在整个操作过程中，务必确保样本不被混淆，并放入正确标记的离心管中，尤其是在同时处理多个患者或不同条件的样本时。在步骤1.4中，应确保不丢弃任何外周血单个核细胞（PBMCs）；过量的血浆只会降低PBMCs的浓度，而这对维持样本的活力和质量影响较小。此外，若收集的PBMCs中出现沉淀物，提示密度梯度介质可能有碎片脱落。在步骤1.5中应更轻柔地使用移液器，以避免此问题。在步骤1.10和3.6中，务必注意不要丢弃离心后的细胞沉淀。步骤1.12和3.3的操作需迅速完成，因为溶液3含有二甲基亚砜（DMSO），在室温下对细胞具有毒性33。还需注意，建议将PBMCs储存于液氮中，而非-80°C冰箱。长期在-80°C储存已被证实与细胞活力下降及基因表达改变相关34,35。
本方案可根据实验需求进行调整。在溶液2和溶液3中添加黄酮吡咯（flavopiridol）——一种RNA聚合酶和mRNA合成抑制剂——旨在防止在RNA测序过程中因操作或应激所引入的人为假象36。然而，若需进行利用外周血单个核细胞（PBMCs）的功能性或ex vivo研究，则可省略黄酮吡咯。
从EDTA管中采集的血浆会受到EDTA（一种螯合剂）的污染。因此，EDTA血浆不适用于涉及凝血或钙离子的检测37,38。如需要，可在步骤1.4中改为收集离心后密度梯度介质管中的血浆层。这些试管中含有肝素钠作为抗凝剂，可通过添加肝素酶将其去除39。值得注意的是，肝素会抑制逆转录酶和PCR扩增，因此在未添加肝素阻断剂的情况下，所收集的血浆不适用于PCR实验40。
从EDTA管收集的血沉棕黄层未保存在含有DMSO或flavopiridol的溶液中。DMSO在减少冰晶形成和细胞死亡方面具有重要作用41。flavopiridol在抑制RNA合成方面具有重要作用36。因此，该血沉棕黄层不适合用于体外（ex vivo）和转录组学分析。如有需要，可使用收集的血沉棕黄层进行步骤1.6&#160;至1.15，以最大限度地提高细胞活力并抑制RNA合成。
尽管本方案是为RNA测序设计的，但采用该方案收集并冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMC）还可用于其他多种潜在应用，包括细胞培养、基因编辑、离体功能研究、单细胞分析、通过流式细胞术或飞行时间质谱流式细胞术进行表型分析、DNA/RNA或蛋白质的提取，以及免疫组织化学载玻片制备等。

本方案展示了一种从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）的简便方法和操作流程。该方案特别面向实验技术新手、学生以及临床实验室工作人员，旨在帮助其在无需具备前期实验技术培训背景的情况下，顺利完成PBMCs的采集与冷冻保存。
本方案利用离心法根据密度差异分离全血的各组分。全血主要由四种组分构成，按密度从高到低依次为：红细胞/红血球（约占体积的45%）、白细胞（&#60;1%的体积）、血小板（&#60;1%的体积）和血浆（约占体积的55%）1,2,3,4,5,6。根据细胞核的形态特征，白细胞可分为两类：核呈圆形或分叶状的白细胞6。外周血单个核细胞（PBMCs）定义为具有圆形细胞核的白细胞，主要包括以下细胞类型：淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）、树突状细胞和单核细胞6。具有分叶核的白细胞包括粒细胞，后者又包含以下细胞类型：中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞6。分叶核白细胞的密度高于PBMCs6。全血各组分的密度详见表1。
在本实验方案中，将全血采集至密度梯度离心管中。这些离心管内含有预装的密度梯度介质，其密度为1.077 g/mL。离心后，密度较大的细胞（包括多核白细胞和红细胞）被密度梯度介质与外周血单个核细胞（PBMCs）及血小板分离（图1A）6,7。随后收集PBMC和血小板组分，经洗涤并离心以去除血小板。最终获得的纯化PBMCs被收集后储存于-80 °C或液氮中。冻存的PBMCs可被成功复苏，并直接用于后续分析，或进一步处理以分离特定的细胞亚群。
本方案已针对高活力外周血单个核细胞（PBMC）的高质量RNA测序进行了优化。本文中，PBMCs来自门诊患者，并经分离后冷冻保存。随后，通过荧光激活细胞分选（FACS）从PBMCs中分离单核细胞，并进行RNA测序分析。然而，该方案也可广泛适用于其他实验需求，如细胞培养、基因编辑、离体（ex-vivo）功能研究、单细胞分析、流式细胞术或飞行时间质谱流式细胞术进行表型分析、DNA/RNA或蛋白质的提取、免疫组织化学载片制备等8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。
除了从密度梯度离心管中收集外周血单个核细胞（PBMC）外，本方案还介绍了如何收集血浆和血沉棕黄层 通过 使用EDTA管进行离心。离心后，全血分离为血浆、红细胞以及一层称为白膜层的薄层界面，其中含有白细胞（图1B)6. 淋巴细胞层常用于DNA提取及后续的基因组分析19,20血浆层含有全血中的无细胞成分，可用于生物标志物检测21,22.

