Name: 流式细胞术检查细胞焦亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: 学习利用流式细胞术检测禽类细胞焦亡的方法，通过抗鸡GSDME-N端抗体与碘化丙啶双重染色，准确识别传染性法氏囊病诱导的细胞焦亡，为鸟类细胞死亡机制研究提供可靠技术手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢刘珏博士的大力协助。本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFD1800300）、国家自然科学基金（编号：32130105）以及现代农业产业技术体系专项资金（编号：CARS-40）的资助。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 样品细胞的制备
<ol>
	<li>在六孔板中培养DF-1（永生化鸡胚成纤维细胞）细胞（每孔5 × 105个细胞），使用添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于38 °C、5% CO2培养箱中培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，弃去含血清的细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，然后每孔加入2 mL无血清细胞培养基。</li>
	<li>向每孔加入IBDV病毒液（含计算好的MOI），设置模拟感染对照组，加入与病毒液体积相等的DMEM培养基。</li>
	<li>病毒吸附1小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞三次，每孔加入2 mL添加2% FBS的DMEM，继续培养24小时。</li>
	<li>IBDV感染后24小时，进行胰蛋白酶处理（每孔500 µL，1分钟），随后用含10% FBS的DMEM（每孔2 mL）中和。之后收集细胞，制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。</li>
	<li>在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用PBS重悬细胞沉淀，并轻轻涡旋振荡管子3秒。</li>
	<li>按照步骤1.6所述条件（400 × g，2–8 °C，离心5分钟）再次离心细胞。</li>
	<li>重复步骤1.7和1.8所述的细胞洗涤操作。</li>
	<li>在显微镜下使用血细胞计数板进行细胞计数。然后将细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中（使最终细胞浓度为1 × 107个细胞/mL），并轻轻涡旋混匀悬液。</li>
</ol>
2. 流式细胞术的细胞染色
<ol>
	<li>将步骤1.10中获得的单细胞悬液各100 µL加入5 mL圆底聚苯乙烯管（12 mm × 75 mm）中。为抗-chGSDME-NT/CT 抗体染色准备模拟感染和IBDV感染的细胞，并以正常小鼠IgG作为同型对照。同时，使用IBDV感染的细胞制备空白对照管和单染管。</li>
	<li>分别向IBDV感染管和模拟对照管中加入1 µg Alexa Fluor 647标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体、抗-chGSDME-CT 单克隆抗体或正常小鼠IgG（作为同型对照）。随后，轻轻涡旋振荡管子3秒。</li>
	<li>将染色后的细胞在2–8 °C或冰上避光孵育30分钟。每10分钟轻轻涡旋振荡一次。</li>
	<li>用1 mL流式细胞术染色缓冲液重悬细胞，于2–8 °C以400 × g 离心5分钟进行洗涤。用移液器弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤2.4所述的细胞洗涤操作。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于100 µL流式细胞术染色缓冲液中。</li>
	<li>用10 µg/mL的碘化丙啶（PI）对IBDV感染组、模拟感染组以及PI单染管的细胞在室温下染色10分钟，随后加入400 µL流式细胞术染色缓冲液，用于流式细胞术检测。</li>
</ol>
3. 进行流式细胞术检测
<ol>
	<li>启动流式细胞仪以初始化仪器并打开软件。</li>
	<li>首先运行空白对照管，随后运行单染管，以调整流式细胞仪的电压和补偿参数。使用在 635 nm 处发射的 FL3 和 FL4 荧光通道，分别检测 PI 和 Alexa Fluor 647 荧光染料。</li>
	<li>完成所有参数设置后，依次运行所有样品。</li>
</ol>
4. 流式细胞术数据分析
<ol>
	<li>在FL4通道直方图中分析每个样本的Alexa Fluor 647染色情况。</li>
	<li>为评估每个样本中双阳性细胞的比例，使用FL3/FL4的四象限点图。</li>
	<li>根据同型对照IgG/PI双染样本设定阳性阈值，确保双阳性细胞比例低于1%。该方法有助于测量所有样本中双阳性细胞的比例。</li>
</ol>

