Name: 局部弹性蛋白酶和口服 β-氨基丙腈联合小鼠高级腹主动脉瘤建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解弹性蛋白酶与BAPN联合诱导的小鼠腹主动脉瘤建模方法。该技术成功复制人类疾病特征，包括瘤体扩张、血栓形成及破裂风险，为开发新药物治疗方案提供可靠研究平台。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）资助，项目编号为1R01HL149404-01A1（BL），以及由露丝·L·卡什斯坦国家研究服务奖T32 HL 007936资助威斯康星大学麦迪逊分校心血管研究中心（JB）。图表使用Biorender.com创建或编辑。统计分析采用GraphPad Prism 10软件进行。

动物实验方案已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会（M005792）的批准。
1. 动物维持
<ol>
	<li>将小鼠饲养在标准维持饲料上。使用成年或青年成年小鼠（8–12 周龄）。 
	注意：使用成年动物可确保其已达到完全成熟，从而排除主动脉直径变化与动物生长相关的可能性。在本研究中，我们使用了在手术时年龄为 22–24 周的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠。Lu 及其同事未观察到年轻与年老小鼠在动脉瘤反应方面存在显著差异8。此外，尽管大多数动脉瘤模型研究使用雄性小鼠，但该模型在雄性和雌性小鼠中均能成功诱导腹主动脉瘤（AAA）9。</li>
	<li>确定研究持续时间，并将动物分配至治疗组或假手术（对照）组。给予治疗组小鼠含 0.2% BAPN 的饮用水，并在手术中将活性弹性蛋白酶局部应用于肾下腹主动脉。对照组动物给予未经处理的饮用水，并在手术中将变性弹性蛋白酶应用于肾下腹主动脉。</li>
</ol>
2. 启用含β-氨基丙腈（BAPN）的饮用水
<ol>
	<li>手术前两天，开始给小鼠喂食含0.2% BAPN的饮用水。将BAPN水配制成较大体积，并在避光条件下于4 °C保存，最长可保存28天。给小鼠饮用前，务必确保BAPN水已恢复至室温。 
	注意：建议在整个研究期间，每7天更换一次笼内的BAPN水。</li>
</ol>
3. 手术当天材料准备
<ol>
	<li>将外科手套切成 5 mm × 10 mm 的条状，后续用于弹性蛋白酶处理前分离主动脉。通过在外科手术单中央剪出一个约 1.5 cm × 3 cm 的椭圆形开口来制备手术洞巾。将 2 英寸 × 2 英寸的纱布展开并剪成两半，制成约 2.5 cm × 10 cm 的纱布条，后续用于牵拉腹腔内容物。对所有外科器械（见材料表）进行高压灭菌，并按照图 1所示示例设置无菌手术区域。</li>
</ol>
<img alt="手术显微镜设置；带有外部光源的实验操作中标注的工具和耗材。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：腹主动脉瘤弹力蛋白酶/BAPN 小鼠模型术前无菌手术设置示例。 缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>准备一个术后恢复笼，将一个干净的笼子放在加热灯下，并将生理盐水放置在灯旁以预热至体温（37 °C）。确保加热灯位置安全，使恢复笼和生理盐水保持温暖但不超过37 °C。打开水泵，开始通过加热垫循环温水。</li>
</ol>
4. 手术动物准备
<ol>
	<li>将小鼠放入诱导室，使用低流量电子蒸发器以 200 mL/min 的流速给予 5% 异氟烷进行麻醉。麻醉期间，称量每只小鼠的体重，并皮下注射 0.6 mg/kg 的缓释布托啡诺和 20 mg/kg 的卡洛芬以提供镇痛。使用电动毛发修剪器剪除从下腹部至剑突下方区域的腹部毛发。用纱布或实验室擦拭纸清除多余的毛发。将小鼠放回笼中，在继续手术前至少等待 20 分钟，以确保镇痛药物起效。</li>
	<li>自给予镇痛药物至少 20 分钟后，将小鼠再次放入麻醉诱导室，使用低流量电子蒸发器以 200 mL/min 的流速给予 5% 异氟烷，直至小鼠进入镇静状态。</li>
	<li>将镇静后的小鼠从诱导室中取出，仰卧位放置于手术区域。涂抹眼用凝胶，并用外科胶带固定鼻罩。将吸入的异氟烷浓度降低至维持剂量 1–2%，流速调至 50 mL/min。使用外科胶带固定小鼠的前肢和后肢。</li>
	<li>检查小鼠下腹部以定位膀胱。用拇指、食指和中指轻轻对膀胱施加外部压力以诱导排尿；同时使用一块纱布吸除尿液。 
	注意：注意避免污染手术区域。</li>
	<li>开始对腹部进行消毒，使用含碘或氯己定的擦洗剂及 70% 酒精棉签。从腹部中心开始，向外做环形擦拭，重复 3 次。每次擦拭之间让皮肤短暂干燥。</li>
	<li>通过检查足趾夹捏反应缺失来确认麻醉深度是否足够。确保鼻罩和四肢已固定。将手术巾覆盖在小鼠身上，开口正对已准备好的手术腹部区域。 
	注意：不要拖动手术巾跨越小鼠身体，以避免潜在污染。</li>
</ol>
5. 腹主动脉瘤的手术诱导
