通过流式细胞术检测细胞焦亡

我们研究团队的目标是确定禽类细胞是否会发生类似于哺乳动物细胞的细胞焦亡。此外，我们还致力于通过更精确且更简便的方法来检测细胞焦亡。由于禽类物种的许多基因与哺乳动物存在显著差异，因此在禽类细胞死亡研究中，难以使用通常适用于哺乳动物细胞研究的那些基因区域。

因此，禽类细胞死亡的研究比人类或小鼠细胞的研究困难得多。我们利用胃源性片段诱导形成的细胞焦亡特征性细胞膜孔道及焦亡样细胞，建立了一种基于流式细胞术的检测程序，用于焦亡的鉴定。通过这一新方法，我们观察到了传染性法氏囊病病毒诱导的禽类细胞焦亡过程。

与以往的方法（如Western blot或AFA酸检测）不同，本方案能够通过两个参数同时准确量化发生细胞焦亡的细胞百分比，即细胞膜孔道的形成和细胞膜的破裂，从而有效区分焦亡细胞与其他形式的细胞死亡。首先，在六孔板中每孔接种5 × 10⁵个DF1细胞，每孔加入含10% FBS的DMEM培养基进行培养。

当细胞达到80%融合度时，弃去含血清的细胞培养基。用PBS洗涤细胞三次后，每孔加入2毫升无血清细胞培养基，并在病毒吸附1小时后加入IBDV病毒溶液。用PBS洗涤细胞3次，随后加入含2% FBS的DMEM培养基2毫升，继续培养24小时。

每孔加入 500 微升胰蛋白酶，一分钟后加入含 10% FBS 的 2 毫升 DMEM。离心细胞并小心吸去上清液。用 PBS 重悬细胞沉淀后，轻轻涡旋混匀 3 秒钟，然后按前述方法离心细胞。

在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后将其重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中，并涡旋混匀。取100微升单细胞悬液加入到5毫升圆底聚苯乙烯管中。将IBDV感染的细胞和模拟对照细胞与1微克相应的抗体在冰上避光孵育30分钟，每10分钟轻轻涡旋混匀一次。

用一毫升流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞，离心试管。弃去上清液后，将沉淀重悬于100微升流式细胞术染色缓冲液中，然后在避光条件下于室温孵育10分钟，加入终浓度为10微克/毫升的碘化丙啶，随后添加400微升流式细胞术染色缓冲液用于流式细胞术检测。先运行空白对照管，再依次运行单染管，以调整电压和补偿参数，然后检测所有样本。

流式细胞术结果显示，在感染传染性法氏囊病毒（IBDV）后，有相当数量的细胞对鸡Gasdermin E的N端片段呈阳性，而使用细胞膜表面抗原染色法通过流式细胞术几乎无法检测到切割后的鸡Gasdermin E的C端片段。感染IBDV的细胞中，同时对鸡Gasdermin E的N端片段和碘化丙啶呈阳性的细胞群体显著多于模拟感染的对照组，表明这部分感染IBDV的细胞正在发生焦亡。