Name: 高分辨率荧光肺活测定法评估人免疫细胞中线粒体膜电位的动态变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习高分辨率荧光肺活测定法评估人免疫细胞中线粒体膜电位动态变化。该方法整合膜电位与耗氧量分析，揭示T细胞与单核细胞在能量需求下的不同线粒体适应性。

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我们衷心感谢为本项目献血的志愿者们。同时，我们诚挚感谢Ellen Schur博士及其团队向我们提供了他们研究中的额外样本。我们还要感谢Andrew Kirsh对稿件进行审阅并修改以提高可读性。本研究得到了以下资助项目的支持：P01AG001751、R01AG078279、P30AR074990、P30DK035816、P30DK017047、R01DK089036、K01HL154761、T32AG066574。

本文所述血液样本采集用于数据与方法开发，已获得华盛顿大学机构审查委员会的批准。代表性结果还包括来自杰克逊实验室购买的雄性 C57BL/6J 小鼠（5–7 月龄）的数据。所有动物实验程序均经华盛顿大学动物福利办公室批准。方案概览见图 1。本方案的试剂制备步骤详见补充文件 1。
<img alt="血细胞分离、高分辨率荧光测氧法、TMRM 校准、SUIT 方案、分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验方案概览。 使用高分辨率荧光测氧法检测新鲜人全血样本中分离的单核细胞（CD14+）和T细胞（CD3+）线粒体膜电位变化的工作流程。缩略语：TMRM，四甲基罗丹明甲酯；SUIT，底物-解偶联剂-抑制剂滴定法；ADP，二磷酸腺苷；Dig，皂苷；Mal，苹果酸；Pyr，丙酮酸；Glut，谷氨酸；D1-10，连续10次ADP滴定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 从全血中分离血沉棕黄层
注意：细胞分离步骤经 Kramer 等人27 的方法修改而来。
<ol>
	<li>将 RPMI、密度梯度液和离心机恢复至室温。操作开始前，对生物安全柜及相关材料进行消毒。</li>
	<li>将静脉血采集至三支 10 mL 的 K2EDTA 管中。每管至少轻柔颠倒混匀 3 次。</li>
	<li>以 500 × g 离心 10 分钟（22 °C，加速度 9 [acc]，减速度 2 [dec]）。</li>
	<li>从每管中移取 1 mL 血浆，于 -80 °C 保存，用于后续分析。</li>
	<li>将每管中的血浆及一半的红细胞层转移至一个 50 mL 锥形管中。加入 RPMI 至 40 mL 刻度线处。至少轻柔颠倒混匀 3 次。</li>
	<li>将 10 mL 血浆溶液缓慢分层加入四个含有 3 mL 密度梯度液的 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>以 700 × g 离心 30 分钟（22 °C，加速度 5 [acc]，减速度 2 [dec]）。</li>
	<li>收集全部血浆及含外周血单个核细胞（PBMCs）的白膜层，避免扰动下方红细胞层。</li>
	<li>以 500 × g 离心 10 分钟（22 °C，加速度 5 [acc]，减速度 5 [dec]），吸弃上清液。</li>
	<li>用 10 mL RPMI 重悬 PBMC 沉淀，洗涤 1–2 次，每次以 500 × g 离心 10 分钟（22 °C，加速度 5 [acc]，减速度 5 [dec]）。</li>
</ol>
2. CD14+ 和 CD3+ 细胞的磁分离
<ol>
	<li>将柱子置于磁性细胞分选器的磁场中（参见材料表）。用 3 mL RP-5 洗涤柱子。</li>
	<li>用 80 µL RP-5 和 20 µL 抗 CD14 微珠重悬 PBMC 沉淀（参见材料表）。在 4 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 1 mL RP-5 重悬细胞，并将悬液加载到柱子上。收集流穿的未标记细胞至一个标记为“流穿液 1”的 15 mL 圆锥形离心管中。待全部细胞悬液通过柱子后，继续用 3 mL RP-5 洗涤 3 次，每次均收集全部流穿液。</li>
	<li>小心将柱子从磁场中移出，并置于一个新的 15 mL 圆锥形离心管上。加入 5 mL RP-5，并立即使用推杆将柱子内容物压出至标记为“CD14+”的收集管中。</li>
