Name: 使用微电极分析三维胃肠道类器官中的管腔 pH 值 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习使用微电极技术测量人胃类器官管腔内pH值的方法，实现实时精准监测。该技术可揭示幽门螺杆菌感染期间胃上皮细胞的生理反应，为开发新型细胞保护治疗策略提供可靠工具。

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作者谨此感谢 Ellen Lauchnor 博士、Phil Stewart 博士和 Bengisu Kilic 在 O2 微传感器方面的前期工作与协助；感谢 Andy Sebrell 在类器官培养和显微操作方面的培训；感谢 Lexi Burcham 在类器官培养、培养基制备、数据记录与整理方面的协助；以及感谢 Susy Kohout 博士在电生理学方面的总体建议。我们感谢 Heidi Smith 博士在成像方面的协助，并致谢蒙大拿州立大学生物膜工程中心生物成像平台，该平台获得了美国国家科学基金会 MRI 项目（2018562）、M.J. Murdock 慈善信托基金（202016116）、美国国防部（77369LSRIP &amp;#38; W911NF1910288）以及蒙大拿纳米技术平台（作为 NNCI 成员，获 NSF 资助号 ECCS-2025391）的资金支持。
特别感谢整个Unisense团队为本研究工作提供的支持，尤其感谢Andrew Cerskus博士、Laura Woods博士、Lars Larsen博士、Tage Dalsgaard博士、Line Daugaard博士、Karen Maegaard博士以及Mette Gammelgaard。本研究的资金由美国国立卫生研究院资助项目R01 GM13140801（D.B.，R.B.）和UL1 TR002319（K.N.L.）以及蒙大拿州立大学研究与经济发展办公室的研究拓展奖（D.B.）提供支持。图1A使用BioRender绘制。