<ol>
	<li>进入腹腔：
	<ol>
		<li>洗手并佩戴干净的丁腈手套或无菌外科手套。接触手术区域前，务必用70%乙醇喷洒手套，并揉搓双手直至干燥。</li>
		<li>用钝头镊子在腹部正中提起皮肤。使用手术刀在腹部正中做一长约2-3 cm的纵向切口。</li>
		<li>使用镊子提起腹直肌，以辨认半透明的白线。用剪刀经白线切开进入腹腔，然后沿白线向近端和远端延伸切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露腹主动脉：
	<ol>
		<li>用温热的生理盐水浸湿一块纱布条和两根棉签。将纱布一端紧密地卷至一半，留出较长的尾端，制成腹部卷纱。</li>
		<li>使用皮肤牵开器牵开右侧腹壁。</li>
		<li>使用湿润的棉签，通过轻柔地将小肠和大肠扫向左上腹象限，进行右侧内脏中线旁旋转，以暴露并观察主动脉和下腔静脉（IVC）。使用腹部垫卷将肠管移出视野。 – 将纱布的卷曲端塞入肠管下方，然后将尾端绕过并引出体外，轻柔包裹肠管。对纱布尾端施加轻柔张力，以使肠管保持在视野外。调整腹部卷垫和皮肤牵开器，以获得最佳的腹膜后器官视野，如图所示。 图2A. 
		注意：腹部卷垫有助于保持肠管湿润，并防止其被手术器械意外损伤。操作过程中应确保纱布保持湿润，以防肠管干燥。牵拉肠管时切勿用力过猛，以免导致肠系膜上动脉及肠管血管发生扭曲，进而可能引起缺血性损伤。此外，在初次拨动小肠时，需注意大肠与肝脏下缘之间可能存在一条纤细且半透明的连接结构（肝结肠韧带），若操作不慎，易将其从肝包膜撕脱，导致出血。若牵拉时该韧带张力较大，可用剪刀将其锐性切断。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="展示腹部准备、牵开器放置以及腹膜后手术步骤的外科手术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：腹部牵拉及暴露小鼠肾下腹主动脉的最佳手术视野示意图。（A）放置纱布腹卷有助于牵开腹腔内器官，同时使用对侧牵开器以更好地显露腹膜后间隙。在麻醉动物体表覆盖无菌手术巾（透明显示动物方位），以维持无菌环境。（B）腹膜后筋膜（绿色框）位于腹主动脉前方。（C）剥离腹膜后筋膜后显露肾下腹主动脉的实例。可通过起始于左肾静脉前方横跨处稍远端的腹主动脉与下腔静脉之间的潜在间隙（黄色圆圈），实现腹主动脉与下腔静脉的分离。缩写：IVC = 下腔静脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>腹主动脉肾下段的环周游离与分离：
	<ol>
		<li>确认下腔静脉（IVC）和肾下腹主动脉完全暴露。首先切开并分离后腹膜（RP）筋膜，以显露主动脉（图2B）。辨认沿肾下腹主动脉前壁走行的性腺（睾丸或卵巢）动脉（图2B 和 图3）。使用镊子钝性分离性腺动脉之间的筋膜，并沿纵行方向继续分离，以充分暴露主动脉前壁（图2C）。 
		注意：后腹膜筋膜是一层薄而半透明的结缔组织，内含淋巴管和内脏神经丛。必须通过该筋膜以暴露主动脉，但切勿深入至主动脉外膜的结缔组织层。若外膜（白色结缔组织）发生撕裂，将暴露出中膜（呈鲜红色），在后续应用弹性蛋白酶后，该部位极可能发生主动脉破裂。</li>
		<li>接下来，开始将腹主动脉从下腔静脉（IVC）上分离。从左肾静脉跨越主动脉处下方、IVC与主动脉之间的一个微小间隙开始分离（图2C）。使用镊子尖端轻柔地分开主动脉与IVC之间的结缔组织纤维，并在此水平围绕主动脉进行环周分离。 
		注意：IVC管壁极薄，且通过一层纤细的纤维结缔组织紧密贴附于主动脉。操作过程中应尽量避免触碰或清理IVC。优先将主动脉右侧从IVC上分离（在处理主动脉左侧周围肌肉组织之前），有助于使主动脉自然“远离”IVC。</li>
		<li>继续钝性分离主动脉与IVC之间的组织平面，向尾侧推进至主动脉分叉处。到达主动脉分叉后，停止进一步向远端分离。 
		注意：分离过程中需特别小心肠系膜下动脉（IMA），该动脉通常位于肾下主动脉中段附近，并横向跨越IVC走行。</li>
		<li>当主动脉右侧边缘已与IVC完全分离后，向近端返回至左肾静脉水平。将后腹膜筋膜从主动脉左侧外缘剥离，并围绕主动脉进行环周分离，直至主动脉完全游离。相关后腹膜解剖结构可参见 图3。 
		注意：在主动脉后方进行分离时需格外谨慎，因为腰静脉和腰动脉的位置与数量存在高度个体差异。出血高风险区域可参见 图4 作为参考。</li>
		<li>仔细检查主动脉是否已尽可能实现与IVC及周围肌肉组织的环周完全分离，尤其注意在肠系膜下动脉和腰动脉固定部位周围进行精细解剖。</li>
		<li>按照 图5A 所示，在主动脉左右两侧边缘放置手套条带。应尽可能覆盖更多的IVC区域。</li>
		<li>使用手持卡尺测量主动脉最宽处直径，并记录三次测量值。测量前后均需用70%乙醇喷洒卡尺尖端。避免卡尺尖端直接接触主动脉，以防污染。 