Quantifying Pyroptosis in Infectious Bursal Disease Virus-Infected DF-1 Cells

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用流式细胞术检测焦亡的有效方法，该方法通过对感染细胞进行Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT 单克隆抗体与PI的双重染色实现。该方法还可应用于多种细胞类型，以区分焦亡与其他类型的细胞死亡，如凋亡和坏死。
焦亡，一种炎症性程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中由GSDMD介导的细胞膜孔道形成1,2,3，传统上通过LDH释放等方法进行评估6,15，形态特征16，以及 GSDM- 的检测NT/GSDM-计算机断层扫描 片段 通过 Western Blot 或 IFA 检测17然而，这些方法均无法准确量化发生焦亡的细胞百分比。本研究利用焦亡细胞中由GSDM形成的特征性细胞膜孔道NT 基于流式细胞术的片段检测策略开发。
当细胞用 chGSDME 进行双重染色时NT-使用Alexa Fluor 647和PI染色后进行分析 通过 在FL3和FL4荧光通道的流式细胞术检测中，可观察到细胞焦亡现象 通过 两个参数同时：chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 染色显示剪切后chGSDME的N端片段诱导细胞膜孔道形成，PI染色显示细胞膜破裂。数据表明，chGSDME-NTIBDV 感染细胞中 PI 双阳性细胞的比例（约 33%）显著高于模拟感染对照组P &#60; 0.001).
实验方法需要考虑多个因素，以确保准确性和可靠性。首先，用于流式分析的每管样品应包含不少于 1 × 106 个细胞，以维持流式分析的精确性。鉴于实验方案中包含多个洗涤步骤，建议在步骤 2.1 中相应增加每管的初始细胞数量，例如增至 2 × 106 个细胞。在细胞洗涤和转移过程中必须格外小心，避免无意中破坏细胞完整性。此外，需注意细胞密度、抗体浓度以及操作时间均可能影响最佳参数设置。因此，必须根据具体的实验条件调整流式细胞仪的参数和设置。本研究中使用的参数如下：FSC AmpGain 设置为 1.40，SSC 电压设置为 490 V。在 FSC/SSC 图中设门以涵盖所有细胞群体，用于后续 FL3/4 通道分析。荧光电压设置为 FL3 通道（PI）600 V，FL4 通道（Alexa Fluor 647）600 V。FL4 与 FL3 通道之间的补偿设置为 38.0%。流速设置为 200 事件/秒，事件阈值设为 10,000。
借助这一新方法，人们对GSDME介导的细胞焦亡在鸡体应对病原感染中的作用及其潜在机制的理解已取得显著进展。通过使用特异性抗体，我们能够利用流式细胞术检测成孔的chGSDME-NT，从而区分焦亡细胞与其他细胞，并有助于确定发生焦亡的细胞比例。因此，该方法在检测焦亡细胞方面相较于Western Blot或IFA检测具有明显优势。
然而，该实验方案的局限性在于使用鸡GSDME的N端片段在IBDV感染的细胞中作为研究细胞焦亡的实验模型。尽管如此，本研究首次成功地利用流式细胞术检测细胞焦亡。
综上所述，本文所述用于检测焦亡的流式细胞术在推动我们理解哺乳动物和鸟类焦亡机制方面具有巨大潜力。该方法是一种有效的工具，有助于生命科学领域中细胞死亡的研究。