本方案需要直径至少为 200 µm、具有明显管腔且包埋于人工细胞外基质（ECM，例如 Matrigel）中的三维类器官。用于类器官建立的人胃组织经蒙大拿州立大学机构审查委员会批准获取，并获得在博兹曼医疗中心接受上消化道内镜检查患者的知情同意（方案编号 #2023-48-FCR，负责人：D.B.），或来自国家疾病研究互换组织提供的豁免全胃或袖状胃切除标本（方案编号 #DB062615-EX）。本研究中所用类器官品系及传代次数的信息见表 1，培养基成分列于表 2。有关胃肠道类器官品系的建立与维持方法，请参考已发表的方案6,26,27。
1. 人胃类器官用于pH分析的制备
<ol>
	<li>使用标准方案启动并维持胃类器官培养。将类器官培养于24孔板中，每孔加入500 µL扩增培养基（表2）。每5–7天传代一次已建立的类器官系，并转移至35 mm玻璃底培养皿中，为pH分析实验做准备。 
	注意：本实验所用类器官培养物来源于胃腺组织制备物，该组织来源于成体组织，具体方法如上所述。我们采用胶原酶消化法分离这些胃腺，然后将其悬浮于细胞外基质（ECM）中，方法此前已有描述25,28,29。</li>
	<li>从第1–15代处于活跃生长状态的类器官培养物中，选择含有至少100个类器官（约200万个细胞）、直径在200–700 µm之间的孔进行转移，并在3.5 mm培养皿上扩增。</li>
	<li>在准备类器官接种的过程中（步骤1.4–1.8），将细胞外基质（ECM）分装样品置于冰上解冻至少45分钟。在整个操作过程中保持ECM处于冰上，以防止其发生凝胶化。将细胞培养板放入37 °C、5% CO2培养箱中预热。</li>
	<li>吸除孔内培养基，通过向每个ECM液滴中加入冰浴PBS并用P1000移液器枪头轻轻刮擦凝胶的方式收获胃类器官培养物。将含有类器官的ECM碎片与PBS一同转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。含有类器官的ECM碎片将在管底形成可见层。小心吸除上清液，向每管中加入350 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并通过上下吹打轻轻混匀。将各管置于37 °C水浴中孵育2–5分钟。</li>
	<li>胰蛋白酶-EDTA孵育后，向每管加入600 µL冰浴DMEM（含青霉素/链霉素），剧烈上下吹打至少40次。在4 °C条件下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。为建立用于pH检测的培养体系，将细胞沉淀以1:4（v/v）的体积比重悬于冰浴的液态ECM中，用于后续接种。</li>
	<li>对于每个样本，将含有类器官或类器官碎片的40 µL液态ECM沿35 mm玻璃底培养皿的直径方向以细长直线形式接种。 
	注意：将凝胶以直线形式而非圆形液滴形式分配到培养皿上，有助于稀疏分布类器官，从而更易于单独接触各个类器官。</li>
	<li>让凝胶聚合15–30分钟；随后，沿孔壁边缘缓慢加入2 mL类器官扩增培养基，避免扰动凝胶层。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基。培养4–8天，直至每个培养体系中至少有10个类器官生长至最小直径400 µm。</li>
	<li>进行pH分析实验前，需确认每个培养体系中至少有10个类器官满足以下条件：&#62;200 µm直径、形态健康（在明场显微镜下观察，类器官内部几乎无暗色物质）、且未因其他类器官过度生长而拥挤。</li>
</ol>
2. 微电极的拆封与校准
注意：为了实现微尺度测量，除pH传感器微电极外，还需使用单独的参比电极，而不是采用集成式（因而体积更大）的设计。pH微电极和参比电极都必须保持湿润保存。每次暴露在空气中的时间不得超过10分钟。根据应用需求确定合适的尖端尺寸。本实验中使用的是尖端经斜面抛光、直径为25 µm的电位法pH微电极。
<ol>
	<li>微电极仍处于保护管中时，目视检查尖端是否有任何损伤。</li>
	<li>通过连接器将参比电极连接至pH电极线缆，然后将微电极连接至放大器，再通过USB线缆将放大器连接至接地的计算机并运行相应软件。图1A).</li>