		注意：也可采用配备校准功能的显微成像系统进行拍照记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示肾血管、动脉、静脉、淋巴管和肠道的腹部血管解剖图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠下腹部、骨盆及腹膜后区域血液供应的解剖结构。缩写：R = 右侧；L = 左侧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示静脉从主动脉发出的腹部静脉解剖图，标注了分支。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：腹膜后分离及肾下腹主动脉环周游离过程中，易发生损伤和出血的高风险部位。 缩写：L = 左侧；IMA = 肠系膜下动脉。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于评估手术精度的牙种植体植入示意图，包含测量数据和切口标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在弹性蛋白酶/BAPN 小鼠腹主动脉瘤模型中，应用弹性蛋白酶或假处理后的术中反应。 （A）在应用弹性蛋白酶前，将手套材料片段沿腹主动脉长度放置，以保护下腔静脉（IVC）和肠道免受弹性蛋白酶暴露，同时使腹主动脉充分接触弹性蛋白酶。（B）局部应用变性弹性蛋白酶不会引起主动脉扩张（蓝色框）。该例中，主动脉最大直径在基线时为 0.627 mm，局部应用变性弹性蛋白酶 5 分钟后为 0.607 mm。（C）应用活性弹性蛋白酶处理 5 分钟后引起主动脉扩张。本例中，主动脉（绿色）从 0.607 mm 扩张至 0.953 mm，直径增加 57%。缩写：BAPN = ß-氨基丙腈；AAA = 腹主动脉瘤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>弹性蛋白酶应用：
	<ol>
		<li>使用棉签轻轻蘸去主动脉上的多余血液或液体。</li>
		<li>接着，将一块 10 mm × 2 mm 的干纱布覆盖在主动脉上。用移液器滴加 5 µL 弹性蛋白酶（或对照用变性弹性蛋白酶）以浸透纱布和主动脉。轻轻地将手套碎片包裹在主动脉周围。 
		注意：为制备假手术组或对照组所用的变性弹性蛋白酶，需将弹性蛋白酶在 100 °C 下煮沸 30 分钟。</li>
		<li>让弹性蛋白酶作用于主动脉 5 分钟。在此孵育期间，如有需要，可适当放松腹部卷垫和皮肤牵开器所施加的张力。 
		注意：由于弹性蛋白酶存在批次差异，建议研究者在同一项研究中使用同一瓶弹性蛋白酶。每次启用新批次的弹性蛋白酶时，建议进行剂量-反应实验，以确保不会出现过多早期破裂（发生在 4 周前）。根据弹性蛋白酶的反应情况，其作用时间也可在 4 至 6 分钟之间调整。</li>
		<li>5 分钟后，重新固定肠管牵拉装置，并展开包裹的手套碎片。用 1 mL 温热的 0.9% 无菌生理盐水冲洗腹腔，同时小心地将纱布和手套碎片从主动脉上移除。用 10 mm × 10 mm 纱布吸干腹腔内的盐水。重复冲洗腹腔，共进行 3 次，每次 1 mL。</li>
		<li>使用手持式卡尺重新测量弹性蛋白酶处理后主动脉的最大直径，并重复记录 3 次。参见 图 5B、C 以了解假手术组和活性弹性蛋白酶处理后主动脉扩张的示例。 
		注意：可利用三次处理前与处理后的测量平均值来计算主动脉直径的变化百分比。通常，在弹性蛋白酶处理后立即可见明显的扩张，约为 30–50%，这有助于确认弹性蛋白酶具有活性且主动脉得到了充分处理。使用变性弹性蛋白酶处理时，主动脉直径应无明显变化，或可能略有缩小（可能由于痉挛所致）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭腹腔：
	<ol>
		<li>小心地将腹部卷垫从肠管下方及体内取出。必要时，在肠管表面额外滴加生理盐水，以防取出过程中肠管粘连。检查确认肠管呈粉红色且血供良好。 
		注意：无需尝试将肠管复位至原始解剖位置；此举可能导致肠扭转或内疝等风险。</li>
		<li>使用连续缝合的 5-0 非吸收性单股缝线闭合腹壁筋膜。用 3–4 枚皮肤钉合器关闭皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 术后动物护理
<ol>
	<li>将小鼠放入带有加热灯的恢复笼中。确保笼内温度温暖，但不灼热。</li>
	<li>皮下注射 0.5–1 mL 的 0.9% 生理盐水液体推注。</li>
	<li>根据机构规程，让小鼠在加温的笼中单独恢复约 20 分钟，直至恢复活动，然后移回饲养笼。</li>
	<li>根据机构规程，在术后第 1 天手术后 24 小时给予卡洛芬 20 mg/kg，并持续每日给药 3 天。</li>
</ol>
7. 主动脉测量与组织采集
<ol>
	<li>使用异氟烷实施安乐死后进行颈椎脱位，重新打开腹腔。切口延伸至胸骨以进入胸腔。在2分钟内，用10 mL冷的1%杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）溶液灌注左心室，并切除右心房。切除肺、肝和脾。
	 