	<li>将“流穿液 1”在 500 × g 下离心 10 分钟（22 °C，加速度 5，减速度 5），吸除上清液。</li>
	<li>使用来自“流穿液 1”的细胞，使用抗 CD3 微珠（参见材料表）重复步骤 2.2–2.5，以分离 T 细胞。</li>
	<li>将含有 T 细胞（CD3+）和单核细胞（CD14+）的离心管在 300 × g 下离心 5 分钟。吸除上清液，并将沉淀用 1 mL RP-5 重悬。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。 
	注意：可通过将 1:10 或 1:20 的细胞稀释液各 10 µL 加入血细胞计数板进行细胞计数。可参考已发表的实验方案使用血细胞计数板进行细胞计数36。</li>
	<li>将 250 万个单核细胞或 500 万个 T 细胞移入新的离心管中。在 2000 × g 下离心 30 秒，吸除上清液，并将细胞重悬于 MiR05 中，总体积为 20 µL，最终浓度为每毫升含 1.25 亿个单核细胞或 2.5 亿个 T 细胞。 
	注意：该最终浓度设定为在 20 µL 体积中注射 250 万个单核细胞或 500 万个 T 细胞。本方法也已用于从小鼠脾脏分离的 T 细胞。相关操作流程见补充文件 1。</li>
</ol>
3. 高分辨率荧光测氧法——氧气和TMRM荧光校准
注意：本方法改编自 Pharaoh 等人先前对透化肌纤维的研究11。在淬灭模式中使用高浓度且无抑制作用的 TMRM，此时线粒体膜电位（mMP）与基质中 TMRM 浓度呈相反关系。因此，mMP 降低会导致 TMRM 染料从基质中释放，从而引起荧光增强32。
<ol>
	<li>按照制造商的说明将0.5 mL样品室安装至O2K呼吸计中（参见 材料清单开启仪器，并将其连接至制造商提供的用于数据采集的软件。</li>
	<li>调节温度至 37 °C 并调节搅拌速度至750 rpm。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤腔室3次。将水替换为0.54 mL的Mir05缓冲液，完全关闭密封塞，并使用集成吸液系统（ISS）去除多余的缓冲液。抬起密封塞，利用密封塞间隔器使腔室内的氧气与环境空气中的氧气达到平衡。</li>
	<li>待氧通量稳定后，根据制造商说明书进行空气氧校准（R1）。 
	注意：可能需要 &gt;30 分钟，以使氧通量稳定。氧传感器需要测定零点氧（R0）以及 50-200 µM 来自使用连二亚硫酸盐滴定的不同实验。具体方法见制造商手册。</li>
	<li>通过关闭密封塞来密封腔室。 
	注意：与使用透化纤维的实验不同，PBMC 实验无需对腔室进行高氧处理。在 R1 校准后密封腔室即可为实验提供足够的氧气。氧浓度应维持在 50–250 µM如果氧气浓度低于阈值，可部分打开培养室，使培养室内的氧气与室内空气中的氧气达到平衡。</li>
	<li>TMRM 校准
	<ol>
		<li>使用绿色LED荧光传感器（激发波长525 nm）配合AmR滤光片组（参见 材料表）。设置荧光计 增益 到 1000 和 强度 至 1000打开荧光传感器并开始记录基线。</li>
		<li>注射 2.5 µL 0.05 mM TMRM，待信号稳定后（约2 min）再进行下一步 2.5 µL 注射，直至完成共4次注射，使TMRM终浓度达到 1 µM 将TMRM加入腔室中。所有注射均使用Hamilton注射器。</li>
		<li>通过选择每次注入对应的荧光信号（电压）来校准荧光传感器，注入物分别为 0、0.25、0.5、0.75 和 1.0 µM TMRM 的五点校准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案
注意：需运行空白实验，即向检测室中注入 20 µL Mir05 而非 20 µL 细胞悬液，因为 TMRM 信号会对加样本身产生响应（见代表性结果部分的讨论）。无论是空白实验还是样品实验，在下一次加样前，均需等待氧通量信号稳定（约 2–3 分钟）。以下滴定方案及预期观察结果见表 1。
<ol>
	<li>当氧通量稳定后，选择并标记氧通量和TMRM信号为“pre-cell”。</li>
	<li>注入含有约500万个T细胞或250万个单核细胞的细胞悬液（体积约为20 µL），测量约10分钟。选择并标记此时的氧通量和TMRM信号为“Cell”。</li>