焦亡是一种炎症性的程序性细胞死亡，主要依赖于哺乳动物中Gasdermin（GSDM）D在细胞膜上形成孔道1,2,3。由于鸡缺乏GSDMD基因4,5，鸡体内焦亡的机制仍不清楚。Gasdermin家族包含一系列保守蛋白，如GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB593,6。已有研究报道，来自硬骨鱼类和鸭子的GSDME可被caspase-1/3/7或caspase-3/7切割，从而诱导焦亡性细胞死亡7,8。然而，GSDME介导的焦亡在鸡抵抗病原体感染的宿主反应中的作用仍有待阐明。
传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高度传染性且具有免疫抑制性的家禽疾病9传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种无包膜的双链RNA病毒，基因组分为两个片段，属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）。10先前其他研究团队及本实验室的研究表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染可诱导宿主细胞发生细胞死亡 通过 不同的通路11,12,13,14先前的研究结果表明，传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染会引发乳酸脱氢酶（LDH）的释放，后者是溶细胞性细胞死亡的标志物6,15，表明IBDV感染可诱导宿主细胞发生裂解性细胞死亡。此外，数据还显示，IBDV感染的细胞表现出细胞焦亡的形态学特征，包括细胞肿胀、细胞膜表面形成大的泡状突起以及碘化丙啶（PI）染色阳性，提示IBDV感染可诱导细胞发生焦亡。
鉴于GSDM蛋白经切割后产生的N端片段（GSDM-NT）在焦亡细胞膜上形成孔道是焦亡的标志性特征，理论上可通过特异性抗体检测细胞膜上的GSDM-NT，利用流式细胞术来检测焦亡细胞。在禽类焦亡细胞中，鸡Gasdermin E蛋白的N端片段（chGSDME-NT）可在细胞膜上形成孔道，使碘化丙啶（PI）进入细胞并与DNA结合。因此，可通过流式细胞术检测焦亡细胞的比例，从而将焦亡与其他形式的细胞死亡（如凋亡和坏死）区分开来。然而，目前尚未见报道利用流式细胞术检测焦亡细胞的方法。本研究中，将DF-1细胞感染传染性法氏囊病毒（IBDV）后，采用针对chGSDME-NT片段（膜结合形式）的单克隆抗体（McAb）并结合PI染色，通过流式细胞术检测焦亡细胞。出乎意料的是，流式细胞术能够有效检测到焦亡细胞，且可对焦亡细胞的比例进行定量分析。这些发现为焦亡的判定提供了一种强大而有效的方法。
本文介绍了一种利用抗chGSDME-NT 单克隆抗体和PI染色，通过流式细胞术检测IBDV感染细胞中细胞焦亡的方法。该方法还可拓展至其他病原体感染的细胞，适用于检测发生焦亡的各种细胞类型，并将其与其他形式的细胞死亡区分开来。

<table><tbody><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管（12 &amp;times; 75 毫米</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>康宁</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>抗chGSDME-CT单克隆抗体</td><td>中国中山 SAE 生物医学技术公司</td><td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>抗chGSDME-NT单克隆抗体</td><td>中国中山SAE生物医学技术有限公司</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>CellQuest 软件</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）&amp;nbsp;</td><td>Gibco（隶属于 Life Technologies）</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术染色缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>邱井生化试剂 &amp;安普&仪器公司（中国上海）</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx 毒株</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx 毒株由位于中国北京的北京市农林科学院刘珏博士惠赠</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>重庆光电仪器公司</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>M&amp;和C&amp;nbsp; 基因技术</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>M&amp;与&amp;nbsp; 基因技术</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术检测细胞焦亡

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

焦亡是一种由炎性介导的程序性细胞死亡，主要由Gasdermin（GSDM）家族蛋白经切割后产生的N端片段在细胞膜上形成孔道所驱动。通过Western Blot检测膜结合型GSDM-NT是评估焦亡最常用的方法。然而，该方法难以区分发生焦亡的细胞与其他形式的细胞死亡。在本研究中，采用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染的DF-1细胞作为模型，利用针对鸡GSDME N端片段（chGSDME-NT）的特异性抗体结合碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术定量分析发生焦亡的细胞比例。使用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT抗体，可通过流式细胞术清晰检测到chGSDME-NT阳性的细胞。此外，IBDV感染细胞中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P &#60; 0.001）。这些结果表明，通过流式细胞术检测膜结合型chGSDME-NT是鉴定细胞死亡过程中焦亡细胞的有效方法。

