高分辨率荧光测氧法评估人免疫细胞线粒体膜电位的动态变化

细胞在经历一段时间的生理应激后，若要维持正常功能并存活，必须能够满足恢复稳态所需的能量需求。在本实验室中，我们致力于探究线粒体如何响应并适应营养应激，以更深入地理解线粒体在介导疾病发生风险中的作用。目前检测PBMC生物能量学的方法包括在加入抑制剂和解偶联剂后测定其呼吸能力。

这些方法帮助我们了解了不同疾病状态下 PBMC 中重要的生物能量变化。膜电位对于 ATP 合成至关重要，并调控呼吸通量、活性氧以及自噬等过程。然而，关于线粒体呼吸和膜电位在生理底物浓度下如何共同响应 PBMC 中的变化，我们的认识仍然有限。

该技术的优势在于，能够对人外周血单个核细胞（PBMC）在线粒体膜电位和耗氧量方面对逐步增加的ADP水平的响应进行整合分析。该方法可用于量化线粒体对能量需求变化的敏感性。首先，根据制造商的说明，将0.5毫升检测室安装至O2k呼吸仪中。

打开仪器，并将其连接到提供的软件以进行数据采集。用去离子水清洗腔室三次。将水替换为0.54毫升MIR O-5，并完全关闭塞子。

除去多余缓冲液后，升起阻隔器，使室内的氧气与腔室中的氧气达到平衡。将柱子置于磁性细胞分选仪的磁场中，并用三毫升 RP-5 洗柱。将新分离的外周血单个核细胞（PBMC）沉淀重悬于 80 微升 RP-5 中，并加入 20 微升抗 CD14 磁珠。

将细胞在 4 摄氏度孵育 15 分钟。加入 1 毫升 RP-5 稀释细胞，然后将悬液加载到柱上。收集未标记的穿流细胞，流入已标记为“穿流一”的 15 毫升锥形管中。

用三毫升 RP-5 溶液洗涤柱子三次，收集流穿液体。小心将柱子从磁场中取出，置于新的 15 毫升锥形管上。加入五毫升 RP-5 后，将推杆插入柱子，以收集管中的内容物。

将流穿液离心后，使用抗CD3磁珠对细胞重复分离步骤，以获得T淋巴细胞。将含有CD3阳性T细胞和CD14阳性单核细胞的样品离心。弃去上清液后，将沉淀重悬于1毫升RP-5中。

使用血细胞计数板测定细胞浓度。将250万个单核细胞和500万个T细胞加入新的离心管中。离心收集细胞，并将其重悬于20 µL的MIR O-5中。

安装荧光传感器，并在 O2k 呼吸测量仪上启动实验文件。使用配备 AMR 滤光片组的绿色 LED 荧光传感器，将荧光计增益和光强均调节至 1,000。将反应室体积设置为 0.5 毫升。

调整布局以同时观察氧气通量和TMRM荧光。待氧气通量稳定后，根据制造商的方案进行空气氧校准。关闭封盖以密封反应室。

使用 Hamilton 注射器，将 2.5 微升 0.05 毫摩尔的四甲基罗丹明甲酯（TMRM）注入四次。每次注射分别对应 0、0.25、0.5、0.75 和 1.0 微摩尔 TMRM 的荧光信号，用于校准流速传感器。注入 20 微升 MIR O-5 以运行空白实验。

待氧通量稳定后，选择并标记氧通量和TMRM信号为“加细胞前”。加入20微升含有细胞的细胞悬液，测量约10分钟。然后选择并标记氧通量和TMRM信号为“加细胞后”。

然后依次对每种处理重复上述步骤，并正确标记氧通量和TMRM信号。待氧通量稳定后，加入1微升1.25毫摩尔的抗霉素A以抑制线粒体呼吸。对于每个空白实验，将样品前TMRM浓度设为1，以计算背景比率。

计算所有空白实验中TMRM的后续成比例下降以及平均背景比值。然后将样本实验的预样本TMRM值与每个样本实验每次加样对应的平均背景比值相乘。从样本测得的TMRM值中减去实验的背景值。

接下来，从每次加样的线粒体膜电位中减去FCCP背景校正后的值。为了标准化ADP驱动的下降值，将最高和最低膜电位分别设为100%和0%。然后将数据拟合到非线性回归模型中。

对健康志愿者来源的T细胞和单核细胞中ADP诱导变化的比较研究表明，与T细胞相比，单核细胞表现出更显著的线粒体膜电位下降。ADP对线粒体膜电位的半数抑制浓度在单核细胞中低于T细胞。在两种细胞类型中均未检测到氧消耗速率随ADP剂量增加而典型的响应性升高。