	<li>通过注入2 µL浓度为1 mg/mL的皂苷（终浓度：4 µg/mL）使细胞透化，等待20分钟。选择并标记此时的氧通量和TMRM信号为“Dig”。 
	注意：建议在独立实验中优化皂苷的浓度。</li>
	<li>加入2.5 µL浓度为1 M的琥珀酸（终浓度：5 mM）。选择并标记此时的氧通量和TMRM信号为“SUCC”。</li>
	<li>当氧通量稳定后，加入5 µL浓度为100 mM的苹果酸（终浓度：1.0 mM）、5 µL浓度为1 M的谷氨酸（终浓度：10 mM）以及5 µL浓度为500 mM的丙酮酸（终浓度：5 mM）。选择并标记此时的氧通量和TMRM信号为“MPG”。</li>
	<li>当氧通量稳定后，进行ADP滴定。根据滴定次数依次选择每次滴定的速率，并将其顺序标记为“D1”至“D10”。采用表2中的滴定方案。</li>
	<li>当氧通量稳定后，进行一系列每次1 µL、浓度为0.25 mM的羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP）滴定，直至荧光信号达到最大值。选择并标记代表最低膜电位的氧通量和TMRM信号，并将其标记为“FCCP”。 
	注意：通常需要0.5–1.0 µM的FCCP浓度以完全耗尽线粒体膜电位。 
	警告：FCCP具有毒性，请参考安全数据表（SDS）进行规范操作。</li>
	<li>可选：当氧通量稳定后，注入1 µL浓度为0.25 mM的鱼藤酮，以抑制复合物I，评估通过复合物II的呼吸能力。 
	注意：在使用解偶联剂滴定后，膜电位的变化不再具有意义。 
	警告：鱼藤酮具有毒性，请参考SDS进行规范操作。</li>
	<li>当氧通量稳定后，注入1 µL浓度为1.25 mM的抗霉素A（终浓度：2.5 µM），以抑制线粒体呼吸。 
	警告：抗霉素A具有毒性，请参考SDS进行规范操作。</li>
</ol>
5. 线粒体膜电位的计算与分析
<ol>
	<li>使用空白实验，记录注射空白样品前（“注射前”）及每次加样时的校准TMRM值（微摩尔浓度TMRM）。参见图2。</li>
	<li>对每个空白实验，通过将“注射前”TMRM浓度设为1.0，计算背景比值，并计算后续TMRM的相应比例下降值。根据所有空白实验结果计算平均背景比值。 
	注意：所纳入的空白实验数量可能取决于仪器的精密度。参见表3中五个不同空白实验的计算示例，其中每次滴定的平均背景比值的标准差介于0至0.016之间。</li>
	<li>背景计算：通过将样品实验的“注射前”TMRM值乘以每次加样的平均背景比值，计算每个样品实验的背景值。参见表3中的计算示例。</li>
	<li>背景校正：从样品测得的TMRM值中减去对应实验的背景值。参见表4中的计算示例。</li>
	<li>FCCP校正：从每次加样的mMP值中减去FCCP背景校正后的mMP值。参见表4中的计算示例。</li>
	<li>ADP敏感性曲线：利用ADP滴定过程中采集的mMP值，将最高和最低膜电位分别设为100%和0%，对ADP引起的mMP下降进行归一化处理。使用首选的统计软件将数据拟合为非线性回归模型，以计算ADP对mMP的半数最大抑制浓度（IC50）。 
	注意：该曲线拟合采用Prism软件中的“[抑制剂] vs. 归一化响应 — 可变斜率”模型。</li>
</ol>
<img alt="线粒体膜电位分析；六步TMRM检测结果图表；极化评估。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：根据TMRM荧光测定计算线粒体膜电位（mMP）和ADP敏感性。 通过高分辨率荧光测氧法对一份T细胞样本（n = 1）进行TMRM荧光检测，进而计算线粒体膜电位（mMP）和ADP敏感性的步骤。步骤1：在空白样本中测量TMRM荧光，操作方式与生物样本相同。步骤2：确定每次滴定后TMRM信号相对于加样前信号的比值，并针对每项空白实验分别计算。计算所有空白实验中每次滴定的平均比值。步骤3：通过将“加样前”荧光值乘以每次滴定的平均背景比值，计算每个样本实验的背景值。步骤4：计算每次滴定中背景与样本TMRM荧光之间的差值，以表示mMP或线粒体对TMRM的摄取量。步骤5：校正mMP，使FCCP完全解偶联时的mMP值为零。步骤6：进行非线性回归分析，绘制mMP随ADP浓度增加的变化曲线。实验在0.5 mL的检测室中进行，其中一个检测室含有来自一名健康志愿者的500万个T细胞。平均数据以均值±标准误（SEM）表示。单次重复实验的单个数据点无误差线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