	<li>将两个50 mL离心管各装入2/3体积的70%乙醇和去离子H₂O2O (diH2O）。将微电极和参比电极放入去离子水中2O管，确保两端管口均浸入液面以下至少1厘米。 
	注意：较高的烧杯也可用于此步骤及类似步骤。</li>
	<li>让电极平衡约10分钟。 
	注意：此步骤也可暂停，稍后继续进行，因为电极可保存在二重蒸馏水（diH₂O）中。2O.</li>
	<li>当电极平衡时，打开计算机工作站上的软件（红色图标）。在“设置”选项卡下，确保勾选该复选框&#160;紧邻微电极的位置被检测。&#160;表明其已正确连接并&#160;被软件识别。单击 开始&#160;实验 在窗口左上角，输入您所需的文件名和保存路径。在 传感器校准 &amp;#38;&amp;#160;experiment&#160;设置 窗口，单击 清除所有点 到&#160;准备软件以进行新的校准。</li>
	<li>用pH 4.01和pH 9.21的校准缓冲液分别填充两个50 mL离心管至2/3体积。用精密实验室擦拭纸轻轻吸干保护套管和参比电极的表面水分。</li>
	<li>从电极置于pH 4.01缓冲液中开始，输入 4.01 已知pH值。待mV读数稳定后，选择 添加点. 确认信号在约 380 mV 时稳定。添加完毕后，将两个电极放回二水合2O 型冲洗，然后再次吸干。</li>
	<li>用 9.21 缓冲液重复上一步操作，然后点击 添加点 当信号稳定时（约83 mV）。检查微电极在pH 4.01至9.21范围内是否呈线性响应；因此，仅需进行两点校准。确保这两点间所得直线的斜率为负，范围在50–70 mV/pH单位之间。点击 保存 &amp;#38;&amp;#160;使用校准. 
	注意：现在可以开始记录测量数据30.</li>
</ol>
3. 人胃类器官的pH分析
注意：以下方案描述适用于右利手用户。警告：请关闭计算机上的所有节能选项，因为如果计算机进入睡眠模式，正在进行的测量将被中断。
<ol>
	<li>在体视显微镜左侧的铁架台上安装一个夹子，用于固定参比电极。在显微镜右侧的重型实验台上放置一个连接有显微操作器的装置（图1A）。</li>
	<li>将微电极平放在实验台上，迅速而轻柔地将其保护套取下，小心取出微电极。 
	警告：微电极极为脆弱，操作时应确保其尖端不与坚硬的固体材料接触。为获得最佳结果，应在稳固的实验台面上进行测量，并避免使用可能引起台面振动或导致电极意外移动的设备。</li>
	<li>将微电极安装到显微操作器上，并调整体视显微镜和显微操作器的位置，使微电极能够向前推进至培养皿时不会触碰到物镜或其他显微镜部件。</li>
	<li>调整含有类器官的培养皿位置，以便清晰观察首个需要检测的类器官（图1B）。</li>
	<li>将参比电极轻轻固定在体视显微镜左侧铁架台的夹子上。调整参比电极位置，使其浸入包围细胞外基质（ECM）的培养基中。注意确保在测量过程中移动载物台时，电极不会干扰类器官。</li>
	<li>直接观察培养板（而非通过显微镜），推进微电极尖端，直至其充分浸入培养基中。在软件的“数据记录器”选项卡中，&#160;点击“开始”按钮（指向右侧的单个三角形）以开始记录。确保屏幕右侧的&#160;“已校准”复选框&#160;已被选中&#160;。&#160; 
	注意：每次读数应等待约10秒，待数值稳定后再进入下一区域。</li>
	<li>在进入细胞外基质（ECM）之前，确保在显微镜下可见微电极尖端，并将其定位为可沿直线方向朝向第一个目标类器官推进。缓慢将电极插入凝胶中，避免接触任何类器官。记录至少三次pH读数并计算平均值。</li>
	<li>调整微电极位置，使其准备沿垂直于表面的轴线方向朝向第一个目标类器官推进。让电极在上皮表面产生轻微压痕，但不穿透组织（图1C）。 
	注意：此步骤还可帮助判断类器官是否会保持原位，或在细胞外基质中更自由地移动。</li>
	<li>以一次快速动作将微电极插入类器官中。如果类器官围绕微电极移动或远离电极，可尝试略微调整角度，或将类器官靠向另一个类器官或培养皿底部盖玻片周围的塑料边缘。对每种实验条件下的10个不同类器官，分别测量其管腔pH值（每个测量三次）。&#160;完成所有测量后，点击方形“停止”按钮。 