chGSDME-NT 在IBDV感染的DF-1细胞膜上可 readily 通过流式细胞术检测到 
细胞焦亡最重要的特征之一是GSDM介导的细胞膜孔道形成NT 由Gasdermin切割产生的片段。因此，理论上可通过流式细胞术检测焦亡细胞 通过 检测GSDM-NT 使用特异性抗体检测细胞膜上的变化。因此，用传染性法氏囊病毒（IBDV）感染DF-1细胞，并通过流式细胞术检测焦亡细胞，所用抗体为Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME抗体。NT McAb 和 PI 染色。有相当数量的 chGSDME-NT 感染IBDV后通过流式细胞术检测到阳性细胞（图1）。相比之下，模拟感染的对照组或使用同型对照IgG染色的细胞中，Alexa Fluor 647阳性细胞极少。这些结果表明，膜结合型chGSDME可被有效且特异性地检测到NT 通过流式细胞术。值得注意的是，裂解后的chGSDME的C端片段（chGSDME-计算机断层扫描) 保留在细胞质内，而未像 chGSDME 那样转位至质膜NTchGSDME-计算机断层扫描 通过膜表面抗原染色的流式细胞术检测，仅能勉强观察到碎片，这与焦亡与膜结合型chGSDME相关这一事实一致。NT 片段
通过使用荧光素标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体与碘化丙啶（PI）对DF-1细胞进行双重染色，并结合流式细胞术可检测细胞焦亡的发生 
当细胞经Alexa Fluor 647标记的抗-chGSDME-NT 单克隆抗体和PI双重染色后，在FL3和FL4荧光通道进行流式细胞术分析时，焦亡细胞可通过chGSDME-NT 和PI双阳性染色进行判定。如图2A、B所示，流式细胞术检测到感染传染性法氏囊病毒（IBDV）的细胞中存在大量chGSDME-NT 阳性细胞，且IBDV感染组中chGSDME-NT/PI双阳性细胞的比例（约33%）显著高于模拟感染对照组（P &lt; 0.001），表明chGSDME-NT 形成的膜孔与细胞膜破裂同步发生，从而导致这些IBDV感染的细胞发生焦亡性死亡。这些结果明确表明，IBDV感染可诱导宿主细胞发生chGSDME介导的细胞焦亡。而仅PI阳性的细胞可能代表IBDV感染诱导的其他形式的细胞死亡。因此，通过流式细胞术检测成孔型chGSDME-NT 的表达，为区分焦亡细胞与其他类型死亡细胞提供了一种有效的方法。
<img alt="流式细胞术结果，Alexa Fluor 647 染色细胞的直方图，抗体比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过流式细胞术检测 chGSDME-NT 结合细胞。DF-1 细胞经模拟感染或以 MOI 为 1 的 IBDV 进行感染。感染后 24 小时，收集细胞并用 Alexa Fluor 647 标记的抗 chGSDME-NT/抗 chGSDME-CT 单克隆抗体或同型对照 IgG 染色，随后进行流式细胞术分析。流式细胞术检测到 chGSDME-NT 染色阳性，表明 IBDV 诱导焦亡过程中存在膜结合型 chGSDME-NT 的细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、细胞焦亡检测、图表与散点图、chGSDME、IBDV。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过chGSDME-NT 与PI双染色结合流式细胞术检测细胞焦亡。（A）采用流式细胞术对焦亡细胞进行散点图分析。DF-1细胞以MOI为1的剂量感染IBDV，感染后24小时收集细胞，用Alexa Fluor 647标记的抗chGSDME-NT/抗chGSDME-CT单克隆抗体及PI染色，随后进行流式细胞术分析。（B）对（A）中各组焦亡细胞百分比进行绘图并进行统计分析。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）评估统计学差异。数据来自三次独立实验，以均值±标准差表示。***P &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了通过使用针对鸡GSDME的N端片段（chGSDME-NT）和碘化丙啶（PI）的抗体进行双重染色后，利用流式细胞术鉴定发生焦亡的细胞。

