从全血中分离和冷冻保存高活力的人外周血单核细胞:初学者指南

在该协议中，我们旨在提供一个易于遵循的分步教程，介绍如何从全血中收集和储存高活力外周血和单核细胞或 PBMC。PBMC 包括淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞。散装 PBMC 可以加工以分离单个细胞类型，通常用于各种实验和测定，包括 RNA 测序和流式细胞术。

除了 PBMC，我们还演示了如何收集 EDTA 血浆和整个血沉棕黄层。在开始此方案之前，请准备表 2 中列出的材料和试剂。请注意，该方案设计用于从六个密度梯度离心管中收集 PBMC，每个离心管产生约 1200 万个细胞。

相应地扩展。使用标准静脉切开技术，在 6 个密度梯度离心管和 1 个 EDTA 管中收集全血，直至填充。在室温下以 1800 g 离心所有试管 20 分钟。

如果需要，收集的试管可储存长达 4 小时，然后同时处理。有关如何操作离心机的演示，请参阅补充视频 1。离心含有密度梯度介质的试管后，血浆和 PBMC 将高于密度梯度介质。

红细胞和粒细胞会沉降到底部。请参阅图 1A 以获取可视化。离心后，小心地打开密度梯度离心管。

使用移液管去除并丢弃含有血浆的半透明黄色层。不要干扰密度梯度培养基正上方的朦胧细胞层。选择留下多余的血浆，而不是丢弃 PBMC。

对所有试管重复上述步骤。使用新的移液管，将每管中剩余体积的含有细胞和残留血浆的移液轻轻上下移液至密度梯度培养基上方数倍。重悬后，将重悬的试管内容物移液到贴有标签的 50 mL 锥形管中。

对所有试管重复上述步骤。倾倒溶液 1 将 50 mL 试管填充至 50 mL 管线。在室温下以 300 g 离心 50 mL 试管 10 分钟。

第 2 节中详述的血浆和血沉棕黄层采集方案可以在此期间完成。离心后，沉淀含有 PBMC，上清液含有血小板和残留血浆。丢弃尽可能多的上清液。

根据需要点击以去除残留的液滴。将 15 mL 溶液 2 管倒入含有 PBMC 沉淀的 50 mL 锥形管中。轻轻倒置试管以重悬沉淀。

使用移液管吸出 15 mL 溶液 3。逐滴加入 50 mL 试管中。溶液 3 含有 DMSO，在室温下对细胞有毒。

在准备好立即处理之前，请勿添加溶液 3。轻轻倒置试管 3 次以混合。使用多分液管将 1 mL PBMC 填充每个预标记和预冷的冻存管。

请参阅补充视频 2，了解如何操作连续分液移液器。将冻存管放入预冷的冷冻容器中。然后，将容器移至负 80 摄氏度的冰箱中。

将冻存管放在冷冻容器内至少 12 小时。然后，转移到贴有标签的零下 80 摄氏度的储存盒中。或者，将冷冻冻存管转移到液氮中进行长期储存。

离心后，顶层由血浆组成，底层含有红细胞，界面将是血沉棕黄层。有关可视化，请参见图 1B。使用新的移液管，在不干扰血沉棕黄层的情况下吸取尽可能多的血浆。

然后，将 0.5 mL 等分试样分配到预先标记的冻存管中。吸出血沉棕黄层并将其转移到适当标记的冷冻瓶中。请注意，一些血浆和红细胞可能会污染血沉棕黄层集合。

收集后，将冻存管存放在负 80 摄氏度的冰箱中。或者，储存在液氮中长期储存。在开始 PBMC 解冻方案之前，请准备表 3 中列出的材料和试剂。

该方案设计用于解冻一根包含约 200 万个细胞的 1.5 mL 试管。相应地扩展。请注意，不同患者和不同治疗条件之间的细胞绝对数量可能有很大差异。

使用干冰从储存中转移冷冻的 PBMC，并在 37 摄氏度的培养箱中解冻约 4 分钟。如果需要，可以按照书面方案第 4 节中的详细说明进行细胞计数和活力测量。解冻后，向每个冻存管中加入 1 mL 溶液 4。

然后，将内容物倒入预先标记的 50 mL 试管中，每解冻一个 PBMC 试管，其中含有 10 mL 溶液 4。轻点以去除残留的液滴。将细胞过滤器放在空的 50 mL 试管上，然后将细胞悬液倒入细胞过滤器中。

如果需要，轻轻敲击以打破表面张力。在室温下以 400 g 离心每个含有菌株细胞的试管 7 分钟。离心后，倒出含有 DMSO 的上清液。

根据需要点击以去除残留的液滴。将细胞沉淀重悬于适合下游实验需要的所需培养基中，例如细胞培养基或流式细胞术抗体混合物。继续进行实验。

PBMC 收集和冷冻保存后，按照图 2A 至 F.A 中所示的制造商说明，使用表 4 中列出的试剂通过流式细胞术评估来自 56 个独特样品的解冻 PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力 PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力分别为 94 加或负 4%98 加或负 1.1% 和 93 加或负 5.6%， 实现了，如图 2G 所示。通过台盼蓝排除法进行活力测量得出的平均活力为 88 加或负 7.5%，细胞计数为 2.3 乘以 10 至 6 或减 1.9 乘以 10 至 6。流式细胞术分析还表明，活单核细胞占 17 个正负 5.9%，淋巴细胞占 53 个正负 13% 的 PBMC。

随后，通过流式细胞术从 59 个独特样品中分离出解冻的 PBMC 中的单核细胞，并提交进行文库制备和 RNA 测序，如处所述。平均值和标准差总序列计数为 18 个正负 1630 万个，正负 6.3% 的比对和 49.6 个正负 1.4 GC 含量，如图 3A 和 B.A 所示，在 56 个唯一样品的子集中发现平均值和标准差唯一映射的读数百分比为 88 正负 3.6%。这些参数表明，适用于下游应用（包括高质量 RNA 测序）的高活力 PBMC 可以由任何实验室培训水平的操作员使用该方案获得。

在执行此方案时，快速工作以避免细胞死亡至关重要，尤其是在添加溶液 3 后，溶液 3 在室温下对细胞有毒。此外，还必须轻柔处理细胞，以尽量减少损伤。该方案为分离 PBMC、EDTA 血浆和血沉棕黄层提供了一种高效、易于遵循的方法。

这些免疫细胞可用于广泛的实验和化验，重点是免疫系统在不同生物环境中的作用。