	警告：应估算类器官的直径，以确定微电极插入管腔的深度，注意不要穿透类器官。为提高准确性，如有条件，可使用显微镜的相机软件测量直径。注意：若在一次或多次测量后发现微电极尖端明显被碎屑覆盖，应在继续操作前依次用细胞解离液、PBS、乙醇（EtOH）和去离子水（diH2O）清洗微电极。</li>
</ol>
4. 电动剖面扫描（可选）
注意：此选项需要将显微操作仪安装在机械电机载物台上，最终通过电机控制器由计算机软件进行控制31。
<ol>
	<li>打开分析软件（棕色图标），在分析选项卡下启动新实验。</li>
	<li>当电机装置正确连接时，z轴的设置将自动识别电机。 
	注意：在此设置下，x和y方向的移动仍需手动控制。</li>
	<li>找到分析交互选项卡30。在点击开始之前，请确保能够快速切换至显微镜目镜进行观察，以确认类器官在目标距离处被穿刺。进入分析设置并执行以下操作：
	<ol>
		<li>将起始距离设为0 µm。 
		警告：如果某个类器官的上皮层特别坚韧，电极可能无法刺入而将类器官推走或使其变形。若发生推动现象，请继续推进电极，但需记录实际穿刺发生的点位，因为软件无法自动记录该情况。</li>
		<li>根据待分析类器官的大小，将终止距离设置为不超过类器官估计直径的¾处。 
		注意：此步骤旨在防止电极尖端受损。</li>
		<li>设定所需的步长——如图2E所示为100 µm。确保最小步长与电极尖端尺寸相匹配（例如，使用25 µm pH-25电极尖端时，最小步长应为25 µm）。</li>
		<li>设定一个安全位置，使电机在每次分析之间将电极尖端返回至此位置。 
		注意：该位置应高于样品（位于类器官外部），以便通过手动显微操作器安全地在x和y方向横向移动传感器。将传感器角度保持在默认设置。</li>
		<li>为使电极充分平衡，在测量前等待时间(s)中至少设置3秒。</li>
		<li>将测量周期(s)设为至少1秒。此期间内的测量值将被取平均。 
		注意：若在电噪声较高的环境中进行测量，建议设置更长的周期。</li>
		<li>将间隔时间(s)设为至少1秒。</li>
		<li>设置在每个深度需测量的重复次数。</li>
		<li>点击开始按钮，开始记录测量数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 电极的清洗
<ol>
	<li>将待清洁的电极放回其保护套管中。</li>
	<li>用去离子水冲洗电极2O 测量后。</li>
	<li>用70%乙醇冲洗电极数分钟。</li>
	<li>用pH 4.01缓冲液冲洗电极。</li>
	<li>冲洗&#160;用二水合物再次清洗电极2O之前&#160;继续进行测量。</li>
</ol>
6. 电极的储存
注意：两个电极均应存放在室温下、活性较低的位置，避免意外损坏。
<ol>
	<li>使用 pH 微电极后，将其小心地水平滑回保护管中（沿实验台滑动以提供水平支撑）。</li>
	<li>将微电极竖直持握（尖端朝上），轻轻向保护管中加入无菌水。用随电极配备的塞子封住保护管。确保保护管上的任何孔洞均用绝缘胶带密封。存放于防碎盒中，直至下次使用。 
	注意：建议使用电极出厂时的原装盒，因其内部含有专门设计的保护衬垫，可确保电极存放时固定稳妥。</li>
	<li>将参比电极存放在盛有 3M KCl 溶液的烧杯或量筒中。用封口膜覆盖烧杯/量筒，防止溶液蒸发。 
	注意：若使用量筒，建议用胶带将其固定在实验台上，以防意外移动。</li>
</ol>
7. 甲基红注射（可选）
注意：甲基红是一种比色指示染料，可用于验证微电极测量结果。
<ol>
	<li>用无菌矿物油回填一支2 µL玻璃毛细管，将其装载到由显微操作仪控制的纳升自动注射器上，随后注入含有0.02%甲基红和150 mM HCl的溶液。 
	注意：由于HCl的酸性，溶液在毛细管中应呈现红色/粉红色。</li>
	<li>向直径至少为300 µm的类器官注射9.2 µL该溶液25。</li>
	<li>使用适配于体视显微镜的相机采集图像或视频（图2G）。</li>
</ol>