High-Resolution Analysis of Mitochondrial Function in Human PBMCs

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<li>Sokolova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetics+in+environmental+adaptation+and+stress+tolerance+of+aquatic+ectotherms%3A+linking+physiology+and+ecology+in+a+multi-stressor+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape.</a> J Exp Biol. 224, Pt Suppl 1 236802(2021).</li>
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作者声明无利益冲突。

本方案采用高分辨率荧光测氧法，通过检测外周血单个核细胞、单核细胞和T细胞中线粒体膜电位（mMP）随ADP浓度递增而变化的情况，来评估线粒体对能量需求的响应敏感性。实验通过添加复合物I和II的底物以最大化线粒体膜电位，并逐步滴加ADP，从而逐渐激活ATP合酶利用质子梯度生成ATP。
实验方案中的关键步骤包括将荧光染料的增益和强度设置为1000，并确保在TMRM滴定过程中获取TMRM荧光信号。由于每次滴定后TMRM荧光会下降（该方法的局限性），必须使用空白样品进行背景对照实验。我们还发现DMSO对线粒体呼吸和膜电位具有抑制作用，因此建议将TMRM工作液用Mir05缓冲液稀释补充图1). 
在尝试本方案时，可采用一些调整方法，例如调整细胞浓度或使用标准的2 mL检测室。然而，对于T细胞和单核细胞，推荐使用0.5 mL检测室，因为膜电位和氧通量的最优反应需要较高浓度的细胞。当检测呼吸能力较强的细胞（如巨噬细胞）时，较低的细胞浓度可能更为合适。
本方法的其他局限性包括需要至少500万个T细胞和250万个单核细胞。我们通常可以从健康受试者约20 mL的血液中获得足够的细胞，但具体数量可能因健康状况、年龄和性别而异26。此外，与大多数评估线粒体功能的方法一样，细胞必须新鲜分离。然而，未来可尝试在冻存细胞中应用此方法。与人血液来源的细胞产量相比，健康小鼠脾脏中获得的T细胞数量足以进行本检测。
循环T细胞，特别是长寿命的记忆性（TM）和调节性（Treg）T细胞，依赖氧化磷酸化来获取能量37。尽管它们的能量需求和耗氧量较低（例如，与静息状态的肌肉相比），但其存活对于应对再次感染和癌症的有效免疫应答至关重要38,39,40。T细胞氧化磷酸化能力的降低会导致增殖能力受损，并促进T细胞耗竭和衰老5,41。此外，线粒体超极化可促进效应CD4 T细胞在活化过程中持续产生细胞因子（IL-4和IL-21）42。在感染发生时，免疫细胞活化和增殖所需的能量可高达基础代谢率的25%–30%43。因此，免疫细胞在广泛且极端的能量需求范围内发挥作用，而本方案可用于检测该范围内线粒体的功能响应。
慢性炎症是肥胖、糖尿病和衰老的共同特征。循环激素、脂质和葡萄糖水平的失调具有全身性影响，因此可能影响线粒体对能量挑战的响应方式。本文介绍了一种评估循环外周血单个核细胞（PBMCs）中线粒体对ADP敏感性的方法。未来还需进一步研究以明确在代谢性疾病中ADP敏感性如何被调节，以及其对健康状态的影响。