	注意：操作时需小心避免损伤肠道；肠内容物溢出可能影响组织分析。</li>
	<li>暴露腹主动脉，并如上所述测量肾下主动脉的最大直径。继续解剖整个主动脉和心脏。当心脏和主动脉被分离后，切断所有动脉分支以及髂总动脉，仅在主动脉上保留较短的残端。将心脏和主动脉置于带有对比背景的尺子旁并拍照记录。</li>
</ol>
8. 数据分析与报告
<ol>
	<li>为减少人为误差，使用手持卡尺测量主动脉直径时，每次至少重复测量3次，然后以平均值作为报告结果。</li>
	<li>将腹主动脉瘤（AAA）定义为健康主动脉直径增加50%。研究结果中须同时包含主动脉的绝对直径值及直径变化的百分比。</li>
</ol>

Abdominal Aortic Aneurysm Development in Mice Using the Elastase and BAPN Method

<ol><li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li>
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<li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608(2022).</li>
</ol>

本文作者声明无任何利益冲突。

深入了解腹主动脉瘤（AAA）复杂的病理生理机制，对于改善主动脉瘤疾病的管理至关重要。尽管目前正积极开发新的策略以提高手术治疗效果，但腹主动脉瘤在老龄化社会中仍十分普遍，动脉瘤破裂仍是美国的主要死亡原因之一10。因此，针对腹主动脉瘤在检测、预防和治疗策略方面的未满足需求，亟需进一步开展基础性动脉瘤研究11。
能够准确且高效地重现人类腹主动脉瘤（AAA）特征和行为的动物模型，对于动脉瘤病理生理机制的研究以及潜在治疗靶点的发现至关重要。尽管现有的动物模型可以模拟人类疾病中动脉瘤改变的主要方面，但尚无单一模型能够完全代表人类AAA的真实复杂性。目前，小鼠是动物AAA建模中最广泛接受的物种。研究人员应根据各自动脉瘤研究的具体需求，权衡不同小鼠模型的各种优缺点，例如Daugherty等和Busch等综述中详尽描述的内容12,13。
1990年，Anidjar 等人首次描述了使用弹性蛋白酶在啮齿类动物中诱导腹主动脉瘤（AAA）的方法14。通过注射泵将猪胰弹性蛋白酶灌注至主动脉，可使血管初始扩张约50%至70%，且扩张节段能良好地表现出与人类腹主动脉瘤相似的病理特征，如中膜退行性变和外膜炎症。然而，经典的灌注模型在技术上可能是最具挑战性的动脉瘤模型，且通常在第二周形成动脉瘤后，其大小会逐渐缩小。2012年，Bhamidipati 等人进一步证明，将弹性蛋白酶应用于外膜也可成功诱导出大小更可重复的类似动脉瘤15。由于技术难度显著降低，局部应用弹性蛋白酶模型在动脉瘤研究中被广泛采用。Xue 及其同事在方法学论文中进一步讨论了该模型的其他技术细节及其优势16。
2017年，Lu及其同事开发了小鼠腹主动脉瘤的弹性蛋白酶/BAPN模型8。通过给予含0.2% BAPN的饮用水，该模型在很大程度上改进了传统局部应用弹性蛋白酶模型的诸多不足，能够持续诱导动脉瘤扩张直至破裂。在他们2017年的研究中，弹性蛋白酶/BAPN处理组小鼠的腹主动脉瘤形成率显著高于仅使用弹性蛋白酶组（93% vs 65%，P &#60; 0.01），且形成的动脉瘤病变更晚期。在为期100天的研究期间，弹性蛋白酶/BAPN组小鼠的腹主动脉瘤持续扩张至超过基线直径的&#62;800%，并形成管腔内血栓（53.8%），46.2%的小鼠在实验结束前发生自发性破裂。该模型使研究人员能够深入探究随时间推移影响动脉瘤进展和稳定性的各种因素。
Berman 等人通过改变外用弹性蛋白酶的浓度、研究持续时间、BAPN 给药时机以及动物性别的影响，进一步探索了弹性蛋白酶/BAPN 模型9。在56天内，使用较高浓度的弹性蛋白酶（5 mg/mL 或 10 mg/mL）5 µL处理，所产生的动脉瘤大于2.5 mg/mL处理组。腔内血栓形成的发病率也依赖于弹性蛋白酶的浓度，在5 mg/mL处理的小鼠中为28.6%，在10 mg/mL处理的小鼠中则为62.5%。他们还证明了弹性蛋白酶/BAPN 模型可在雌性小鼠中诱导形成动脉瘤。尽管仅研究了少量雌性小鼠（n=5），但发现雌性小鼠的动脉瘤更易破裂（5只中有2只），且在56天时显著大于雄性小鼠的腹主动脉瘤（AAA）。