<table><tbody><tr><td>1000 &amp;micro;L吸头</td><td>Gilson</td><td>F174501</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需3个吸头</td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Biopioneeer</td><td>CNT-15</td><td>用于盛装溶液2/3&lt;br/&gt; 每位患者/处理条件进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个</td></tr><tr><td>2 mL冻存管</td><td>Globe Scientific</td><td>3012</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需40个冻存管</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L吸头</td><td>Gilson</td><td>F174201</td><td>用于细胞计数；所需数量取决于所用细胞计数方法。每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需1个吸头</td></tr><tr><td>50 mL锥形管</td><td>CEM Corporation</td><td>50-187-7683</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个&lt;br/&gt; 每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需3个</td></tr><tr><td>CD14抗体</td><td>Biolegend</td><td>325621</td><td></td></tr><tr><td>CD16抗体</td><td>Biolegend</td><td>360723</td><td></td></tr><tr><td>CD19抗体</td><td>Biolegend</td><td>363007</td><td></td></tr><tr><td>CD3抗体</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td></td></tr><tr><td>CD56抗体</td><td>Biolegend</td><td>318303</td><td></td></tr><tr><td>CD66b抗体</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛</td><td>Biopioneeer</td><td>DGN258367</td><td>每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需1个</td></tr><tr><td>CPT单个核细胞分离管</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需6根管</td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Southern Labware</td><td>SB2CC-81</td><td>可容纳81根管&lt;br/&gt; 每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需1个</td></tr><tr><td>冻存管架</td><td>Fisherbrand</td><td>05-669-45</td><td>最多可容纳50个冻存管</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需2.5 mL</td></tr><tr><td>无DNase/RNase蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需2 mL&lt;br/&gt; 每1 mL冷冻PBMC解冻约需9 mL</td></tr><tr><td>EDTA管</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需1根管</td></tr><tr><td>Flavopiridol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3055-5MG</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR抗体</td><td>Biolegend</td><td>307609</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>每位患者或处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需25 mL</td></tr><tr><td>Human Trustain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292912-1KG-K</td><td>用于Mr. Frosty</td></tr><tr><td>标签打印机</td><td>Phomemo</td><td>M110-WH</td><td></td></tr><tr><td>活死染色剂</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>最多可容纳18根管。&lt;br/&gt; 每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个Mr. Frosty</td></tr><tr><td>多通道分配移液器</td><td>Brandtech</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>多通道分配移液器吸头</td><td>Brandtech</td><td>705744</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需3个吸头</td></tr><tr><td>P1000移液器</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P20移液器</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td>用于细胞计数；所需数量取决于所用细胞计数方法。</td></tr><tr><td>打印机标签</td><td>Phomemo</td><td>PM-M110-3020</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需45个标签&lt;br/&gt; 每1 mL未混合冷冻PBMC解冻约需5个标签</td></tr><tr><td>无RNase EDTA（0.5 M）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>每1 mL冷冻PBMC解冻约需40 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>无RNase PBS（10X）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>每1 mL冷冻PBMC解冻约需1 mL</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>每位患者或处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需80 mL</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需5个</td></tr><tr><td>试管架</td><td>Endicott-Seymour</td><td>14-781-15</td><td>最多可容纳80根CPT/EDTA管</td></tr></tbody></table>

从全血中分离并低温保存高活力人外周血单个核细胞：初学者指南

Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners

外周血单个核细胞（PBMCs）在免疫系统及其对疾病和病原体反应的生物医学研究中被广泛使用。本详细方案描述了从全血中分离、冷冻保存和复苏高质量且高活力PBMCs所需的设备、试剂和操作步骤，所获得的细胞适用于流式细胞术和RNA测序等下游应用。本方案还同时描述了在处理PBMCs的同时平行分离血浆和白膜层的操作流程。该分步操作方案简单易行，采用密度梯度离心法分离PBMCs，并附有试剂、设备及准备步骤的清单。本方案适用于具备任何实验室技术经验水平的操作人员，可在临床或科研实验室中实施。即使无实验室经验的操作人员按照本方案操作，也能获得细胞活力高、适用于RNA测序的PBMCs。