细胞在生理应激期间维持功能和存活的能力，在很大程度上取决于其满足能量需求以恢复稳态的能力1,2。能量需求会因多种刺激而上升。例如，运动过程中骨骼肌收缩增加，导致ATP和葡萄糖的利用增多；感染后蛋白质合成增加，促使免疫细胞更多地利用ATP以合成细胞因子并进行增殖3,4,5,6。能量需求的激增会触发一系列生物能量过程，以恢复ATP/ADP比率。当ATP被消耗时，ADP水平升高，进而刺激线粒体内的F1F0&#160;ATP合酶（复合体V），该酶需要质子驱动力来驱动其机械旋转，并催化ADP转化为ATP7。质子驱动力是一种电化学梯度，由电子通过线粒体内膜上的电子传递系统（ETS）从底物传递至氧气过程中质子的泵出所形成。由此产生的质子浓度差（ΔpH）和电势差（膜电位）共同构成质子驱动力，驱动ATP合成以及氧气消耗，以响应因能量需求导致的ATP/ADP比率降低或ADP水平升高。线粒体对ADP的亲和力可通过计算分离的线粒体或通透化细胞中ADP刺激呼吸的Km或EC50来确定8,9。该方法显示，与年轻个体相比，老年人的通透化肌纤维需要更高浓度的ADP才能达到其最大氧化磷酸化能力的50%9。类似地，衰老小鼠的骨骼肌需要更多的ADP才能降低线粒体活性氧（ROS）的产生10,11。此外，与对照组相比，饮食诱导肥胖小鼠的通透化肌纤维对ADP的敏感性降低，而在胰岛素存在或摄入硝酸盐后其敏感性则增强12,13。因此，线粒体响应能量需求的能力在不同生理条件下存在差异，但这一现象此前尚未在免疫细胞背景下进行研究。
外周血单个核细胞（PBMCs）常用于研究人体细胞的生物能量学14,15,16,17,18,19,20这主要归因于在临床研究中，细胞可轻松从非凝固的血液样本中获取，细胞对代谢干扰具有敏感性，以及多个研究团队已开发出利用抑制剂和解偶联剂来检测线粒体代谢的方法，从而确定线粒体呼吸的最大和最小能力。21,22这些方法加深了人们对生物能量学在衰老、代谢性疾病和免疫功能中作用的理解。14,20,23,24心力衰竭状态下，骨骼肌和外周血单个核细胞的线粒体呼吸能力通常下降18,25外周血单个核细胞的生物能量学特征与健康成年人的心血管代谢风险因素相关17 并对烟酰胺核糖等治疗具有响应性18外周血单个核细胞（PBMC）包括中性粒细胞、淋巴细胞（B细胞和T细胞）、单核细胞、自然杀伤细胞以及树突状细胞，这些细胞均对外周血单个核细胞的线粒体功能有贡献26,27,28此外，细胞生物能量学在免疫细胞的活化、增殖和更新过程中发挥着关键作用23然而，这些方法的一个局限性在于细胞并非在生理范围的底物浓度下发挥作用。因此，需要采用其他方法来研究在线粒体功能中更接近细胞实际所处底物浓度条件下的表现 体内.
线粒体膜电位（mMP）是质子驱动力的主要组成部分，对于多种线粒体功能至关重要，这些功能不仅限于ATP的生成，还包括呼吸通量的调控、活性氧的产生、蛋白质和离子的导入、自噬以及细胞凋亡等。mMP可通过电化学探针或对膜极化变化敏感的荧光染料进行评估，例如JC-1、Rhod123、DiOC6、四甲基罗丹明（TMRE）或其甲酯（TMRM）以及藏红花素。其中后两种为亲脂性阳离子染料，已成功应用于组织匀浆、分离的线粒体以及透化组织的高分辨率荧光测氧法11,29,30,31,32,33。在该技术中，TMRM采用淬灭模式，即细胞暴露于高浓度TMRM，当线粒体处于极化状态（高mMP和质子驱动力）时，染料会积聚在线粒体基质中，导致胞质内TMRM荧光被淬灭。当线粒体因ADP或解偶联剂作用而发生去极化时，染料从基质中释放，从而使TMRM荧光信号增强34,35。本方法旨在同时测定人源外周血单个核细胞（PBMCs）、循环单核细胞和T细胞在ADP滴定过程中线粒体呼吸和mMP的变化，也可应用于小鼠脾脏T细胞。

<table><tbody><tr><td>二磷酸腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td>从小鼠脾脏分离T细胞方案</td></tr><tr><td>CD14微珠，人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>CD3微珠，人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>DatLab</td><td>Oroboros</td><td>Version 8</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>乙二醇双（&amp;beta;-氨基乙基醚）-N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>AmR滤光片组</td><td>Oroboros</td><td>44321-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（10倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>12060-040</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA采血管</td><td>BD Vacutainer</td><td>366643</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>乳糖酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>L-苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>LS柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>氯化镁&amp;nbsp;（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>Multi-MACS支架与MidiMACS分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>O2k-Fluo Smart-Module</td><td>Oroboros</td><td>12100-03</td><td></td></tr><tr><td>O2k-FluoRespirometer J系列</td><td>Oroboros</td><td>10201-03</td><td></td></tr><tr><td>O2k-sV-Module（0.5腔室）</td><td>Oroboros</td><td>11200-01</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04876</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>小鼠Pan T细胞分离试剂盒II</td><td>Miltenyi</td><td>130095130</td><td>从小鼠脾脏分离T细胞方案</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>氢氧化钾&amp;nbsp;（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>RPMI缓冲液</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td>细胞分离</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>琥珀酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>荧光测氧法</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>Mir05缓冲液</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5428</td><td>荧光测氧法</td></tr></tbody></table>