本文旨在提供一种方法，以解决手术建模中最大的局限性之一，即手术操作过程的变异性。由于在解剖程度以及弹性蛋白酶处理腹主动脉的范围方面缺乏明确共识，该模型的结果可能在不同动物、研究者及研究机构之间存在显著差异。我们观察到小鼠之间存在多种解剖学变异，包括腰动脉和腰静脉的数量与大小、肠系膜下动脉（IMA）的位置、左性腺静脉的起始位置等，这些因素在尝试仅处理肾下腹主动脉的特定部分或节段时可能构成限制。本文中，我们证明：从近端左肾动脉至远端主动脉分叉处，对整个肾下腹主动脉进行环周解剖，有助于在存在解剖差异的情况下实现可重复的主动脉暴露程度，同时提高动脉瘤诱导的成功率，并为操作者提供清晰的操作边界。此外，下腔静脉（IVC）体积较大且位置更偏前，往往覆盖了主动脉的大部分区域，若不将其与主动脉分离，则可能影响主动脉被处理的范围。虽然有必要去除后腹膜筋膜以暴露主动脉，但重要的是不应将外膜的结缔组织完全从主动脉上剥离，避免暴露任何中膜层，因为这通常会导致在5分钟弹性蛋白酶孵育期间发生破裂。这一现象可作为该模型中解剖程度的额外内部对照，但在初次采用该模型时可能带来较大的学习难度。操作者还将了解到手术过程中容易损伤并导致难以控制的大出血的高风险区域（图4）。
尽管该模型的操作步骤需要保持一致，但研究持续时间和间隔超声检查的时间可根据研究目的而有所不同。主动脉扩张在应用弹性蛋白酶后立即开始，然而使用该模型的研究通常如本示例实验所示，在术后观察小鼠28天7。当研究进展期腹主动脉瘤、长期生长、管腔内血栓形成或破裂时，应考虑延长研究时间。
其他围手术期措施，例如维持动物体温和水合状态，有助于提高动物在接受这种侵入性手术后的存活率。术中使用加热垫以及术后将动物置于温暖的恢复笼中，有助于避免低体温。用于冲洗腹腔的生理盐水应在使用前预热。手术后立即皮下注射一次性的液体剂量，可弥补手术期间无法察觉的体液丢失，并帮助动物在术后即刻恢复阶段维持充分的水合状态。若操作时仔细处理组织，并采用一致且系统化的方法，经验丰富的操作者可在每只小鼠30至45分钟内完成弹性蛋白酶/BAPN模型的制备，并稳定诱导腹主动脉瘤（AAA），且围手术期并发症发生率极低。
我们的结果表明，在应用弹性蛋白酶之前，联合使用BAPN并对肾下主动脉进行环周分离，可诱导形成体积更大、持续扩张的腹主动脉瘤（AAA），且在更短时间内达到更大的直径并出现更高的破裂率。在本实验中，所有接受活性弹性蛋白酶处理的雄性（6只中的6只）和雌性（6只中的6只）小鼠均成功诱导出AAA。弹性蛋白酶暴露5分钟即可使主动脉直径立即增加约30–40%，这一变化有助于确认各处理组中弹性蛋白酶应用的成功性和一致性。与Berman等人的研究类似，我们证明该模型可在雌性小鼠中诱导AAA，且雌性小鼠的破裂反应强于雄性。在28天内，一半的雌性小鼠（6只中的3只）发生破裂，而雄性小鼠无一破裂（0/6），但雌性小鼠的体重低于雄性。与雄性对照组相比，雄性小鼠的AAA直径增加了257%（对照组为-4%），而存活的雌性小鼠直径增加了417%（对照组为-16%）。由于雌性组破裂数量较多，在第28天时，存活的雄性和雌性处理小鼠之间的主动脉直径差异无统计学意义。我们推测，假手术小鼠在研究结束时主动脉直径较小，是因为在初始解剖过程中主动脉会轻微扩张，随后在28天时形成瘢痕组织。
弹性蛋白酶/BAPN 模型存在一定的局限性。主动脉的环周剥离需要精细的外科技术，但有助于提高实验的可重复性以及动脉瘤诱导的程度。与局部应用弹性蛋白酶模型类似，弹性蛋白酶的酶活性也存在批次效应，因此如前所述，在同一实验中对所有动物应使用同一瓶弹性蛋白酶。尽管腹主动脉瘤腔内血栓形成和破裂的发生率随时间延长和动脉瘤严重程度增加而升高，但在该模型中这些情况并非必然发生，也无法完全预测。
综上所述，弹性蛋白酶/BAPN 模型可在雄性和雌性小鼠中诱导出较大且真实的肾下腹主动脉瘤，其随时间推移逐渐扩张，形成管腔内血栓，并可能发生破裂。该小鼠模型的这些优势有助于更好地重现人类动脉瘤的某些行为和特征。尽管该技术操作难度较高，但仔细而彻底地解剖主动脉可增强动脉瘤样改变的反应。目前，弹性蛋白酶/BAPN 方法是一种研究肾下腹主动脉瘤的先进模型。

