利用微电极对三维胃肠道类器官中的管腔pH进行表征

我们研究的总体目标是了解胃上皮细胞、免疫细胞、基质细胞及其产物（如细胞因子和黏液）如何协同作用以应对胃部病原体幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的感染。为此，我们正致力于构建复杂且具有生理相关性的人胃黏膜模型。以往关于胃类器官的研究在这些模型能否维持产酸的壁细胞方面得出了相互矛盾的结果。

利用pH微电极，我们证明了在没有特定分化或刺激方案的情况下，人胃类器官的腔内维持接近中性的pH值。由于类器官腔内相对难以接近，长期以来限制了我们对其内部微环境的理解。我们实现了首次成功的微电极pH测量，用于类器官的功能表征。

我们基于微电极的方法可为研究人员提供一种可靠的工具，并可根据其特定需求进行调整。迄今为止，胃肠道类器官内的 pH 值测量依赖于使用对 pH 敏感的染料，并通过显微成像进行定量。使用微电极的主要优势在于其能够提供准确的数值型 pH 读数。

此外，管腔内 pH 值可以实时记录，并具有更高的空间分辨率。我们正在致力于构建一个具有生理 pH 梯度的、功能完整的人类胃黏液层模型，以便研究该屏障在幽门螺杆菌感染中的作用。最终目标是开发新的细胞保护治疗方法，以增强黏液层并防止细菌侵入。

首先，获取直径在200至700微米之间、处于活跃生长状态的人胃类器官。将细胞外基质（ECM）分装样品置于冰上解冻至少45分钟，并将细胞培养板在37°C、5%二氧化碳培养箱中预热。从培养板孔中移除培养基后，用预冷的PBS滴加至每个ECM液滴中，并用P1000移液器吸头轻轻刮擦凝胶。

将含有类器官的PBS及细胞外基质碎片收集到15毫升锥形管中。在4摄氏度下以200 g离心5分钟。吸除上清液后，向每根试管中加入350微升0.25%胰蛋白酶-EDTA，并轻轻混匀。

将试管置于37摄氏度的水浴中孵育2至5分钟。向每支试管中加入600 µL冰冻的、添加青霉素和链霉素的DMEM，剧烈吹打40次。按演示方法离心试管，并将细胞沉淀重悬于冰冻的液态ECM中。

每个样本中，将含有类器官碎片的40微升液态ECM沿35毫米玻璃底培养皿的直径方向，以细线状接种。孵育15至30分钟后，沿培养皿边缘小心加入2毫升类器官扩增培养基，避免扰动已聚合的凝胶。取先前制备的人胃类器官用于pH分析。

首先，通过连接器将参比电极连接到pH电极电缆上。然后将微电极连接至放大器，并通过USB线缆将放大器连接至接地的计算机及其配套软件。将微电极和参比电极置于去离子水中，确保两个电极的尖端均浸入液面以下至少一厘米。

用所需的校准缓冲液填充50毫升锥形管。使用精密实验室擦拭纸轻轻吸去保护套管及参比电极上的液体。打开软件后，在“校准”选项卡下选择Y轴缩放框，然后将传感器信号读数设置为毫伏。

将电极置于 pH 4.01 缓冲液中，输入已知 pH 值 4.01。待毫伏读数稳定后，选择“添加点”。然后将两个电极重新放入去离子水中进行冲洗。

重复 pH 9.21 缓冲液的操作后，当信号稳定在约 83 毫伏时，单击“添加点”。检查微电极在 pH 4.01 和 9.21 之间是否呈现线性响应，以获得两点校准曲线。将保护套平放在实验台上，迅速而快捷地将其拉下，取下微电极。

将微电极安装在显微操作器上，并调整体视显微镜和显微操作器的位置，使微电极能够自由地向培养皿推进。放置含有待分析类器官的培养皿。将参比电极轻轻固定在体视显微镜左侧铁架台的夹子上。

目视推进微电极尖端，直至其充分浸入培养基中。待信号稳定后，记录培养基的三个pH读数。随后缓慢将微电极推进至细胞外基质（ECM）中，注意不要触碰到任何类器官。

记录至少三个 pH 读数以计算平均值。将微电极沿垂直于类器官表面的轴线放置，轻轻在类器官基底外侧表面形成微小压痕，但不穿透表面。小心推进微电极进入类器官内部，测量管腔内的 pH 值。

完成后，继续测量下一个类器官的 pH 值。将需要清洗的电极放回其保护管中。依次用去离子水、乙醇和缓冲液冲洗电极。

将参比电极放入盛有3摩尔氯化钾溶液的烧杯中。用无菌矿物油反向填充一支2微升玻璃毛细管，并将其安装到由显微操作仪控制的纳升级自动注射器上。最后，用含有0.02%甲基红和150毫摩尔盐酸的溶液填充毛细管，并注入9.2纳升该溶液。

在同一培养板上的10个类器官中，管腔pH值的变化极小，测量值 consistently 约为8.16。在五个不同类器官品系中，每个培养体系内的管腔内pH值均保持一致，但在不同类器官品系之间观察到显著差异。类器官管腔pH值 consistently 低于细胞外基质（ECMs）的pH值，而后者又低于培养基的pH值，这表明管腔pH值具有生理相关性，并非 solely 由周围培养环境决定。

将甲基红注入类器官腔内，证实其pH值大于6.2，与微电极测量结果一致，表明pH接近中性。