在采集外周血单个核细胞（PBMC）并进行冻存后，使用 表4 所列试剂，按照制造商说明书通过流式细胞术评估了56个独立样本解冻后PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力（图2A-F）。PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均活力（±标准差）分别为 94 ± 4.0%、98 ± 1.1% 和 93 ± 5.6%（图2G）。通过台盼蓝排斥法测定的活力平均值为 88 ± 7.5%，细胞计数为 2.3 x 106 ± 1.9 x 106。流式细胞术分析还显示，活单核细胞占总PBMC的 17 ± 5.9%，活淋巴细胞占 53 ± 13.0%。
随后，通过流式细胞术从59个不同样本的冻存外周血单个核细胞（PBMCs）中分选出单核细胞，并按照文献所述方法进行文库构建和RNA测序24。测序获得的总序列数平均值 ± 标准差为18.0 ± 16.3百万条，比对率高达93 ± 6.3%，GC含量为49.6 ± 1.4%（图3A-B）。在56个独立样本的子集中，唯一比对的reads比例平均值 ± 标准差为88 ± 3.6%。这些指标表明，采用本方案，无论操作者实验室训练水平如何，均可获得适用于下游应用（包括高质量RNA测序）的高活性PBMCs。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>密度 </td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血浆</td>
			<td>1.022 g/mL 至 1.026 g/mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血小板</td>
			<td>&lt;1.061 g/mL 至 &gt;1.070 g/mL</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMCs</td>
			<td>&lt;1.077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低密度中性粒细胞*</td>
			<td>&lt;1.077 g/mL</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粒细胞（中性粒细胞*、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞）</td>
			<td>&gt;1.077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>红细胞</td>
			<td>1.11 g/mL</td>
			<td>4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：按密度递减顺序列出的全血成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂/材料</td>
			<td>用量（每6个CPT管和1个EDTA管）</td>
			<td colspan="5">提示</td>
			<td colspan="3">注意事项</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPT管</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="5">根据患者或样本编号进行标记。</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA管</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">根据患者或样本编号进行标记。</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL锥形管</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">除标注患者或样本编号外，另标记1个管用于PBMC，1个管用于废液。</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冻存管</td>
			<td>39</td>
			<td colspan="5">标记30个用于PBMC，8个用于EDTA血浆，1个用于白膜层。并非所有冻存管都会被使用。</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">加入异丙醇至半满位置，并在-20°C预冷过夜。</td>
			<td colspan="3">异丙醇为易燃刺激物，应远离火花或火焰。避免吸入，操作时需佩戴手套并小心处理。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavopiridol</td>
			<td>100 µL 的1000X储存液</td>
			<td colspan="5">配制1000X Flavopiridol储存液：将5 mg Flavopiridol溶于1.14 mL DMSO中，终浓度为10 mM。分装为每份200 µL至独立容器中后冷冻保存。使用时，取出单份解冻，用无DNase/RNase的去离子水按1:10稀释，作为1000X溶液使用。</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol具有刺激性，操作时需佩戴手套并小心处理。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液1</td>
			<td>50 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI培养基。 
			配制50 mL储存液：使用50 mL RPMI培养基。</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液2</td>
			<td>15 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI培养基 + 12.5%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol。 
			配制50 mL储存液：使用25 mL RPMI培养基 + 25 mL人血清白蛋白 + 50 µL 1000X Flavopiridol。</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol具有刺激性，操作时需佩戴手套并小心处理。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液3</td>
			<td>15 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI培养基 + 11.25%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol + 10% DMSO。 
			配制50 mL储存液：使用22.5 mL RPMI培养基 + 22.5 mL HSA + 5 mL DMSO + 50 µL 1000X Flavopiridol。</td>
			<td colspan="3">Flavopiridol具有刺激性，DMSO有毒且可通过皮肤快速吸收。操作时需佩戴手套并小心处理。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：采集和冻存外周血单个核细胞所需试剂与材料的准备及标记清单。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂/材料</td>
			<td>用量（每 1 mL 冻存 PBMC 样本）</td>
			<td colspan="2">提示</td>
			<td>注意事项</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 4</td>
			<td>10 mL</td>
			<td colspan="2">PBS + 2 mM EDTA 
			 