动脉瘤被定义为血管的病理性扩张，其直径超过正常血管直径的50%1尽管腹主动脉瘤（AAA）在老年人群中是一种常见疾病，其发病率约为 &#62;5% 的雄性个体 &#62; 65岁，目前尚无针对腹主动脉瘤（AAA）的定向治疗策略1目前，腹主动脉瘤的管理仅限于危险因素控制，以及根据主动脉直径或生长速率选择开放手术或腔内血管修复术进行外科治疗2AAA最大的危险是动脉瘤破裂，若不及时治疗则可能致命，而在急诊情况下进行修复手术的死亡风险可高达90%以上。1.
腹主动脉瘤（AAA）的病理生理机制复杂、多因素参与，且尚未完全阐明3。人类腹主动脉瘤的特征包括主动脉壁真正的动脉瘤样扩张，伴有炎性细胞浸润、管腔内血栓形成，以及持续扩张最终导致破裂3,4。此外，腹主动脉瘤与高龄相关，男女比例约为9:1，最常发生在肾下腹主动脉5。在动物模型中模拟人类腹主动脉瘤的全部特征和行为仍是当前持续面临的挑战6。
目前，腹主动脉瘤（AAA）的建模主要在小鼠中进行，通常采用以下三种方法之一诱导动脉瘤：通过皮下植入的渗透压泵输注血管紧张素II（AngII），或直接将氯化钙（CaCl2）或弹性蛋白酶应用于腹主动脉7。在后一种方法中，将猪胰弹性蛋白酶（PPE）应用于肾下腹主动脉的一段，导致血管中膜弹性膜层中的弹性纤维发生酶解性降解。这种结构损伤会削弱主动脉壁，从而引起向外的动脉瘤样扩张。然而，单独使用外用弹性蛋白酶产生的肾下动脉瘤相对较小，且随时间推移无法持续扩大或破裂。最近，Lu 等人对该模型进行了改进，在弹性蛋白酶处理的小鼠中额外给予β-氨基丙腈（BAPN），后者是赖氨酰氧化酶的一种不可逆抑制剂8。通过抑制弹性蛋白和胶原纤维的交联，BAPN的补充使弹性蛋白酶损伤的主动脉持续扩张直至破裂。与单纯外用弹性蛋白酶模型相比，弹性蛋白酶/BAPN联合模型的AAA发生率更高，所产生的动脉瘤也更大，并伴有管腔内血栓形成8。
在弹性蛋白酶/BAPN 模型中，手术分离的程度以及腹主动脉暴露于弹性蛋白酶的情况可能影响该模型的成功率和可重复性。本文中，我们描述了在完整游离整个肾下腹主动脉节段后，通过联合使用含 BAPN 的饮用水和局部应用弹性蛋白酶于腹主动脉的方法，可提高模型的可重复性，兼顾动物间的解剖学差异，并获得更高的腹主动脉瘤诱导率、更大的动脉瘤尺寸以及更高的破裂发生率。本文将介绍一种标准化的方法，通过局部应用弹性蛋白酶并结合饮用 BAPN 添加水，以稳定诱导小鼠发生进展期腹主动脉瘤。

<table><tbody><tr><td>0.5 L 麻醉诱导室</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-0530XXS</td><td>麻醉诱导室</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP，20 mL</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>生理盐水</td></tr><tr><td>3 mL 带 BD PrecisionGlide 针头（22 G × 3/4）的鲁尔锁扣式注射器</td><td>BD</td><td>REF 309569</td><td>注射器，22 G 针头</td></tr><tr><td>富马酸氨基丙腈</td><td>TCI</td><td>A0796</td><td>BAPN</td></tr><tr><td>富马酸氨基丙腈盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3134-25G</td><td>BAPN</td></tr><tr><td>Avant Delux 纱布敷料，2&quot; × 2&quot;，4 层</td><td>Medline</td><td>NON26224</td><td>纱布敷料</td></tr><tr><td>推剪式剃毛器</td><td>Whal Clipper Corporation</td><td>8110</td><td>毛发修剪器</td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液（7.5%）</td><td>Avrio</td><td>NCD 67618-154-16</td><td>聚维酮碘外科洗手液</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5130</td><td>钝头镊子</td></tr><tr><td>Buprenorphine ER-lab</td><td>ZooPharm</td><td>BERLAB0.5</td><td>丁丙诺啡</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-131-11</td><td>卡洛芬</td></tr><tr><td>CASTROVIEJO 5.75&quot; 直型带锁针持</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6412</td><td>Castroviejo 缝合针持</td></tr><tr><td>棉签木棒，6&quot;</td><td>Dynarex</td><td>No. 4302</td><td>棉签木棒</td></tr><tr><td>DESMARRES 5.5' 拉钩&amp;nbsp;</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6672</td><td>皮肤拉钩&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数显卡尺，0–150 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td>数显卡尺</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>猪胰弹性蛋白酶 I 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1250-10MG</td><td>弹性蛋白酶 &gt;4.0 单位/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td>稀释至 70% 的乙醇</td></tr><tr><td>眼用润滑膏</td><td>Optixcare</td><td>14716</td><td>眼用润滑膏</td></tr><tr><td>Germinator 500 干热灭菌器</td><td>CellPoint Scientific, Inc</td><td>5-1450</td><td>干珠灭菌器</td></tr><tr><td>热疗垫</td><td>Adroit Medical Systems</td><td>V016</td><td>热疗垫</td></tr><tr><td>热疗泵</td><td>Adroit Medical Systems</td><td>HTP-1500</td><td>热疗泵</td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>NCD 59399-106-01</td><td>异氟烷</td></tr><tr><td>L-10 移液器</td><td>Rainin</td><td>LTS 0.5-10 uL</td><td>移液器</td></tr><tr><td>低轮廓麻醉面罩，小号</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-0801</td><td>麻醉鼻罩</td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5619</td><td>显微解剖剪</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Nii-LED 高强度 LED 照明器，LED 外置光源</td><td>Nikon Instruments, Inc</td><td>83359 NII-LED</td><td>外部解剖光源</td></tr><tr><td>5-0 单股尼龙线，黑色不可吸收缝线</td><td>Oasis</td><td>MV-661-V</td><td>5-0 尼龙缝线</td></tr><tr><td>聚异戊二烯外科手套，GAMMEX 无乳胶 PI 微型，7.5 号</td><td>Ansell</td><td>20685975</td><td>无乳胶外科手套</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm 不锈钢伤口夹</td><td>CellPoint Scientific, Inc</td><td>203-1000</td><td>伤口夹</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Ohaus</td><td>Compass CR2200</td><td>电子天平</td></tr><tr><td>SomnofFlo 配件套装</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>10-8000-71</td><td>电子蒸发器用导管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SomnoFlo 电子蒸发器</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SF2992</td><td>低流量电子蒸发器</td></tr><tr><td>SomnoPath 流量分流器</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SP1016</td><td>电子蒸发器用流量分流器</td></tr><tr><td>SS/45 锐头镊子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4941</td><td>锐头镊子</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6010SC</td><td>手术剪</td></tr><tr><td>血管钳</td><td>Dumont</td><td>VES 0.35</td><td>血管钳</td></tr></tbody></table>