Precise Luminal pH Measurement in 3D Gastric Organoids with Microelectrodes

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</ol>

作者声明无利益冲突。

类器官腔隙空间的有限可及性严重限制了我们对这一微环境生理动态的理解。一种用于腔内生理功能分析的可靠工具将拓展我们利用类器官的能力 体外 用于生理学、药理学和疾病研究的模型。类器官是高度可调控且具有生理相关性的模型，还具备模拟人类群体遗传变异性的潜力。目前用于测量类器官腔内 pH 值的方法主要采用 pH 敏感性染料或纳米颗粒，这些方法通常需结合荧光显微镜或光谱学技术。16,17,37所述基于微传感器的剖面分析方法为测量胃肠道类器官管腔内pH提供了具有更高空间精度的新途径。本方法可稳定、可靠地测定胃肠道类器官管腔的pH值，并提供了存在pH梯度的证据。在尚未发表的实验中，我们证实了 SLC 家族基因 SLC4A2 和 26A7 已知负责碳酸氢盐分泌以及 SLC9A3, 9A4，以及 9A8 负责质子交换的补充图 S1)38,39,40,41我们的研究表明，类器官中以碳酸氢盐分泌为主，且缺乏壁细胞，这可能解释了其碱性特征。
确保所使用的微电极适合类器官微区分析非常重要，其中包括选择合适的尖端直径。我们尝试了25 µm和50 µm两种尖端，获得了相似的结果（图2A），但根据制造商的建议，最终决定采用较小的尖端尺寸，因其侵入性更小，并能提供更高的空间分辨率，因为测量值是基于斜面尖端区域进行平均的。然而，较小的尖端也更脆弱。在确定所需空间分辨率时，必须考虑类器官的尺寸。
该实验方案中的一个关键步骤是确保能够区分类器官管腔内的pH值与细胞外基质（ECM）中的pH值，进而区分周围培养基中的pH值。可以预期会有适量的代谢物在类器官内外进行交换42。我们认为类器官的pH值会受到其周围环境的影响，并在六次独立实验中发现，类器官的pH值 consistently 低于其周围环境（图2D）。此外，稳定性在表征分析中的重要性与传感器校准过程中同样重要。
来源于组织的类器官预期会表现出一定程度的供体间变异性，因此在实施任何实验干预（如药物处理）之前，必须对任何类器官品系进行基线表征43。我们推测，单个类器官培养体系中pH值的波动可能源于微尺度下的局部离子梯度以及管腔黏液分布的不均一性，这一点已通过免疫荧光和免疫组织化学染色得以证实（未发表数据）。不同类器官品系及不同传代次数之间观察到的pH值差异，可能与类器官细胞组成和分泌活性的个体差异有关。我们还发现，某些类器官品系本身比其他品系更难穿透。类似地，某些类器官在电极插入时可能失去结构完整性并发生塌陷（补充图S2 和 补充视频S1）。这种现象似乎与类器官的传代次数无关，但在直径超过约1.5 mm的类器官中更为常见。在之前的一项研究中，我们已证明类器官内部的黏液呈不均匀分布29。由于这种不均一性，难以判断黏液分布是否对测量结果产生了影响，以及影响的程度如何。
微型传感器是一种微创工具，能够以高速度和高空间分辨率对类器官管腔内的生理状态进行分析。这类传感器不会干扰化学梯度，且对目标微环境中的湍流几乎不敏感。其小巧的设计得益于将传感电极与参比电极分离——标准实验室pH探针通常将这两种电极整合在一起，导致体积较大。科罗拉多矿业学院Cash课题组已开发出用于细胞内测量的光学pH和O2纳米传感器，并成功应用于小鼠和生物膜模型中的代谢物检测。然而，由于类器官管腔具有异质性，此类传感器可能产生难以解释的结果17。McCracken等人通过向胚胎干细胞来源的胃类器官中注射SNARF-5F，并利用实时共聚焦显微镜观察pH敏感性染料，实现了对管腔pH的分析37。值得注意的是，McCracken报告的测量结果与本研究获得的pH值高度相似（图2B、C）。我们的技术或许可应用于单层结构，采用更接近生物膜分析中的垂直设置，但这种方法可能增加电极损坏的风险44。未来的研究还可包括在多天内连续测量pH，以评估与细胞发育相关的变化。由于中等大小的类器官在探测后通常能够恢复并愈合，只要保持培养环境的无菌状态，理论上同一个类器官可被多次探测。随着我们对类器官模型中pH动态变化的理解不断深入，空间分辨率必须成为精确描绘其复杂且历来难以触及的三维微环境的优先考虑因素。
综上所述，本实验方案提供了一种利用安装在显微操作仪和体视显微镜上的pH微电极，以高时空分辨率精确测量pH值的详细方法。该方法已使用人成体干细胞来源的类器官进行了验证，适用于直径至少为200 µm且具有明确管腔的上皮类器官。我们预计，通过选择不同的微电极，该方法可轻松拓展应用于其他类型的类器官，以及NO或O2等其他化合物的检测。