高分辨率荧光测氧法评估人免疫细胞线粒体膜电位的动态变化

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

外周单个核细胞（PBMCs）的线粒体呼吸能力在健康和疾病状态下表现出显著变化。尽管这些变化&#160;并不总是反映其他组织（如骨骼肌）中的情况，但这些细胞仍是从人体受试者中获取活性线粒体的便捷且有价值的来源。PBMCs暴露于影响其生物能量状态的全身性信号中。因此，扩展用于研究该细胞群体中线粒体代谢的工具，将有助于阐明与疾病进展相关的机制。对线粒体的功能检测通常局限于使用最大浓度的底物、抑制剂和解偶联剂后测定呼吸输出，以确定呼吸能力的完整范围，而这种条件在体内可能无法达到。in vivo）。ATP合酶催化二磷酸腺苷（ADP）转化为三磷酸腺苷（ATP），导致线粒体膜电位（mMP）下降和耗氧量增加。为了更全面地分析线粒体动态，本文描述了采用高分辨率荧光测氧法，同时测量耗氧量和线粒体膜电位（mMP）对生理相关浓度ADP的响应。该技术利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）检测在复合物I和II底物诱导最大超极化后，ADP滴定过程中mMP的去极化反应。该方法可用于量化健康状况变化（如衰老和代谢性疾病）如何影响人体PBMCs、T细胞和单核细胞中线粒体对能量需求的响应敏感性。