细胞焦亡是一种由程序性细胞死亡引发的炎症性细胞死亡，主要由N端生成的……在质膜上形成孔道所驱动。

我们研究团队的目标是确定禽类细胞是否会发生类似于哺乳动物细胞的细胞焦亡。此外，我们还致力于通过更精确且更简便的方法来检测细胞焦亡。由于禽类物种的许多基因与哺乳动物存在显著差异，因此在禽类细胞死亡研究中，难以使用通常适用于哺乳动物细胞研究的那些基因区域。因此，禽类细胞死亡的研究比人类或小鼠细胞的研究困难得多。我们利用胃源性片段诱导形成的细胞焦亡特征性细胞膜孔道及焦亡样细胞，建立了一种基于流式细胞术的检测程序，用于焦亡的鉴定。通过这一新方法，我们观察到了传染性法氏囊病病毒诱导的禽类细胞焦亡过程。与以往的方法（如Western blot或AFA酸检测）不同，本方案能够通过两个参数同时准确量化发生细胞焦亡的细胞百分比，即细胞膜孔道的形成和细胞膜的破裂，从而有效区分焦亡细胞与其他形式的细胞死亡。首先，在六孔板中每孔接种5 × 10⁵个DF1细胞，每孔加入含10% FBS的DMEM培养基进行培养。当细胞达到80%融合度时，弃去含血清的细胞培养基。用PBS洗涤细胞三次后，每孔加入2毫升无血清细胞培养基，并在病毒吸附1小时后加入IBDV病毒溶液。用PBS洗涤细胞3次，随后加入含2% FBS的DMEM培养基2毫升，继续培养24小时。每孔加入 500 微升胰蛋白酶，一分钟后加入含 10% FBS 的 2 毫升 DMEM。离心细胞并小心吸去上清液。用 PBS 重悬细胞沉淀后，轻轻涡旋混匀 3 秒钟，然后按前述方法离心细胞。在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后将其重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中，并涡旋混匀。取100微升单细胞悬液加入到5毫升圆底聚苯乙烯管中。将IBDV感染的细胞和模拟对照细胞与1微克相应的抗体在冰上避光孵育30分钟，每10分钟轻轻涡旋混匀一次。用一毫升流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞，离心试管。弃去上清液后，将沉淀重悬于100微升流式细胞术染色缓冲液中，然后在避光条件下于室温孵育10分钟，加入终浓度为10微克/毫升的碘化丙啶，随后添加400微升流式细胞术染色缓冲液用于流式细胞术检测。先运行空白对照管，再依次运行单染管，以调整电压和补偿参数，然后检测所有样本。流式细胞术结果显示，在感染传染性法氏囊病毒（IBDV）后，有相当数量的细胞对鸡Gasdermin E的N端片段呈阳性，而使用细胞膜表面抗原染色法通过流式细胞术几乎无法检测到切割后的鸡Gasdermin E的C端片段。感染IBDV的细胞中，同时对鸡Gasdermin E的N端片段和碘化丙啶呈阳性的细胞群体显著多于模拟感染的对照组，表明这部分感染IBDV的细胞正在发生焦亡。

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

流式细胞术检查细胞焦亡

我们介绍一种基于流式细胞术的方法来检测T细胞发育 体内...

通过流式细胞术检测胸腺阳性与阴性选择

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G...

使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25...

II-45同系大鼠间皮瘤模型中的原位移植及外周免疫细胞监测

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

肺的健康状况可通过肺细支气管中存在的免疫细胞类型和数量来反映。本文介绍一种支气管肺泡灌洗技术，可用于分离和研究小鼠下呼吸道中的非黏附性细胞及可溶性因子。...

小鼠肺部支气管肺泡灌洗以分析炎性细胞浸润

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

细胞凋亡可通过流式细胞术分析早期和晚期凋亡生物标志物来表征。本研究使用台式流式细胞仪，检测经放线菌素D处理后宫颈癌细胞系SiHa的凋亡相关生物标志物。...

放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

本方案描述了一种将痰液高效解离为单细胞悬液的方法，以及在标准流式细胞术平台上对细胞亚群进行后续表征的技术。...

通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

脂质过氧化氢含量是衡量铁死亡最常见的指标。本文展示了在诱导铁死亡后，通过流式细胞术逐步分析细胞内脂质过氧化氢含量的操作流程。...

揭示髓母细胞瘤的铁死亡表型

学习利用流式细胞术检测禽类细胞焦亡的方法，通过抗鸡GSDME-N端抗体与碘化丙啶双重染色，准确识别传染性法氏囊病诱导的细胞焦亡，为鸟类细胞死亡机制研究提供可靠技术手段。

通过流式细胞术检测细胞焦亡

探索更多视频