类器官——源自干细胞的微型多细胞结构——彻底改变了我们研究人类生理学的能力，并开始在监管环境中取代动物模型1。自Sato等人于2009年首次描述肠道类器官以来，类器官技术已变得极为流行2。大量研究已对类器官模型的细胞组成和功能进行了详尽表征3,4,5,6。然而，这些三维多细胞结构的管腔空间在很大程度上仍不明确7,8。管腔是指来源于黏膜组织的类器官中央腔隙，由极化上皮细胞的顶端部分所包围。由于细胞分泌和吸收主要发生在上皮细胞的顶端表面，类器官的管腔微环境正受到这些重要生理过程的调控。目前使用的类器官模型在细胞信号传导模式、整体干性、代谢物浓度梯度以及环境条件方面均表现出差异9。因此，理解类器官管腔的生理特性对于准确模拟器官功能和病理状态至关重要。然而，管腔相对难以接近，这严重阻碍了对三维类器官管腔生理功能的分析10。
研究pH分布特征的能力在胃部尤为重要，因为胃以拥有体内最陡峭的质子梯度而著称，其管腔内的pH值约为1–3，而上皮层附近则接近中性11,12,13。目前，我们对胃部pH梯度在微尺度上的维持机制仍存在显著认知空白，同时也缺乏对类器官模型是否能够重现胃黏液层跨区域动态微环境的深入理解。传统分析类器官pH的方法主要依赖pH敏感性染料，这类染料可为荧光型或比色型指示剂。McCracken等人通过向类器官管腔内注射SNARF-5F——一种比率型pH指示剂——来检测组胺处理后管腔pH的下降。此类染料可被加入培养基中，从而实现对pH的实时、无创监测。然而，pH敏感性染料不仅需要复杂的校准步骤，导致测量结果的可靠性和准确性较差，而且这些染料通常仅在特定的检测范围内有效，可能无法真实反映目标微环境中完整的pH变化范围14,15。尽管如此，在验证性实验中使用指示染料仍可被视为合理选择. 此外，已有研究开发出基于荧光光极技术的光学纳米传感器用于pH检测；但这类传感技术需要显微成像，且易受光漂白、光毒性以及成像偏差的影响16,17. 另外，Brooks等人已采用3D打印技术制备了带有微电极的多孔板，可在其表面培养类器官18。然而，该方法无法直接在类器官管腔内部进行测量。
基于电极的pH测量相比其他方法可实现更高的准确性，并能提供实时的pH监测。此外，安装在显微操作器上的pH电极可通过精确控制电极尖端的位置，实现更优的空间分辨率，从而在类器官模型的分析中提供最大程度的灵活性和可重复性。本实验所使用的电极为微型pH微电极，其工作原理依赖于质子通过包裹在细铂丝外的特异性pH敏感玻璃膜进行扩散。该微电极与外部的Ag-AgCl参比电极相连，再接入高阻抗毫伏计。当两个电极尖端浸入同一溶液中时，其间的电势差即可反映溶液的pH值19。此类微剖面系统已广泛应用于生物膜20,21、浮游藻类22、人类痰液样本23，甚至间充质干细胞球体24的代谢分析。本实验室与Murphy等先前均曾使用显微操作器控制的O2微电极，检测类器官腔内的氧浓度。Murphy等将该方法与数学建模相结合，揭示了其球体内部存在氧浓度梯度。本课题组亦发现，组织来源的胃类器官腔内氧水平较其周围的细胞外基质显著降低25。
在此，我们提供了一种详细的方法，用于对球形胃肠道类器官腔内pH进行手动微电极检测，该方法将有助于深入理解其复杂的腔内微环境的生理特性。我们预计，该技术将通过在微尺度上对pH水平进行实时、高分辨率的测量，为类器官生理学研究增添新的维度。此外，以下方案可轻松适用于O的分析2，N2O, H2，一氧化氮，H2S、氧化还原状态和温度在各类类器官模型中的作用。生理学表征是优化类器官培养条件以更好模拟生理状态的有力工具 体内 环境，从而提升类器官模型在生物医学研究中的相关性和实用性。

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管 - 泡沫架，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229412</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 无滴漏血清移液管，独立包装，纸/塑料，袋装，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229093B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 20 mm 玻璃直径 | 未包被</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管 - 泡沫架，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>BP82031GAL</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛网，独立包装，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229483&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L 长款低吸附移液器吸头，成排排列，无菌</td><td>CellTreat</td><td>229037</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B（Fungizone）溶液</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Nuaire&amp;nbsp;</td><td>NU-425-600</td><td>II 级 A/B3 型</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>DMEM/F-12（高级 DMEM）</td><td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 硫酸盐</td><td>Corning</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavilion 2 合 1 14&quot; 笔记本电脑 Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>iPhone 12 相机</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>大尺寸 Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 精细任务擦拭纸，单层</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA 体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质胶 354234</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>MC-1 UniMotor 控制器</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲基红</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MM33 微操纵器</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td>右手型</td></tr><tr><td>MS-15 电动载物台</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>纳升级自动注射仪</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>pH 微电极</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>SensorTrace 软件不兼容 Apple 计算机</td></tr><tr><td>参比电极</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td><td>SensorTrace 软件不兼容 Apple 计算机</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>智能手机相机适配器</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>专用实验室支架 LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.025%，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp</td><td>Unisense</td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&amp;nbsp;MINI 细胞刮刀 200/包</td><td>Fisher</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Sensor 校准试剂盒</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4.01 和 9.21，20 mL 袋装</td></tr></tbody></table>