为了说明该检测中细胞最佳浓度的差异，将500万个T细胞加入一个0.5 mL的检测室中（1000万个细胞/mL），另将125万个细胞加入另一个含有1 µM TMRM的检测室中（250万个细胞/mL）（图3A-G）。同时设置了三个空白对照实验，用于计算TMRM的背景信号。我们发现，较高的T细胞浓度相对于背景信号，能够产生更明显的TMRM荧光变化（图3B、D）。此外，较高的细胞浓度使我们能够检测到加入FCCP后氧消耗的预期增加以及线粒体膜电位（mMP）的同步下降（图3E、F）。而使用较低的细胞浓度时，荧光变化微弱，与背景信号相近。由于mMP的计算需从信号中扣除背景值，因此低细胞浓度无法准确反映底物和解偶联剂作用下mMP的变化。除了在本实验中使用较高细胞浓度外，我们还建议在不同实验之间保持每种细胞类型的细胞浓度恒定。
为了验证ATP合酶在ADP滴定导致线粒体膜电位（mMP）耗散中的作用，我们对PBMC和T细胞进行了平行实验，其中一个腔室在ADP滴定前先加入寡霉素（图4）。我们发现，经寡霉素处理的细胞在加入ADP后未出现mMP的耗散，表明ADP引起的mMP逐步降低是质子通过ATP合酶流动的结果（图4A-F）。我们还比较了同一受试者T细胞与PBMC对ADP的敏感性，发现T细胞组分的ADP敏感性较低（EC50更高）（图4G，H）。
我们进行了一系列空白实验，以确定时间或SUIT方案对TMRM荧光的影响。结果发现，空白实验中的TMRM信号主要受SUIT滴定步骤的影响（图5A），而滴定时间点的影响较小（图5B）。
我们比较了11名健康社区居住志愿者的T细胞和单核细胞中由ADP驱动的氧消耗率（OCR）和线粒体膜电位（mMP）的变化（图6A-H）。与先前使用细胞外通量和酶学检测方法发表的实验结果相似，单核细胞表现出比淋巴细胞更强的线粒体呼吸能力26,27（图6A,H）。然而，与该方法在使用高代谢活性组织（如小鼠肝脏）时所显示的结果相反，我们并未在这两种细胞类型中检测到ADP诱导的OCR典型的剂量-反应性增加（图6C,D）（图7A-H）。另一方面，使用TMRM使我们能够检测到ADP在人免疫细胞（图6E-G）以及小鼠脾脏T细胞（图7E-H）中引起mMP的逐步下降。尽管我们未使用相同的滴定方案直接比较人和小鼠T细胞，但我们发现，与人外周血T细胞相比，小鼠T细胞的IC50低了10倍。
<img alt="线粒体呼吸和膜电位图；ADP对T细胞生物能量学的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：高分辨率荧光测氧实验。（A-D）使用1000万细胞/mL和250万细胞/mL的T细胞浓度，在0.5 mL检测腔室中进行高分辨率荧光测氧实验的轨迹图。（A）0.5 mL腔室中含1000万细胞/mL。（C）0.5 mL腔室中含250万细胞/mL。上方图示为氧通量（pmol/s/mL）（红色），下方图示为校准后的TMRM信号（黑色）。在整个SUIT过程中，样品及其计算背景的TMRM变化情况分别绘制于含有（B）1000万细胞/mL和（D）250万细胞/mL的腔室中。（E）针对每种细胞浓度，计算氧通量（pmol/s/百万细胞）；（F）计算线粒体膜电位。（G）绘制ADP敏感性曲线，并拟合非线性回归模型（实线）。缩写：mMP，线粒体膜电位；TMRM，四甲基罗丹明甲酯；SUIT，底物-解偶联剂-抑制剂滴定；ADP，腺苷二磷酸；Dig，皂苷；Mal，苹果酸；Pyr，丙酮酸；Glut，谷氨酸；D1-11，连续11次ADP滴定；U，解偶联剂FCCP，浓度0.5和1.0 μM；AMA，抗霉素A。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体氧消耗和膜电位，ADP对PBMC和T细胞影响的图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图 4ATP合酶驱动T细胞和外周血单个核细胞中由ADP引起的膜电位下降。 (A-H本方案已在PBMC和T细胞中进行测试。将同一参与者的PBMC注入两台O2K仪器的两个腔室，另将T细胞注入另一台O2K仪器的两个腔室。在所有腔室中加入底物丙二酸、丙酮酸和谷氨酸后，分别向一个PBMC腔室和一个T细胞腔室加入寡霉素。寡霉素抑制了由ADP驱动的呼吸上升A) PBMC 和 (DT细胞或线粒体膜电位下降在（B,C) 外周血单个核细胞（PBMCs）和（E,FT细胞。G,H与T细胞相比，PBMCs对ADP的敏感性更高。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="TMRM 滴定曲线，ADP μM，SUIT 序列，TMRM 与时间关系分析，标准/延迟注射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：空白实验显示 TMRM 荧光随时间及底物、解偶联剂和抑制剂滴定（SUIT）的变化情况。（A）TMRM 荧光在滴定过程中的变化。（B）TMRM 荧光随时间的变化。实验在装有 0.5 mL Mir05 缓冲液并含 1 μM TMRM 的检测室中进行。其中一个检测室未进行任何 SUIT 滴定（无注射）；两台不同仪器中的两个检测室接受了标准 SUIT 方案（标准注射）；另一个检测室接受了相同的 SUIT 滴定，但在每次注射之间设置了延迟（延迟注射）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="线粒体功能分析；耗氧量、膜电位图、ADP 影响及 EC50。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：利用 OCR 和 mMP 分析 T 细胞与单核细胞之间在 ADP 敏感性上的差异。（A）来自一名受试者单核细胞和 T 细胞样本的高分辨率荧光测压实验轨迹。（B）健康志愿者血液中单核细胞（n = 11）和 T 细胞（n = 13）的耗氧量。（C、D）对随 ADP 滴定而升高的呼吸作用曲线进行非线性回归拟合，以计算 EC50。（E）线粒体膜电位的同步测量。（F、G）对随 ADP 滴定而降低的线粒体膜电位曲线进行非线性回归拟合，以计算 IC50。（H）单核细胞和 T 细胞的呼吸能力参数。线图数据表示为均值 ± 标准误，柱状图数据表示为均值 ± 标准差。t 检验显示的统计学显著差异表示为 *p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="T细胞和肝脏的ADP滴定曲线、耗氧率（OCR）及线粒体膜电位（nMMP）分析，显示线粒体功能。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66863/66863fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7比较经透化处理的小鼠脾脏 T 细胞和肝脏中 ADP 反应对呼吸作用和线粒体膜电位（mMP）的影响 (A-D透性化小鼠脾脏T细胞和肝脏中呼吸反应的变化。E-H) 透化小鼠脾脏T细胞和肝脏中mMP的响应。经颈椎脱位处死三只小鼠后，新鲜分离其肝脏和脾脏。使用抗体偶联磁珠分离法提取脾脏Pan T细胞。两组样品均在相同SUIT方案中进行处理，并加入相应试剂 1 μM TMRM。I,J) ADP 处理下，基于氧消耗速率（OCR）升高计算的 EC50 与基于线粒体膜电位（mMP）降低计算的 IC50 比较。每组 n = 3。数据以均值 ± 标准误表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/66863fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：使用0.5 mL腔室评估新鲜分离的T细胞和单核细胞线粒体膜电位的SUIT方案示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：0.5 mL 检测室推荐的ADP滴定方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：使用五次独立的空白实验计算平均背景比率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：从样本实验中计算线粒体膜电位（mMP）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图1：Mir05和DMSO对线粒体呼吸和膜电位的影响。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementray%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：从小鼠脾脏分离T细胞的试剂制备与实验方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66863/Supplementary%20FIle%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

在生理相关底物浓度下研究免疫细胞线粒体生物能量学的方法有限。本文提供了一种详细方案，利用高分辨率荧光测氧法，检测人T细胞、单核细胞和外周血单个核细胞中线粒体膜电位对能量需求变化的响应。