			配制 50 mL 储存液：使用 5 mL 10X PBS + 200 µL 0.5M EDTA + 44.8 mL 无 DNase/RNase 的蒸馏水</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL 圆底离心管</td>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">除患者或样本编号外，标记 1 支管用于预过滤 PBMC，1 支用于过滤后 PBMC，1 支用于废液。在标记为预过滤 PBMC 的管中，按每 1 mL 冻存 PBMC 加入 9 mL Solution 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL 离心管</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">用于细胞计数；标记患者或样本编号</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% 台盼蓝溶液</td>
			<td>20 µL</td>
			<td colspan="2">用于细胞计数；可在前一天提前加入 1.5 mL 管中</td>
			<td>台盼蓝为致癌物。操作时需戴手套并小心处理。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：解冻和计数PBMCs所需试剂与材料的准备和标记清单。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂/材料</td>
			<td>用量（每百万细胞）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>活死细胞染料</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Trustain FcX</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 抗体</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 抗体</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin</td>
			<td>100 Units</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：通过流式细胞术从外周血单个核细胞中分离单核细胞的试剂表。
<img alt="血液分离示意图；密度梯度离心；血浆、外周血单个核细胞层、白膜层、红细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：通过密度梯度离心或EDTA抗凝管离心分离的全血组分。（A）全血在密度梯度离心管中离心后，血浆、血小板及外周血单个核细胞（PBMCs）位于密度梯度介质上方，多核细胞和红细胞则沉于密度梯度介质下方。（B）全血在EDTA管中离心后，最上层为血浆，底层为红细胞，中间界面层为白膜层。图示由Biorender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；散点图显示 PBMCs、单核细胞、淋巴细胞；包含活力图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：通过活/死细胞染色结合流式细胞术评估解冻后冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMCs）的活力。（A）通过前向散射和侧向散射设门排除碎片（以星号 * 标注），从而圈选 PBMCs。（B）全 PBMCs 的代表性活/死细胞分析。（C）泛单核细胞设门为 HLA-DR 阳性，并对以下 FITC 标记的表面抗原呈阴性：CD3、CD19、CD56 和 CD66b。（D）单核细胞的代表性活/死细胞分析。（E）通过以下 FITC 标记的表面抗原设门的淋巴细胞：CD3、CD19、CD56 和 CD66b。（F）淋巴细胞的代表性活/死细胞分析。（G）从 56 个样本中定量的各细胞类型活力百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FastQC 图表：序列比对率与百万序列数关系，以及 GC 含量百分比分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：从冻存 PBMC 分离的单核细胞 RNA 测序质量。 对 56 个独立样本进行了测序，平均生成总序列数为 18.0 ± 16.3 百万条。(A) 序列比对率较高，其中 92.5% ± 6.3% 的序列可比对至参考基因组。(B) 这些序列的 GC 含量为 49.6 ± 1.4%。由 FastQC25 生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充视频 1：离心机使用方法演示 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 2：多通道移液器操作演示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案提供了外周血单个核细胞采集、保存和复苏的简易指南，适用于流式细胞术和RNA测序等后续分析与实验流程。同时演示了血浆和白膜层的收集方法。