利用微电极对三维胃肠道类器官中的管腔ph进行表征

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

胃肠道类器官模型的优化与详细表征需要先进的方法来分析其管腔环境。本文介绍了一种高度可重复的方法，通过由显微操作器控制的微电极精确测量三维人胃类器官管腔内的pH值。pH微电极为市售产品，由直径为25 µm的斜面玻璃尖端构成。在测量过程中，将pH微电极插入悬浮于Matrigel中的类器官（&gt;200 µm）管腔内，同时将参比电极浸没在培养板的周围培养基中。
利用此类微电极对源自人胃体的类器官进行检测，我们证明了每个培养孔内腔 pH 值相对稳定，约为 7.7 ± 0.037，并且可连续获取至少 15 分钟的测量数据。在一些较大的类器官中，测量结果显示上皮表面与腔内之间存在 pH 梯度，表明类器官中的 pH 测量可实现较高的空间分辨率。在之前的一项研究中，微电极已成功用于测量类器官腔内的氧浓度，显示出该方法在类器官分析中的广泛适用性。综上所述，本方案描述了一种用于功能表征三维类器官内部复杂腔室空间的重要工具。

分泌酸是人类胃部的一项关键功能。然而，类器官在多大程度上能够模拟酸分泌仍存在争议6,32,33,34。因此，我们开发了上述详细方案，以精确测量胃类器官中的酸生成。值得注意的是，我们使用的是在标准扩增条件下培养、经过多次传代的未刺激成体干细胞来源的类器官，这种处理会导致壁细胞的丢失35。因此，在我们的模型系统中，并不预期存在能够分泌酸的壁细胞或发生主动的酸释放。
在实验中，我们使用了直径介于 200 µm 至 1,000 µm 之间、接种于玻璃底培养皿中的类器官。首先，我们测试了两种不同尖端尺寸的微电极：一种是尖端直径为 25 µm 的 pH-25 电极，另一种是尖端直径为 50 µm 的 pH-50 电极。如图 2A所示，使用较小尖端与较大尖端所获得的测量结果之间无显著差异。有趣的是，类器官内的基础 pH 值倾向于轻微偏碱性，约为 pH 8。接着，我们采用 25 µm 的 pH-25 电极，对同一培养板上十个不同类器官腔内的 pH 值变异性进行了评估，每个类器官采集三个测量值（图 2B）。在同一培养板上，各个类器官腔内 pH 值仅表现出轻微且无统计学意义的差异（8.16 ± 0.12；p ≥0.0445–0.99）（图 2B）。我们还比较了五个不同类器官品系在传代次数从第 3 代到第 16 代之间的腔内 pH 值测量结果（图 2C）。结果同样显示，每个培养物内部的 pH 值测量结果具有一致性，但不同类器官品系之间存在显著差异。然而，腔内 pH 值总体保持在 pH 7.3 至 pH 8.2 范围内，相差不超过一个数量级，并且在比较早期与晚期传代时，并未观察到平均 pH 值的明显变化趋势（图 2C）。接下来，我们探讨了类器官腔内的 pH 值是否直接取决于类器官扩增培养基和细胞外基质（ECM）的 pH 值。对培养基、包围类器官的 ECM 以及类器官腔内环境之间的 pH 值进行比较后发现，三者之间存在显著差异：类器官腔内 pH 值低于 ECM 的 pH 值，而 ECM 的 pH 值又低于周围类器官扩增培养基的 pH 值（图 2D），这表明类器官腔内 pH 值具有生理相关性，而非直接由培养环境决定。在六次独立实验中，我们测得的平均腔内 pH 值接近中性，为 7.13 ± 0.09。
使用电动显微操作器对类器官腔内的pH值进行测量，可获得更高的空间分辨率。当需要记录充满黏液的类器官腔内pH值或其他梯度信息时，该方法尤为适用29。图2E展示了在大型类器官（直径 >1,000 µm）中进行的两组代表性pH测量序列，显示了进入类器官的起始点，并持续至约800 µm深度。由于所检测的两个类器官直径不同，其测量结果不能直接比较。尽管如此，我们仍观察到从上皮表面至类器官腔更深处存在轻微的pH梯度，ΔpH为0.6（图2E）。为了评估在一段时间内对类器官进行连续pH测量的可行性（从而实现实时监测处理干预后的响应），我们对一个代表性类器官内部的腔内pH值持续记录约20分钟，结果发现，在初始适应期后，读数保持高度稳定（图2F）。为利用独立方法验证腔内pH测量结果，我们采用了一种pH敏感的比色染料（甲基红），并通过安装在显微操作器上的纳升级自动注射仪将其注入类器官腔内（图2G）。染料呈现黄色，证实类器官腔内pH >6.2，这与微电极测量结果中显示的接近中性pH值一致。总体而言，这些代表性结果表明，基于微电极的pH测量在类器官培养体系中具有可行性与可重复性。
<img alt="使用微电极装置测量类器官的pH值，示意图及显微镜图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：方法概述。（A）检测装置的示意图。图1A中的微电极图像取自Unisense网站。36（B）可用于检测的类器官培养物代表性图像，显示周围的细胞外基质（ECM）及培养基（比例尺 = 5 mm）。（C）微电极正确放置位置示例，为类器官检测做准备（比例尺 = 500 µm）。缩写：ECM = extracellular matrix（细胞外基质）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官pH分析示意图；图A-F比较了不同条件下的pH值；G显示pH颜色标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：人胃类器官中微传感器检测的验证。（A）使用25 µm（pH-25）和50 µm（pH-50）微电极尖端进行中腔pH值测量的比较。数据来自10个独立类器官，每个类器官来自一次代表性实验。（B）对10个独立类器官进行三次重复pH值测量。单因素方差分析结合多重比较（p = 0.1229）。（C）使用pH-25电极在不同传代次数下分析的五个类器官系中，pH值测量结果具有一致性；每个类器官系根据大小和可获得性测量了4–10个类器官。单因素方差分析结合多重比较（p &lt; 0.0001）。（D）胃类器官内部、周围Matrigel及培养基中的pH值测量（n = 6次独立实验）。通过将pH-25电极插入胃上皮类器官获得测量值。每个数据点代表单个类器官内10次独立pH值测量的平均值。单因素方差分析（p &lt; 0.0001）。（E）使用电动显微操作器获得的两个代表性类器官的上皮至腔内pH分布曲线。（F）一个代表性类器官中pH值随时间的稳定性（约19.8分钟）。（G）向胃类器官腔内显微注射甲基红pH指示染料和HCl。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">供体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>图</td>
			<td>细胞系</td>
			<td>传代次数</td>
			<td>性别</td>
			<td>年龄</td>
			<td>种族</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2A</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2B</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>未知</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">未知</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">未知</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2E</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>未知</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2F</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2G</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">人胃类器官扩增培养基（L-WRN）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN 条件培养基</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>两性霉素 B</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 缓冲液</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2.
补充图 S1：人胃类器官中的离子转运体表达。 相对拷贝数经 18S rRNA 标准化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 S2：使用 pH 微传感器探针穿刺后结构变形的人胃类器官。 比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S1：胃类器官培养物中一次失败的检测尝试。 将25 µm的pH微电极手动推进至目标类器官。由于角度判断失误导致初次尝试失败后，操作者调整角度再次尝试，结果发现该类器官缺乏足够的结构完整性以进行检测（球形结构不够稳固，在电极穿刺时发生变形）。随后，操作者转向尝试另一个类器官。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本实验方案描述了利用微电极对人组织来源的胃类器官进行pH值测量，以实现对管腔内生理活动的时空表征。