通过局部弹性蛋白酶联合口服β-氨基丙腈在小鼠中建立高级腹主动脉瘤模型

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

通过将局部应用弹性蛋白酶的小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型与添加β-氨基丙腈（BAPN）的饮用水相结合，可稳定诱导出具有类似人类AAA特征的真实肾下主动脉瘤。在肾下腹主动脉外膜局部应用弹性蛋白酶，可导致主动脉壁弹性层结构损伤，并启动动脉瘤样扩张。联合给予BAPN（一种赖氨酰氧化酶抑制剂），可通过减少胶原蛋白和弹性蛋白的交联，促进血管壁持续退变。该联合方法可形成显著扩大的AAA，其呈现进行性扩张、管腔内血栓形成，并具备破裂能力。优化手术技术，例如完整环周游离整个肾下主动脉节段，有助于在不同操作者及小鼠解剖结构差异的情况下，实现猪胰弹性蛋白酶的一致且充分的应用，从而标准化手术流程。因此，弹性蛋白酶/BAPN模型是一种改进的小鼠AAA手术诱导方法，更接近人类动脉瘤的病理特征，为研究动脉瘤生长及破裂风险提供了更有价值的实验平台。

雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠，年龄为 22–24 周，用于本研究。肾下腹主动脉经处理后 5 µL 弹性蛋白酶（6.9 mg蛋白/mL，6单位/mg蛋白）或变性弹性蛋白酶处理5分钟。经弹性蛋白酶处理的雄性小鼠在处理5分钟后主动脉直径较未处理基线值增加43.4%，而雌性小鼠主动脉直径增加33.6%（P = 0.0342）。假手术组小鼠在暴露于变性弹性蛋白酶5分钟内主动脉直径基本无变化（雄性增加0.5%；雌性减少2.8%）。12只处理组和6只假手术组小鼠均无手术相关死亡。28天研究的数据如下所示 表1在雌性治疗组小鼠中，6只中有3只因腹主动脉瘤破裂死亡，分别发生在术后第20天和第25天（其中1只于第20天死亡，2只于第25天死亡）图6）。在治疗的男性中未发生腹主动脉瘤破裂。腹主动脉瘤（定义为直径增大 &gt;50%的基线主动脉直径或因腹主动脉瘤破裂导致死亡）在所有经处理的小鼠（12只中的12只）中均成功诱导。在第28天，经处理的雄性小鼠平均腹主动脉瘤直径为2.86 ± 0.31 mm，平均直径变化百分比为257 ± 54%；而存活的经处理雌性小鼠的腹主动脉瘤直径为3.60 ± 1.87 mm，平均直径变化百分比为417 ± 286%（图7假手术小鼠的主动脉直径相对无明显变化。
<img alt="B6小鼠横截面的生存分析图，显示第28天器官发育比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：在为期28天的弹性蛋白酶/BAPN腹主动脉瘤（AAA）模型中，雄性和雌性B6小鼠的存活情况。（A）在6只经处理的雌性小鼠中，有3只发生了AAA破裂（1只在第20天，另2只在第25天），而在28天时，6只经处理的雄性小鼠均未发生破裂。（B）因AAA破裂死亡的雌性小鼠在尸检时的代表性图像。AAA破裂表现为明显的腹膜后血肿（左图）以及肾下腹主动脉瘤伴血管壁缺损（右图）。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="主动脉直径结果；柱状图和解剖样本；假手术组与弹性蛋白酶/BAPN处理组比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：弹性蛋白酶/BAPN处理组与假手术组雄性和雌性B6小鼠在第28天的最大主动脉直径。（A）与假手术组相比，处理组小鼠在第28天的肾下主动脉直径显著增大。（B）弹性蛋白酶与BAPN联合处理可在雄性和雌性B6小鼠中成功诱导形成较大的肾下腹主动脉瘤（AAA）。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3"></td>
			<td>B6 雄性假手术组</td>
			<td>B6 雌性假手术组</td>
			<td>B6 雄性弹性蛋白酶/BAPN处理组</td>
			<td>B6 雌性弹性蛋白酶/BAPN处理组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">小鼠数量</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">年龄（周）</td>
			<td>22.3 ± 0.0</td>
			<td>22.7 ± 0.7</td>
			<td>23.1 ± 0.2</td>
			<td>23.2 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">体重（g；手术时）</td>
			<td>36.3 ± 2.5</td>
			<td>23.7 ± 1.2</td>
			<td>32.8 ± 1.7*</td>
			<td>23.7 ± 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">治疗前主动脉直径（mm）</td>
			<td>0.89 ± 0.02</td>
			<td>0.75 ± 0.04</td>
			<td>0.81 ± 0.07</td>
			<td>0.73 ± 0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">治疗后主动脉直径（mm）</td>
			<td>0.90 ± 0.03</td>
			<td>0.73 ± 0.01</td>
			<td>1.15 ± 0.03**</td>
			<td>0.98 ± 0.12**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">治疗5分钟后直径变化百分比（%）</td>
			<td>0.5 ± 4.4</td>
			<td>-2.8 ± 5.3</td>
			<td>43.4 ± 10.2***</td>
			<td>33.6 ± 4.5***</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">腹主动脉瘤发生率（%）</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">28天内腹主动脉瘤破裂数</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">存活至28天</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">28天时最大主动脉直径（mm）</td>
			<td>0.85 ± 0.01</td>
			<td>0.64 ± 0.01</td>
			<td>2.86 ± 0.31*</td>
			<td>3.60 ± 1.87**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">28天时主动脉直径变化百分比（%）</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：弹性蛋白酶/BAPN 小鼠腹主动脉瘤模型28天实验结果。 数据以均值±标准差表示。*P&lt;0.05，**P&lt;0.005，***P&lt;0.0001，通过单因素方差分析Fischer检验与同性别假手术组比较。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。