外周血单个核细胞（PBMCs）在免疫系统及其对疾病和病原体反应的生物医学研究中被广泛使用。

本方案旨在提供一份简明易懂、逐步指导的操作教程，介绍如何从全血中采集并保存高活力的外周血单个核细胞（PBMCs）。PBMCs 包括淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞。大量 PBMCs 可进一步处理以分离特定细胞类型，广泛应用于多种实验与检测，包括RNA测序和流式细胞术。除了PBMCs外，我们还演示了如何收集EDTA血浆和完整的白膜层。在开始本方案之前，请准备好表2中列出的材料和试剂。请注意，本方案适用于从六个密度梯度离心管中收集PBMCs，每根离心管可获得约1200万个细胞。根据需要进行相应调整。采用标准静脉采血技术，将全血分别收集至六支密度梯度离心管和一支EDTA管中，直至充满。将所有试管在室温下以1800g离心20分钟。如有需要，收集的试管可保存长达4小时，之后再进行批量处理。有关离心机操作方法的演示，请参见补充视频1。离心含有密度梯度介质的试管后，血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）将位于密度梯度介质的上方。红细胞和粒细胞将沉降至底部。有关示意图，请参见图1A。离心后，小心打开密度梯度离心管。使用移液管移除并弃去含有血浆的半透明黄色层。切勿扰动位于密度梯度介质上方的、呈浑浊状的细胞层。宁可残留过多血浆，也不应弃去外周血单个核细胞（PBMCs）。对所有试管重复此操作。使用新的移液管，将每根试管中含细胞和残留血浆的剩余液体在密度梯度介质上方轻轻吹打数次。重悬后，将试管中重悬的液体转移至已标记的50 mL锥形管中。对所有试管重复此操作。将50 mL试管用溶液1加至50 mL刻度线。在室温下，以300g离心50 mL试管10分钟。在此期间，可完成第2节中详述的血浆和白膜层收集方案。离心后，沉淀物中含有外周血单个核细胞（PBMCs），上清液中含有血小板和残余血浆。尽可能弃去上清液。根据需要轻敲以去除残留液滴。将15 mL溶液2倒入含有PBMC沉淀的50 mL锥形管中。轻轻颠倒混匀以重悬沉淀。用移液管吸取15 mL溶液3，逐滴加入50 mL离心管中。溶液3含有DMSO，室温下对细胞具有毒性。在准备立即处理前，不要加入溶液3。轻轻翻转试管三次以混匀。使用多通道移液器将1 mL PBMC加入每个预先标记并预冷的冻存管中。请参阅补充视频2，了解如何操作多通道分液移液器。将冻存管放入预冷的冻存盒中，然后将冻存盒转移至-80摄氏度冰箱中。将冻存管置于冻存盒中至少12小时。然后转移至标记好的储存盒中，于负80摄氏度保存。或者，可将已冷冻的冻存管转移至液氮中进行长期保存。离心后，上层为血浆，下层含有红细胞，中间界面为白细胞和血小板层（buffy coat）。参见图1B以了解示意图。使用一支新的移液管，尽可能吸取全部血浆，同时避免扰动buffy coat层。然后，将0.5 mL等分试样加入预先标记好的冻存管中。吸取白膜层并转移至相应标记的冻存管中。请注意，部分血浆和红细胞可能会污染白膜层的收集。收集后，将冻存管置于负80摄氏度冰箱中保存。如需长期保存，可选择液氮储存。在开始PBMC解冻实验方案之前，请准备好表3中列出的材料和试剂。本方案适用于解冻一支含有约200万个细胞的1.5 mL离心管。请根据实际需要按比例调整。需要注意的是，不同患者之间以及不同处理条件下，细胞的绝对数量可能存在显著差异。使用干冰将冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）从储存处转移，并在37摄氏度培养箱中解冻约4分钟。如需要，可取一部分样品用于细胞计数和活力检测，具体步骤详见书面方案的第4节。解冻后，向每个冻存管中加入1 mL溶液4。然后，将内容物倒入预先标记的 50 mL 离心管中，每解冻一管 PBMC 对应加入 10 mL 溶液 4。轻敲以去除残留液滴。将细胞筛置于空的 50 mL 离心管上，随后将细胞悬液通过细胞筛过滤。如有需要，可轻轻敲击以打破表面张力。将含有过滤后细胞的每个离心管在室温下以 400g 离心 7 分钟。离心后，倒出含有 DMSO 的上清液。根据需要轻敲以去除残留液滴。将细胞沉淀重悬于适合后续实验需求的适当培养基中，例如细胞培养基或流式细胞术抗体混合液。继续进行实验。在采集外周血单个核细胞（PBMC）并进行冻存后，使用表4所列试剂，按照图2A至2F所示的制造商说明书，通过流式细胞术评估了56个独立样本解冻后PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力。如图2G所示，PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均活力及标准差分别为94 ± 4%、98 ± 1.1%和93 ± 5.6%。通过台盼蓝排斥法测得的活力平均值为88 ± 7.5%，细胞计数为2.3 × 10⁶ ± 1.9 × 10⁶。流式细胞术分析还显示，活单核细胞占总PBMC的17 ± 5.9%，活淋巴细胞占53 ± 13%。随后，通过流式细胞术从59个不同样本的冻存PBMCs中分选出单核细胞，并按照 elsewhere 所述方法进行文库构建和RNA测序。测序总读段数平均值为1800万，标准差为1630万，读段比对率平均为93%，标准差为6.3%，GC含量平均为49.6%，标准差为1.4%，如图3A和3B所示。在56个不同样本的子集中，唯一比对读段百分比平均为88%，标准差为3.6%。这些参数表明，采用本方案，无论操作者实验室经验水平如何，均可获得高质量且适用于下游应用（包括高质量RNA测序）的高活性PBMCs。进行本方案时，关键是要快速操作，以避免细胞死亡，尤其是在加入对室温下细胞具有毒性的溶液3之后。此外，必须轻柔处理细胞，以尽量减少损伤。本方案提供了一种高效且易于操作的方法，用于分离PBMCs、EDTA血浆和白膜层。这些免疫细胞可用于多种实验和检测，以研究免疫系统在不同生物学背景下的作用。

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