利用微电极对三维胃肠道类器官中的管腔pH进行表征

胃肠道类器官模型的优化与详细表征需要先进的方法来分析其管腔环境。这一……

我们研究的总体目标是了解胃上皮细胞、免疫细胞、基质细胞及其产物（如细胞因子和黏液）如何协同作用以应对胃部病原体幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的感染。为此，我们正致力于构建复杂且具有生理相关性的人胃黏膜模型。以往关于胃类器官的研究在这些模型能否维持产酸的壁细胞方面得出了相互矛盾的结果。利用pH微电极，我们证明了在没有特定分化或刺激方案的情况下，人胃类器官的腔内维持接近中性的pH值。由于类器官腔内相对难以接近，长期以来限制了我们对其内部微环境的理解。我们实现了首次成功的微电极pH测量，用于类器官的功能表征。我们基于微电极的方法可为研究人员提供一种可靠的工具，并可根据其特定需求进行调整。迄今为止，胃肠道类器官内的 pH 值测量依赖于使用对 pH 敏感的染料，并通过显微成像进行定量。使用微电极的主要优势在于其能够提供准确的数值型 pH 读数。此外，管腔内 pH 值可以实时记录，并具有更高的空间分辨率。我们正在致力于构建一个具有生理 pH 梯度的、功能完整的人类胃黏液层模型，以便研究该屏障在幽门螺杆菌感染中的作用。最终目标是开发新的细胞保护治疗方法，以增强黏液层并防止细菌侵入。首先，获取直径在200至700微米之间、处于活跃生长状态的人胃类器官。将细胞外基质（ECM）分装样品置于冰上解冻至少45分钟，并将细胞培养板在37°C、5%二氧化碳培养箱中预热。从培养板孔中移除培养基后，用预冷的PBS滴加至每个ECM液滴中，并用P1000移液器吸头轻轻刮擦凝胶。将含有类器官的PBS及细胞外基质碎片收集到15毫升锥形管中。在4摄氏度下以200 g离心5分钟。吸除上清液后，向每根试管中加入350微升0.25%胰蛋白酶-EDTA，并轻轻混匀。将试管置于37摄氏度的水浴中孵育2至5分钟。向每支试管中加入600 µL冰冻的、添加青霉素和链霉素的DMEM，剧烈吹打40次。按演示方法离心试管，并将细胞沉淀重悬于冰冻的液态ECM中。每个样本中，将含有类器官碎片的40微升液态ECM沿35毫米玻璃底培养皿的直径方向，以细线状接种。孵育15至30分钟后，沿培养皿边缘小心加入2毫升类器官扩增培养基，避免扰动已聚合的凝胶。取先前制备的人胃类器官用于pH分析。首先，通过连接器将参比电极连接到pH电极电缆上。然后将微电极连接至放大器，并通过USB线缆将放大器连接至接地的计算机及其配套软件。将微电极和参比电极置于去离子水中，确保两个电极的尖端均浸入液面以下至少一厘米。用所需的校准缓冲液填充50毫升锥形管。使用精密实验室擦拭纸轻轻吸去保护套管及参比电极上的液体。打开软件后，在“校准”选项卡下选择Y轴缩放框，然后将传感器信号读数设置为毫伏。将电极置于 pH 4.01 缓冲液中，输入已知 pH 值 4.01。待毫伏读数稳定后，选择“添加点”。然后将两个电极重新放入去离子水中进行冲洗。重复 pH 9.21 缓冲液的操作后，当信号稳定在约 83 毫伏时，单击“添加点”。检查微电极在 pH 4.01 和 9.21 之间是否呈现线性响应，以获得两点校准曲线。将保护套平放在实验台上，迅速而快捷地将其拉下，取下微电极。将微电极安装在显微操作器上，并调整体视显微镜和显微操作器的位置，使微电极能够自由地向培养皿推进。放置含有待分析类器官的培养皿。将参比电极轻轻固定在体视显微镜左侧铁架台的夹子上。目视推进微电极尖端，直至其充分浸入培养基中。待信号稳定后，记录培养基的三个pH读数。随后缓慢将微电极推进至细胞外基质（ECM）中，注意不要触碰到任何类器官。记录至少三个 pH 读数以计算平均值。将微电极沿垂直于类器官表面的轴线放置，轻轻在类器官基底外侧表面形成微小压痕，但不穿透表面。小心推进微电极进入类器官内部，测量管腔内的 pH 值。完成后，继续测量下一个类器官的 pH 值。将需要清洗的电极放回其保护管中。依次用去离子水、乙醇和缓冲液冲洗电极。将参比电极放入盛有3摩尔氯化钾溶液的烧杯中。用无菌矿物油反向填充一支2微升玻璃毛细管，并将其安装到由显微操作仪控制的纳升级自动注射器上。最后，用含有0.02%甲基红和150毫摩尔盐酸的溶液填充毛细管，并注入9.2纳升该溶液。在同一培养板上的10个类器官中，管腔pH值的变化极小，测量值 consistently 约为8.16。在五个不同类器官品系中，每个培养体系内的管腔内pH值均保持一致，但在不同类器官品系之间观察到显著差异。类器官管腔pH值 consistently 低于细胞外基质（ECMs）的pH值，而后者又低于培养基的pH值，这表明管腔pH值具有生理相关性，并非 solely 由周围培养环境决定。将甲基红注入类器官腔内，证实其pH值大于6.2，与微电极测量结果一致，表明pH接近中性。

profiling-luminal-ph-three-dimensional-gastrointestinal-organoids

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

使用微电极分析三维胃肠道类器官中的管腔 pH 值

在三维（3-D）环境中生长的细胞相较于在二维（2-D）环境中培养的细胞具有显著改进例如，培养瓶或培养皿）。本文描述了一种在旋转壁式生物反应器（RWV）提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。...

在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。...

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

为了研究疼痛性神经病变（PN）中伤害性表皮内神经纤维（IENFs）的变化，我们建立了可直接观察伤害性IENFs三维形态变化的实验方案。对IENFs进行三维分析，有望评估PN中IENF的形态学改变。...

人类皮肤活检样本中伤害性表皮内神经纤维的三维成像

学习使用微电极技术测量人胃类器官管腔内pH值的方法，实现实时精准监测。该技术可揭示幽门螺杆菌感染期间胃上皮细胞的生理反应，为开发新型细胞保护治疗策略提供可靠工具。

利用微电极对三维胃肠道类器官中的管腔pH进行表征

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