外周单个核细胞（PBMCs）在线粒体呼吸能力方面会因健康状态和疾病状况而发生显著变化。尽管这些……

细胞在经历一段时间的生理应激后，若要维持正常功能并存活，必须能够满足恢复稳态所需的能量需求。在本实验室中，我们致力于探究线粒体如何响应并适应营养应激，以更深入地理解线粒体在介导疾病发生风险中的作用。目前检测PBMC生物能量学的方法包括在加入抑制剂和解偶联剂后测定其呼吸能力。这些方法帮助我们了解了不同疾病状态下 PBMC 中重要的生物能量变化。膜电位对于 ATP 合成至关重要，并调控呼吸通量、活性氧以及自噬等过程。然而，关于线粒体呼吸和膜电位在生理底物浓度下如何共同响应 PBMC 中的变化，我们的认识仍然有限。该技术的优势在于，能够对人外周血单个核细胞（PBMC）在线粒体膜电位和耗氧量方面对逐步增加的ADP水平的响应进行整合分析。该方法可用于量化线粒体对能量需求变化的敏感性。首先，根据制造商的说明，将0.5毫升检测室安装至O2k呼吸仪中。打开仪器，并将其连接到提供的软件以进行数据采集。用去离子水清洗腔室三次。将水替换为0.54毫升MIR O-5，并完全关闭塞子。除去多余缓冲液后，升起阻隔器，使室内的氧气与腔室中的氧气达到平衡。将柱子置于磁性细胞分选仪的磁场中，并用三毫升 RP-5 洗柱。将新分离的外周血单个核细胞（PBMC）沉淀重悬于 80 微升 RP-5 中，并加入 20 微升抗 CD14 磁珠。将细胞在 4 摄氏度孵育 15 分钟。加入 1 毫升 RP-5 稀释细胞，然后将悬液加载到柱上。收集未标记的穿流细胞，流入已标记为“穿流一”的 15 毫升锥形管中。用三毫升 RP-5 溶液洗涤柱子三次，收集流穿液体。小心将柱子从磁场中取出，置于新的 15 毫升锥形管上。加入五毫升 RP-5 后，将推杆插入柱子，以收集管中的内容物。将流穿液离心后，使用抗CD3磁珠对细胞重复分离步骤，以获得T淋巴细胞。将含有CD3阳性T细胞和CD14阳性单核细胞的样品离心。弃去上清液后，将沉淀重悬于1毫升RP-5中。使用血细胞计数板测定细胞浓度。将250万个单核细胞和500万个T细胞加入新的离心管中。离心收集细胞，并将其重悬于20 µL的MIR O-5中。安装荧光传感器，并在 O2k 呼吸测量仪上启动实验文件。使用配备 AMR 滤光片组的绿色 LED 荧光传感器，将荧光计增益和光强均调节至 1,000。将反应室体积设置为 0.5 毫升。调整布局以同时观察氧气通量和TMRM荧光。待氧气通量稳定后，根据制造商的方案进行空气氧校准。关闭封盖以密封反应室。使用 Hamilton 注射器，将 2.5 微升 0.05 毫摩尔的四甲基罗丹明甲酯（TMRM）注入四次。每次注射分别对应 0、0.25、0.5、0.75 和 1.0 微摩尔 TMRM 的荧光信号，用于校准流速传感器。注入 20 微升 MIR O-5 以运行空白实验。待氧通量稳定后，选择并标记氧通量和TMRM信号为“加细胞前”。加入20微升含有细胞的细胞悬液，测量约10分钟。然后选择并标记氧通量和TMRM信号为“加细胞后”。然后依次对每种处理重复上述步骤，并正确标记氧通量和TMRM信号。待氧通量稳定后，加入1微升1.25毫摩尔的抗霉素A以抑制线粒体呼吸。对于每个空白实验，将样品前TMRM浓度设为1，以计算背景比率。计算所有空白实验中TMRM的后续成比例下降以及平均背景比值。然后将样本实验的预样本TMRM值与每个样本实验每次加样对应的平均背景比值相乘。从样本测得的TMRM值中减去实验的背景值。接下来，从每次加样的线粒体膜电位中减去FCCP背景校正后的值。为了标准化ADP驱动的下降值，将最高和最低膜电位分别设为100%和0%。然后将数据拟合到非线性回归模型中。对健康志愿者来源的T细胞和单核细胞中ADP诱导变化的比较研究表明，与T细胞相比，单核细胞表现出更显著的线粒体膜电位下降。ADP对线粒体膜电位的半数抑制浓度在单核细胞中低于T细胞。在两种细胞类型中均未检测到氧消耗速率随ADP剂量增加而典型的响应性升高。

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生物学

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利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

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肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

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