本方案介绍了一种系统性的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于肾下主动脉并经饮水给予ß-氨基丙腈，从而在小鼠体内建立晚期腹主动脉瘤模型。

局部弹性蛋白酶小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型在联合使用含β-氨基丙腈（BAPN）的饮用水时得到增强……

我们的研究旨在了解腹主动脉瘤的病理生理学机制，特别是从分子层面揭示动脉瘤破裂的过程。我们相信，通过在雄性和雌性小鼠中建立主动脉瘤模型，将有助于我们开发出针对这种亟需药物治疗的高致死性疾病的新疗法。腹主动脉瘤的病理生理机制具有多因素且复杂，这使得动物模型的建立较为困难。然而，弹性蛋白酶/BAPN模型可在小鼠中稳定诱导形成动脉瘤，该模型能够模拟人类疾病的多种特征和性质。通过将BAPN饮水与局部弹性蛋白酶手术相结合，可诱导形成较大的真性肾下动脉瘤，这些动脉瘤会形成腔内血栓，持续扩张，并最终破裂。这使得研究人员有机会研究破裂风险和动脉瘤生长等特征。

advanced-abdominal-aortic-aneurysm-modeling-mice-combination-topical

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

局部弹性蛋白酶和口服 β-氨基丙腈联合小鼠高级腹主动脉瘤建模

本视频展示了如何通过将猪胰弹性蛋白酶短暂灌注至小鼠腹主动脉肾下段管腔内，从而在小鼠体内诱导腹主动脉瘤（AAA）。由于存在大量转基因和基因敲除小鼠，该模型能够为AAA的病理生物学机制提供广泛深入的见解。...

利用弹性蛋白酶建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型

我们描述了一种手术方案，可稳定地在小鼠体内诱导形成显著的降胸主动脉瘤。该操作包括左侧开胸、暴露胸主动脉，并将浸有猪胰弹性蛋白酶的海绵放置于主动脉壁上。...

小鼠局部弹性蛋白酶诱导降胸主动脉瘤外科模型

该新型模型通过结合球囊血管成形术、弹性蛋白酶/胶原蛋白酶灌注、局部应用弹性蛋白酶以及口服化合物β-氨基丙腈（可干扰胶原交联）的方法，在猪体内成功构建了稳定的肾下腹主动脉瘤。...

肾下腹主动脉瘤的猪模型

本方案描述了一种标准化的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于小鼠肾下腹主动脉的外膜，以建立弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤（AAA）模型。...

通过血管周围应用弹性蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

本论文介绍了一种利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方案，该方法结合了既往建模技术的优点。此模型可用于研究腹主动脉瘤发生的病理生理机制。...

通过腹膜外氯化钙与弹性蛋白酶渗透建立的小鼠腹主动脉瘤模型

本方案提供了一种可重复且可靠的方法，通过弹性蛋白致敏联合血管周围应用弹性蛋白酶，在C57BL/6小鼠中诱导腹主动脉瘤（AAAs），建立包含免疫致敏成分的腹主动脉瘤模型。...

利用弹性蛋白致敏与血管周围弹性蛋白酶法可靠建立小鼠腹主动脉瘤模型

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小鼠横位主动脉缩窄术

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造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

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